專利名稱:構(gòu)建中小片段rna測序文庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法。
背景技術(shù)：
核糖核酸(縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。由至少幾十個核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸，因含核糖而得名，簡稱RNA。RNA普遍存在于動物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內(nèi)。RNA和蛋白質(zhì)生物合成有密切的關(guān)系。在RNA病毒和噬菌體內(nèi)，RNA是遺傳信息的載體。與DNA不同，RNA 一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，但是很多RNA也需要通過堿基配對原則形成一定的二級結(jié)構(gòu)乃至三級結(jié)構(gòu)來行使生物學(xué)功能。RNA的堿基配對規(guī)則基本和DNA相同，不過除了 A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。根據(jù)結(jié)構(gòu)功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA (轉(zhuǎn)運RNA)，rRNA (核糖體RNA)，mRNA (信使RNA)。mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板，內(nèi)容按照細(xì)胞核中的DNA所轉(zhuǎn)錄；tRNA是mRNA上堿基序列(即遺傳密碼子)的識別者和氨基酸的轉(zhuǎn)運者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質(zhì)合成的工作場所。
目前小片段RNA測序文庫的制備方法，主要有兩種:1.隨機(jī)引物法，該方法將RNA用隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后合成雙鏈的DNA，加上接頭，從而完成文庫的制備。該方法雖然簡單，但是在文庫制備的過程中，容易將小片段的RNA丟失；2.接頭連接法，該方法是將在去磷酸化RNA的3’端加上RNA接頭，對連接產(chǎn)物的5’端加上磷酸，加上5’端的RNA接頭，反轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增，從而完成文庫的制備。該方法操作繁瑣，而且必須保證RNA的5’端是磷酸基團(tuán)，從而方便RNA接頭的連接；該方法制備的文庫受限于目前測序讀長的局限，使得RNA的序列不能完全被測出。
公開號CN101377021A的發(fā)明，公開了一種構(gòu)建cDNA文庫的方法，其特點是簡單快速而且不需要核酸內(nèi)切酶。該方法的主要步驟包括:(1)以總RNA(或者M(jìn)RNA)為模板，利用引物通過反轉(zhuǎn)錄合成⑶NA第一條鏈。(2)利用這對引物通過TAQ DNA合成酶催化的PCR合成⑶NA第二條鏈。(3)將步 驟(2)得到的PCR產(chǎn)物通過DNA連接酶直接與T-載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，得到CDNA文庫。但該方法容易將小片段的RNA丟失，導(dǎo)致測序不完整。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服隨機(jī)引物法容易將小片段的RNA丟失以及接頭連接法受限測序讀長而使得RNA的序列不能完全被測出的問題，提供一種構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，本方法將大片段RNA用隨機(jī)引物法進(jìn)行文庫的制備，克服了接頭連接法受限測序讀長的問題，又將小片段RNA用類似接頭連接法且不需要保證RNA的5’端必須是磷酸基團(tuán)，進(jìn)行文庫的制備，保留了小片段RNA的信息，使得測序信息更加全面。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，所述的方法如下:[0008]樣品總RNA經(jīng)過電泳分離得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小為50nt ^ M1 < 150nt,所述的大片段RNA的分子量M2的大小為150nt ^ M2 ^ 500nt ；
一、小片段cDNA的制備
(I)用堿性磷酸酶對小片段RNA去磷酸化處理，去除小片段RNA兩端的磷酸基團(tuán)，去磷酸化的小片段RNA經(jīng)純化后得到小片段RNA純化物；
(2)用14 RNA連接酶將RNA接頭連接在小片段RNA純化物的3’端，連接產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化得分子量8(Tl80nt的RNA連接產(chǎn)物；
RNA接頭的序列如下:
5-p-AGAUCGGAAGAGCGGUUCAGCAGGAAUGCCGAG-NHR-3 (SEQ ID N0.1 所示)；
(3)以步驟(2)得到的RNA連接產(chǎn)物為模板，以與RNA接頭互補的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA鏈；
