利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程，具體是涉及一種利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成 纖維細(xì)胞生長因子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor,簡稱FGF)是一類結(jié)構(gòu)類似、 生物功能相近的肝素結(jié)合蛋白，目前共分離鑒別出23種FGFs，堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,簡稱bFGF)是FGFs家族的主要成員之一，具有廣泛的 生物學(xué)活性，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，對許多細(xì)胞有化學(xué)催化作用，誘導(dǎo) 內(nèi)皮細(xì)胞合成膠原酶和纖溶酶原激活因子，在體內(nèi)誘導(dǎo)血管形成，還能促進(jìn)軟骨、骨組織及 神經(jīng)組織的損傷修復(fù)，促進(jìn)肢體再生，對大腦皮層、中腦和小腦神經(jīng)元均有促活作用，除用 于醫(yī)療外還被大量的運(yùn)用于美容和整形，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 天然的bFGF來源于垂體等組織中，含量極少，難以大量制備。運(yùn)用基因工程在大 腸桿菌中發(fā)酵生產(chǎn)是常用的最為經(jīng)濟(jì)和可持續(xù)的方法。然而在大腸桿菌中bFGF以包涵體 的形式表達(dá)，需要重折疊以恢復(fù)生物活性，而非融合的bFGF在大腸桿菌中的表達(dá)量過低。 而公開號為CN 1594565A的專利使用家蠶表達(dá)bFGF，每頭家蠶產(chǎn)量僅600~700 μ g，且 生產(chǎn)周期過長；公開號為CN1345927A的專利使用酵母發(fā)酵表達(dá)bFGF，其產(chǎn)量低，僅20~ 100mg/L。公開號為CN 102675473A的專利融合bFGF與人膠原蛋白，其醫(yī)療方面的應(yīng)用受 限制。公開號為CN103882028A的專利融合PDI輔助可溶性表達(dá)，但未提及表達(dá)量。
[0004] SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier)是一種小分子泛素樣修飾蛋白，廣泛存 在于各種真核細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的核質(zhì)運(yùn)輸以及細(xì)胞周 期等多種生理進(jìn)程。近年來發(fā)現(xiàn)SUMO可作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，具有抗 蛋白酶水解、顯著增加重組蛋白表達(dá)量、促進(jìn)靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能。目前尚 未見有利用SUMO促進(jìn)bFGF高效表達(dá)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子的方 法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)工程菌構(gòu)建：
[0008] bFGF的原始基因序列如SEQ ID NO. 1，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2,原始基因序列 中存在Ncol酶切位點(diǎn)，故將其第6位的C突變成A，其氨基酸序列仍保持不變，全序列合成 優(yōu)化后的基因序列如SEQ ID NO. 3。
[0009] SUMO蛋白酶ULPl在SUMO C端Gly-Gly后酶切，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，Gly-Gly后為Met 也不影響酶切；由于不存在合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，因此使用overlap PCR將SEQ ID NO. 3序列與SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列兩端設(shè)計(jì)Ncol和Xhol酶切位點(diǎn)，拼接序列 內(nèi)部并無這兩內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，最終得到的序列為SEQ ID NO. 4 ;使用Ncol和Xhol酶切拼 接序列與質(zhì)粒pRSFD連接；設(shè)計(jì)引物如下：
[0010] Part A ：
[0011] 模板：pSUMO
[0012] Up primer for pSUM〇-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
[0013] bFGF Down primer for A:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
[0014] Part B:
[0015] 模板：bFGF gene
[0016] bFGF Up Primer for B:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
[0017] bFGF Down primer for B-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
[0018] 將構(gòu)建好的質(zhì)粒pRSFD-SUMO-bFGF轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E. Coli BL21 (DE3)中；
[0019] 2)工程菌發(fā)酵：
[0020] 將構(gòu)建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上選育菌種，在液體培養(yǎng)基中發(fā) 酵培養(yǎng)，加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。
[0021] 3)純化：
[0022] 裂解菌體，離心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni膠親和吸 附，將上清液與Ni膠混合使之結(jié)合到Ni膠上，加入SUMO蛋白酶ULPl酶切，因?yàn)镾UMO與 ULPl都有His-Tag，都可以被Ni膠特異吸附而bFGF不能被吸附，所以可用砂芯漏斗將之過 濾出來；
[0023] 收集的bFGF溶液中還有少量雜質(zhì)，可以使用Heparin柱親和吸附bFGF，沖洗雜質(zhì) 后，用緩沖液洗脫，純化后的bFGF溶液進(jìn)行凍干，即得到bFGF蛋白凍干粉。純化后的bFGF 純度可以達(dá)到97%。
[0024] 在步驟2)中，所述液體培養(yǎng)基可采用加有Kana霉素的LB培養(yǎng)基。
[0025] 在步驟 3)中，所述緩沖液的配方可為：1XPBS，ImM PMSF，0. 3M NaCl，0. 1% Triton X-IOOo
[0026] 本發(fā)明應(yīng)用SUMO表達(dá)系統(tǒng)高效穩(wěn)定、可溶性地表達(dá)SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO 肽段N端前設(shè)計(jì)組氨酸標(biāo)簽，融合蛋白可以特異結(jié)合Ni-NTA resin，經(jīng)過同樣含有組氨酸 標(biāo)簽的SUMO蛋白酶ULPl切割后可以獲得無任何氨基酸殘基殘留的高純度的bFGF蛋白。經(jīng) SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)表達(dá)量高達(dá)28 %，最終得到的bFGF蛋白純度達(dá)到97 %。