反轉(zhuǎn)錄引物序列如下:
5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3 (SEQ ID N0.2 所示)；
(4)用RNase A消化步驟(3)得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，消化后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化處理得分子量8(Tl80nt的cDNA片段；
(5)用T4 DNA連接酶將帶有突出端的雙鏈DNA接頭連接在步驟(4)純化的cDNA的3’端，連接產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化得到分子量IlOllOnt的小片段cDNA ；
帶有突出端的雙鏈DNA接頭序列信息如下:
正義鏈:5-p-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-NHR-3(SEQ ID N0.3 所示)；反義鏈:
5-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3 ；N=A 或 T 或 C 或 G (SEQ IDN0.4 N0.7 所示)；
二、大片段cDNA的制備
A、以大片段RNA為模板，以帶有6個隨機(jī)堿基的接頭為反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ；
帶有6個隨機(jī)堿基的接頭為反轉(zhuǎn)錄引物的序列信息如下:
5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3 ；N=A 或 T 或 C 或 G (SEQ IDN0.8 N0.11 所示)；
B、用氫氧化鈉消化步驟A的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，消化后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行離心純化得純化的cDNA ;離心純化使用Millipore公司YM-30離心超濾管；
C、用T4 DNA連接酶將帶有突出端的雙鏈DNA接頭連接在步驟B得到的純化的cDNA的3’端，連接產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化得到分子量15(T560nt的大片段cDNA ；
本步驟的帶有突出端的雙鏈DNA接頭序列信息同步驟(5)帶有突出端的雙鏈DNA接頭;
三、PCR擴(kuò)增
將步驟一得到的最終產(chǎn)物小片段cDNA和步驟二得到的最終產(chǎn)物大片段cDNA在PCR引物以及DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將小片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物和大片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物以等摩爾數(shù)進(jìn)行混合，混合產(chǎn)物即為中小片段RNA測序文庫。[0031]本發(fā)明中nt (Nucleotide)指代的是核苷酸的意思。
作為優(yōu)選，所述的電泳分離使用的電泳介質(zhì)為尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠。采用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高。
作為優(yōu)選，尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠中尿素的濃度為7 8mol/L?？刂茲舛仁购怂岬亩壗Y(jié)構(gòu)完全打開，有利于正確評估核酸的分子量大少。
作為優(yōu)選，尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠中聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為6 10%。聚丙烯酰胺凝膠濃度適合本方法所分離核酸的分子量。
作為優(yōu)選，步驟三中，PCR引物包括PCR前向引物和PCR反向引物。
PCR前向引物:
5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 (SEQ IDN0.12 所示)；
PCR反向引物:
5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3 (SEQID N0.13 所示)。
本發(fā)明的有益效果是:將大片段RNA用隨機(jī)引物法進(jìn)行文庫的制備，克服了接頭連接法受限測序讀長的問題，又將小片段RNA用類似接頭連接法且不需要保證RNA的5’端必須是磷酸基團(tuán)，進(jìn)行文庫的制備，保留了小片段RNA的信息，使得測序信息更加全面。


圖1是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
具體實施方式
下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
實施例:
本實施例中使用的英文縮寫代表的具體含義如下:
TBE =Tris硼酸EDTA緩沖液，PAGE:聚丙烯酰胺凝膠，TEMED:N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺，EtBr:溴化乙錠，CIAP:堿性磷酸酶，DMSO:二甲基亞砜，F(xiàn)S緩沖液:第一鏈合成緩沖液，DTT:二硫蘇糖醇。
TRIzol:是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶；TRIzol在破碎和溶解細(xì)胞時能保持RNA的完整性，因此對純化DNA及標(biāo)準(zhǔn)化RNA的生產(chǎn)十分有用。
一、凝膠分離大片段RNA和小片段RNA
1.凝膠分離大片段RNA和小片段RNA
1.1電泳裝置準(zhǔn)備
制備凝膠的玻片用無菌水洗滌2次，然后晾干。
用無菌水配置電泳緩沖液(I XTBE )。
1.2 6%尿素變性PAGE制備
1.2.1在50 ml離心管中依次加入以下試劑:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的雙蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%過硫酸銨溶液；7.5微升TEMED。迅速混勻，將液體倒入已經(jīng)架好的配膠玻片中，插上10孔的梳子，讓液體自身凝固15-30分鐘。
1.2.2將梳子從6%的尿素變性膠中拔出，用I X TBE沖洗膠孔。200伏下預(yù)跑6%尿素變性膠15-30分鐘，用IXTBE再次沖洗膠孔。
1.3樣品準(zhǔn)備
1.3.1從_80°C冰箱中取10微升總RNA樣品(約10微克，總RNA樣品來自線蟲-Caenorhabditis elegans)放置到冰上融化,加入等量的2X上樣緩沖液,在另外一個200微升潔凈的PCR管中加入4微升RNA分子量指示劑。
1.3.2在樣品上樣前在65°C下變性5分鐘，取出后冰浴2分鐘，然后離心使樣品甩到管底，隨后可以將樣品以及RNA分子量指示劑加入到不同的膠孔中。200伏下電泳30分鐘。
1.4割膠流程
1.4.1電泳之后，將凝膠在I X TBE/EtBr染色液中染色3分鐘。
1.4.2用干凈的刀片割取膠片大于等于50nt小于150nt區(qū)域的小片段RNA和150-500 nt區(qū)域的大片段RNA，然后將這些割下的膠片放到準(zhǔn)備好的收集管中。收集管是由大小兩個管子套在一起組成的，小管子是1.0 ml離心管，大管子為2.0 ml離心管，小管子底部事先扎好小孔。通過13000 rpm離心2分鐘，將小管子中的膠片離碎并被甩到2.0ml大管子中。
1.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后將管子在搖床上振蕩過夜。將洗脫物和凝膠碎片轉(zhuǎn)移到具有纖維素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm離心2分鐘，把洗脫物從凝膠碎片中離心出。加入1400微升無水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混勻后放置_80°C冰箱30分鐘。
1.4.4打開4°C離心機(jī)，4°C下13000 rpm離心25分鐘。小心的將上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗滌RNA沉淀。4°C下13000 rpm離心5分鐘，小心的將上清倒掉，讓剩余乙醇在空氣中揮發(fā)，然后用8微升的無核酶水溶解RNA。
二、小片段cDNA的制備
1.小片段RNA去磷酸化
1.1在200微升的PCR管中依次加入以下去磷酸化反應(yīng)試劑:8微升無核酶水；
2.0微升10 X CIAP緩沖液；8微升小片段RNA ；1.0微升RNA酶抑制劑；1.0微升CIAP (10U/ μ I)。
1.2熱循環(huán)儀上37°C孵育60分鐘
1.3 純化
1.3.1在反應(yīng)管中加入80微升無核酶水，使總體積達(dá)到100微升；
1.3.2加入83微升TRIzol和17微升氯仿；
1.3.3用手用力振蕩反應(yīng)管15秒,室溫靜置2分鐘；
1.3.4 在 40CT 12000 rcf 離心 15 分鐘；
1.3.5將水相液體轉(zhuǎn)移到新的管子中；
1.3.6依次加入420微升無水乙醇和2.5微升5 μ g/μ I糖原；
1.3.7混勻后-80°C靜置30分鐘；[0075]1.3.8 4°CT 14000 rpm 離心 25 分鐘；
1.3.9小心地棄去上清液；
1.3.10用750毫升75%乙醇洗滌沉淀；
1.3.11 40CT 14000 rpm 離心 5 分鐘；
1.3.12小心地棄去上清液；
1.3.13室溫放置使乙醇揮發(fā)；
1.3.14加入6微升無核酶水溶解RNA。
2.3’端RNA接頭連接
2.1在200微升PCR管中加入以下試劑:6微升CIAP處理的小片段RNA ;5微升3’ RNA接頭(5 μ M);2微升10XRNA連接緩沖液；4微升DMSO ；1微升RNA酶抑制劑(40 U/μ I) ;2 微升 T4RNA 連接酶(10 U/μ I)。
2.2以上混合物在20°C下孵育6小時。
3.割膠回收
3.1電泳裝置準(zhǔn)備
制備凝膠的玻片用無菌水洗滌2次，然后晾干。
用無菌水配置電泳緩沖液(I XTBE )。
3.2 6%尿素變性PAGE制備
3.2.1在50 ml離心管中依次加入以下試劑:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的雙蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%過硫酸銨溶液；7.5微升TEMED。迅速混勻，將液體倒入已經(jīng)架好的配膠玻片中，插上10孔的梳子，讓液體自身凝固15-30分鐘。
3.2.2將梳子從6%的尿素變性膠中拔出，用IXTBE沖洗膠孔。200伏下預(yù)跑6%尿素變性膠15-30分鐘，用IXTBE再次沖洗膠孔
3.3樣品準(zhǔn)備
3.3.1在20微升連接好的RNA中加入等量的2 X上樣緩沖液，在另外一個200微升潔凈的PCR管中加入4微升RNA分子量指示劑。
3.3.2在樣品上樣前在65°C下變性5分鐘，取出后冰浴2分鐘，然后離心使樣品甩到管底，隨后可以將樣品以及RNA分子量指示劑加入到不同的膠孔中。200伏下電泳30分鐘。
3.4割膠流程
3.4.1電泳之后，將凝膠在I X TBE/EtBr染色液中染色3分鐘。
3.4.2用干凈的刀片割取膠片80-180 nt區(qū)域的小片段RNA片段，然后將這些割下的膠片放到準(zhǔn)備好的收集管中。收集管是由大小兩個管子套在一起組成的，小管子是1.0ml離心管，大管子為2.0 ml離心管，小管子底部事先扎好小孔。通過13000 rpm離心2分鐘，將小管子中的膠片離碎并被甩到2.0 ml大管子中。
3.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后將管子在搖床上振蕩過夜。將洗脫物和凝膠碎片轉(zhuǎn)移到具有纖維素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分鐘離心，把洗脫物從凝膠碎片中離心出。加入1400微升無水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混勻后放置_80°C冰箱 30分鐘。[0099]3.4.4打開4°C離心機(jī)，4°C下13000 rpm離心25分鐘。小心的將上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗滌RNA沉淀。4°C下13000 rpm離心5分鐘，小心的將上清倒掉，讓剩余乙醇在空氣中揮發(fā)，然后用9微升的無核酶水溶解RNA。
4.反轉(zhuǎn)錄
4.1在200微升PCR管中加入以下反轉(zhuǎn)錄試劑:9微升已連接的小片段RNA ;1微升反轉(zhuǎn)錄引物(100 μΜ)ο
4.2 70°C孵育5分鐘，取出立即置于冰上。
4.3在之前200微升PCR管中加入以下試劑:4微升5XFS緩沖液，2微升DTT(0.1 mol/L)，2 微升 dNTP (10 mM)，I 微升 RNA 酶抑制劑。
4.4 25 O 孵育 2 分鐘。
4.5 加入 I 微升 super script III 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/ μ I)。
4.6在PCR儀上運行以下程序:50°C，60分鐘；70°C，15分鐘；4°C，保存。
5.RNA 酶 A 消化
5.1加入0.5微升RNA酶A至反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
5.2 37。。孵育 10 分鐘。
6.割膠回收cDNA
6.1.電泳裝置準(zhǔn) 備
制備凝膠的玻片用無菌水洗滌2次，然后晾干。
用無菌水配置電泳緩沖液(I XTBE )。
6.2.6%尿素變性PAGE制備
6.2.1在50 ml離心管中依次加入以下試劑:1020微升40%丙烯酰胺(19:1) ;3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的雙蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%過硫酸銨溶液；7.5微升TEMED。迅速混勻，將液體倒入已經(jīng)架好的配膠玻片中，插上10孔的梳子，讓液體自身凝固15-30分鐘。
6.2.2將梳子從6%的尿素變性膠中拔出，用IXTBE沖洗膠孔。200伏下預(yù)跑6%尿素變性膠15-30分鐘，用I X TBE再次沖洗膠孔
6.3.樣品準(zhǔn)備
6.3.1 20微升RT產(chǎn)物加入等量的2 X上樣緩沖液，在另外一個200微升潔凈的PCR管中加入4微升RNA分子量指示劑。
6.3.2在樣品上樣前在65°C下變性5分鐘，取出后冰浴2分鐘，然后離心使樣品甩到管底，隨后可以將樣品以及RNA分子量指示劑加入到不同的膠孔中。200伏下電泳30分鐘。
6.4.割膠流程
6.4.1電泳之后，將凝膠在I X TBE/EtBr染色液中染色3分鐘。
6.4.2用干凈的刀片割取膠片80-180 nt區(qū)域的cDNA片段，然后將這些割下的膠片放到準(zhǔn)備好的收集管中。收集管是由大小兩個管子套在一起組成的，小管子是1.0 ml離心管，大管子為2.0 ml離心管，小管子底部事先扎好小孔。通過13000 rpm離心2分鐘，將小管子中的膠片離碎并被甩到2.0 ml大管子中。
6.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中洗脫cDNA，然后將管子在搖床上振蕩過夜。將洗脫物和凝膠碎片轉(zhuǎn)移到具有纖維素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分鐘離心，把洗脫物從凝膠碎片中離心出。加入1400微升無水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混勻后放置-80°C冰箱30分鐘。
6.4.4預(yù)冷4°C離心機(jī)，4°C下13000 rpm離心25分鐘。小心的將上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗滌cDNA沉淀。4°C下13000 rpm離心5分鐘，小心的將上清倒掉，讓剩余乙醇在空氣中揮發(fā)，然后用15微升的無核酶水溶解cDNA。
7.連接
7.1在200微升PCR管中加入以下連接反應(yīng)試劑:15微升純化的cDNA;2微升5’DNA連接頭(10 μΜ);2微升含有10 mM ATP的10ΧΤ4 DNA連接緩沖液；I微升T4連接酶(400 U/μ I)。
7.2 16°C孵育 6 小時。
8.純化5’連接產(chǎn)物(即連接在cDNA 3’端的連接產(chǎn)物)
8.1電泳裝置準(zhǔn)備
制備凝膠的玻片用無菌水洗滌2次，然后晾干。
用無菌水配置電泳緩沖液(I XTBE )。
8.2 6%尿素變性PAGE制備
·[0133]8.2.1在50 ml離心管中依次加入以下試劑:1020微升40%丙烯酰胺(19:1 );3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的雙蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%過硫酸銨溶液；7.5微升TEMED。迅速混勻，將液體倒入已經(jīng)架好的配膠玻片中，插上10孔的梳子，讓液體自身凝固15-30分鐘。
8.2.2將梳子從6%的尿素變性膠中拔出，用I X TBE沖洗膠孔。200伏下預(yù)跑6%尿素變性膠15-30分鐘，用IXTBE再次沖洗膠孔
8.3樣品準(zhǔn)備
8.3.1在20微升連接好的cDNA加入等量的2 X上樣緩沖液，在另外一個200微升潔凈的PCR管中加入4微升RNA分子量指示劑。
8.3.2在樣品上樣前在65°C下變性5分鐘，取出后冰浴2分鐘，然后離心使樣品甩到管底，隨后可以將樣品以及RNA分子量指示劑加入到不同的膠孔中。200伏下電泳30分鐘。
8.4割膠流程
8.4.1電泳之后，將凝膠在I X TBE/EtBr染色液中染色3分鐘。
8.4.2用干凈的刀片割取膠片110-210 nt區(qū)域的片段，然后將這些割下的膠片放到準(zhǔn)備好的收集管中。收集管是由大小兩個管子套在一起組成的，小管子是1.0 ml離心管，大管子為2.0 ml離心管，小管子底部事先扎好小孔。通過13000 rpm 2分鐘的離心，將小管子中的膠片離碎并被甩到2.0 ml大管子中。
8.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后將管子在搖床上振蕩過夜。將洗脫物和凝膠碎片轉(zhuǎn)移到具有纖維素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分鐘離心，把洗脫物從凝膠碎片中離心出。加入1400微升無水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混勻后放置_80°C冰箱30分鐘。
8.4.4打開4°C離心機(jī)，4°C下13000 rpm離心25分鐘。小心的將上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗滌cDNA沉淀。4°C下13000 rpm離心5分鐘，小心的將上清倒掉，讓剩余乙醇在空氣中揮發(fā)，然后用15微升的無核酶水溶解cDNA。
三、大片段cDNA的制備
1.反轉(zhuǎn)錄
1.1在200微升PCR管中加入以下反轉(zhuǎn)錄試劑:8微升大片段RNA ;2微升帶有6個隨機(jī)堿基的接頭(10 μΜ)ο
1.2在70°C下孵育5分鐘后迅速放置冰上。
1.3之后再加入以下反應(yīng)試劑:4微升5XFS緩沖液；2微升DTT (0.1 M);2微升dNTP (10 mM) ;I 微升 RNA 酶抑制劑(40 U/μ I)。
1.4 25°C下孵育2分鐘。
1.5 加入 I 微升 SuperScript III 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/ μ I)。
1.6在熱循環(huán)儀上設(shè)定以下程序:25°C，10分鐘；44°C，60分鐘；70°C，15分鐘；4°C，保存。
2.cDNA 純化
2.1加入30微升無核酶水和8.75微升0.5M Na0H/50 mM EDTA停止反應(yīng)。
2.2短暫的渦旋，然后離心收集產(chǎn)物。
2.3 65°C 下孵育 30 分鐘。
2.4加入150微升無核酶水后將混合液轉(zhuǎn)移到Y(jié)M-30管中，13000 rpm離心12分鐘。
2.5再加入150微升無核酶水到Y(jié)M-30管中，13000 rpm離心6分鐘，重復(fù)一次。
2.6加入5微升無核酶水到Y(jié)M-30管中，將YM-30管倒置，10000 rpm離心2分鐘。
2.7加入無核酶水至15微升。
3.連接
3.1在200微升PCR管中加入以下反應(yīng)試劑:15微升純化的cDNA ；2微升5’DNA/DNA連接頭(10 μ M) ;2微升含有10 mM ATP的10 X T4 DNA連接緩沖液；I微升T4 DNA連接酶(400 U/μ I)。
3.2 16°C孵育 16 小時。
4.純化5’連接產(chǎn)物(即連接在cDNA 3’端的連接產(chǎn)物)
4.1電泳裝置準(zhǔn)備
制備凝膠的玻片用無菌水洗滌2次，然后晾干。
用無菌水配置電泳緩沖液(I XTBE )。
4.2 6%尿素變性PAGE制備
4.2.1在50 ml離心管中依次加入以下試劑:1020微升40%丙烯酰胺(19:1) ;3.6克尿素；1.5毫升5 X TBE ；2.48毫升的雙蒸水，37°C水浴直到尿素完全溶解，然后加入依次加入37.5微升10%過硫酸銨溶液；7.5微升TEMED。迅速混勻，將液體倒入已經(jīng)架好的配膠玻片中，插上10孔的梳子，讓液體自身凝固15-30分鐘。
4.2.2將梳子從6%的尿素變性膠中拔出，用IXTBE沖洗膠孔。200伏下預(yù)跑6%尿素變性膠15-30分鐘，用IXTBE再次沖洗膠孔
4.3樣品準(zhǔn)備[0170]4.3.1在20微升連接好的cDNA加入等量的2 X上樣緩沖液，在另外一個200微升潔凈的PCR管中加入4微升RNA分子量指示劑。
4.3.2在樣品上樣前在65°C下變性5分鐘，取出后冰浴2分鐘，然后離心使樣品甩到管底，隨后可以將樣品以及RNA分子量指示劑加入到不同的膠孔中。200伏下電泳30分鐘。
4.4割膠流程
4.4.1電泳之后，將凝膠在I X TBE/EtBr染色液中染色3分鐘。
4.4.2用干凈的刀片割取膠片15(T560 nt區(qū)域的片段，然后將這些割下的膠片放到準(zhǔn)備好的收集管中。收集管是由大小兩個管子套在一起組成的，小管子是1.0 ml離心管，大管子為2.0 ml離心管，小管子底部事先扎好小孔。通過13000 rpm 2分鐘的離心，將小管子中的膠片離碎并被甩到2.0 ml大管子中。
4.4.3加500微升0.3 mo I/L的NaCl到2.0 ml的大管子中，然后將管子在搖床上振蕩過夜。將洗脫物和凝膠碎片轉(zhuǎn)移到具有纖維素膜的Spin-X管中，然后13000 rpm 2分鐘離心，把洗脫物從凝膠碎片中離心出。加入1400微升無水乙醇和2.5微升5 μ g/ μ I糖原，混勻后放置_80°C冰箱30分鐘。
4.4.4打開4°C離心機(jī)，4°C下13000 rpm離心25分鐘。小心的將上清倒掉，然后用750微升75%乙醇洗滌cDNA沉淀。4°C下13000 rpm離心5分鐘，小心的將上清倒掉，讓剩余乙醇在空氣中揮發(fā)，然后用15微升的無核酶水溶解cDNA。
四、PCR擴(kuò)增
1.PCR (小片段·cDNA和大片段cDNA分別擴(kuò)增)
1.1在200微升PCR管中加入以下PCR反應(yīng)試劑:5微升小片段cDNA或5微升大片段cDNA; 10微升5 X phu酶緩沖液；2微升PE PCR前向引物(25 μ M); 2微升PE PCR反向引物(25 μΜ);5微升dNTP (2.5 mM) ;0.5微升phu聚合酶(2 U/μ I) ;25.5微升無核酶水。phu全稱phusion,是商標(biāo)名稱,是Finnzymes公司開發(fā)的一種高性能聚合酶。
1.2在熱循環(huán)儀上設(shè)定以下程序:98°C，30秒；98°C，15秒；65°C，30秒；72°C，40秒；72°C，10分鐘；4°C保存。第二到第四步重復(fù)40個循環(huán)。
2.用PCR Clean up試劑盒(Axygen)純化PCR產(chǎn)物，并用25微升雙蒸水洗脫。
3.擴(kuò)增產(chǎn)物的混合
摩爾數(shù)計算公式:
摩爾數(shù)(mol)=文庫質(zhì)量(g)/(文庫平均分子量(bp) X650 (g/mol/bp))；
其中，小片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的文庫平均分子量=(50+150)/2=100 bp;
大片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的文庫平均分子量=(150+500)/2=325 bp。
將小片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物和大片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物以等摩爾數(shù)進(jìn)行混合，混合產(chǎn)物即為中小片段RNA測序文庫。
制備好的中小片段RNA文庫送至illumina公司，利用GA II儀器進(jìn)行大規(guī)模測序，測序結(jié)果使用blast軟件基因組比對，比對結(jié)果通過velvet軟件進(jìn)行序列的拼接。
以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求
所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，其特征在于:所述的方法如下: 樣品總RNA經(jīng)過電泳分離得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小為SOntSM1 < 150nt，所述的大片段RNA的分子量M2的大小為150nt < M2 < 500nt ； 一、小片段cDNA的制備 (1)用堿性磷酸酶對小片段RNA去磷酸化處理，去除小片段RNA兩端的磷酸基團(tuán)，去磷酸化的小片段RNA經(jīng)純化后得到小片段RNA純化物； (2)用14RNA連接酶將RNA接頭連接在小片段RNA純化物的3’端，連接產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化得分子量8(Tl80nt的RNA連接產(chǎn)物；RNA接頭的序列為SEQ ID N0.1 ； (3)以步驟(2)得到的RNA連接產(chǎn)物為模板，以與RNA接頭互補的DNA為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID N0.2，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA鏈； (4)用RNaseA消化步驟(3)得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，消化后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化處理得分子量8(Tl80nt的cDNA片段； (5)用T4DNA連接酶將帶有突出端的雙鏈DNA接頭連接在步驟(4)純化的cDNA的3’端，連接產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化得到分子量IlOllOnt的小片段cDNA ;雙鏈DNA接頭序列正義鏈為SEQ ID N0.3，反義鏈為SEQ ID N0.4 N0.7 ； 二、大片段cDNA的制備 A、以大片段RNA為模板，以帶有6個隨機(jī)堿基的接頭為反轉(zhuǎn)錄引物，該反轉(zhuǎn)錄引物的序列為SEQ ID N0.8 N0.11，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ；· B、用氫氧化鈉消化步驟A的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，消化后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行離心純化得純化的cDNA ； C、用T4DNA連接酶將帶有突出端的雙鏈DNA接頭連接在步驟B得到的純化的cDNA的3’端，連接產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并純化得到分子量15(T560nt的大片段cDNA ； 三、PCR擴(kuò)增 將步驟一得到的最終產(chǎn)物小片段cDNA和步驟二得到的最終產(chǎn)物大片段cDNA在PCR弓丨物以及DNA聚合酶的作用下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將小片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物和大片段cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物以等摩爾數(shù)進(jìn)行混合，混合產(chǎn)物即為中小片段RNA測序文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，其特征在于:所述的電泳分離使用的電泳介質(zhì)為尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，其特征在于:尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠中尿素的濃度為7 8mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3所述的構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，其特征在于:尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠中聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為6 10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或2或3所述的構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法，其特征在于:步驟三中，PCR弓丨物包括PCR前向引物和PCR反向引物。
專利摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，目的在于提供一種構(gòu)建中小片段RNA測序文庫的方法。本發(fā)明主要步驟為1、小片段cDNA的制備，2、大片段cDNA的制備，3、PCR擴(kuò)增。本發(fā)明將大片段RNA用隨機(jī)引物法進(jìn)行文庫的制備，克服了接頭連接法受限測序讀長的問題，又將小片段RNA用類似接頭連接法且不需要保證RNA的5’端必須是磷酸基團(tuán)，進(jìn)行文庫的制備，保留了小片段RNA的信息，使得測序信息更加全面。
文檔編號C12Q1/68GKCN102534813 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201110360084
公開日2013年9月4日 申請日期2011年11月15日
發(fā)明者周小川, 郎秋蕾, 徐根明, 吳鵬, 劉歆 申請人:杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),