【附圖說明】
[0027] 圖1是實(shí)施例1中載體pRSFD-SUMO-bFGF的質(zhì)粒圖譜。
[0028] 圖2是實(shí)施例2中重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)前后的SDS-PAGE電泳圖。在圖2中，泳道 1為誘導(dǎo)前，泳道2為誘導(dǎo)后，泳道3為蛋白分子量Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限制于這些實(shí)施 例。
[0030] 實(shí)施例1 :工程菌構(gòu)建
[0031] 全序列合成SEQ ID NO. 3。bFGF的原始基因序列存在Ncol酶切位點(diǎn)，故將第6位 原來的C突變成A，蛋白質(zhì)序列仍保持不變。
[0032] SUMO蛋白酶I在SUMO C端Gly-Gly后酶切，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，Gly-Gly后為Met也 不影響酶切。由于不存在合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，因此使用overlap PCR將SEQ ID NO. 1序列與SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列兩端設(shè)計(jì)Ncol和Xhol酶切位點(diǎn)，拼接序列 內(nèi)部并無這兩內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，最終得到的序列為SEQ ID NO. 4。使用Ncol和Xhol酶切拼 接序列及pRSFD連接。設(shè)計(jì)引物如下：
[0033] Part A ：
[0034] 模板：pSUMO
[0035] Up primer for pSUM〇-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
[0036] bFGF Down primer for A:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
[0037] Part B:
[0038] 模板：bFGF gene
[0039] bFGF Up Primer for B:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
[0040] bFGF Down primer for B-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
[0041] 構(gòu)建好的質(zhì)粒如圖I所示，其中T7Promoter為啟動子，Ncol和Xhol為酶切位點(diǎn)， Kan為Kana霉素抗性基因。
[0042] 按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》上所述的方法將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 E.Coli BL21(DE3)中。
[0043] 實(shí)施例2 :工程菌發(fā)酵。
[0044] 將實(shí)施例1中構(gòu)建好的工程菌涂布在加有Kana霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱過 夜培養(yǎng)，挑選單菌落接種于250ml加有Kana霉素的LB培養(yǎng)基中，在搖床上過夜培養(yǎng)，培養(yǎng) 條件37°C，220rpm。培養(yǎng)好的菌液作為菌種，接種到裝有滅菌的15L LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中， 培養(yǎng)至0D600 = 0. 8~1. 2時(shí)，加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)10h。4000g離心收集菌體。分別取誘 導(dǎo)前及誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)的樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示，其中泳道1為誘導(dǎo)前 樣品，泳道2為誘導(dǎo)結(jié)束樣品，泳道3為蛋白Marker。泳道2中在分子量35kd處誘導(dǎo)產(chǎn)生 的蛋白條帶為SUMO-bFGF，表達(dá)量為28%。
[0045] 實(shí)施例3:蛋白純化
[0046] 將實(shí)施例2得到的菌體混勻于5~10倍體積的裂解緩沖液中，緩沖液配方： lXPBS，lmMPMSF，(X3M NaCl，0. l%Triton X-100。超聲破碎上述混合液，12000g 離心，收集 上清液。該上清液即為SUMO-FGF蛋白粗提液。將粗提液與Ni-NTA resin混合，4°C低溫振 蕩過夜。使SUMO-bFGF蛋白完全結(jié)合到Ni-NTA resin上。
[0047] 緩沖液沖洗SUMO-bFGF蛋白-Ni混合物。加入酶切緩沖液，適量的SUMO蛋白酶 I，低溫過夜酶切。過濾酶切混合物，收集流穿液即為bFGF蛋白初制液。將上述初制液過 Heparin柱層析，用2M NaCl洗脫，收集洗脫液。洗脫液過夜透析去除NaCl，得到的即為bFGF 精制液。
[0048] 將上述bFGF精制液進(jìn)行凍干，即得到bFGF蛋白凍干粉。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 工程菌構(gòu)建： bFGF的原始基因序列如SEQIDNO. 1，氨基酸序列如SEQIDNO. 2,原始基因序列中存 在Ncol酶切位點(diǎn)，故將其第6位的C突變成A，其氨基酸序列仍保持不變，全序列合成優(yōu)化 后的基因序列如SEQIDNO. 3 ; SUMO 蛋白酶 ULPl 在 SUMO C 端 Gly-Gly 后酶切，使用 overlap PCR 將 SEQ ID NO. 3 序 列與SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列兩端設(shè)計(jì)Ncol和Xhol酶切位點(diǎn)，拼接序列內(nèi)部并 無這兩內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，最終得到的序列為SEQ ID NO. 4 ;使用Ncol和Xhol酶切拼接序列 與質(zhì)粒pRSFD連接；設(shè)計(jì)引物如下： Part A： 模板:PSUMO UpprimerforpSUM〇-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA bFGFDownprimerforA:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC Part B: 模板：bFGF gene bFGFUpPrimerforB:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA bFGFDownprimerforB-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA 將構(gòu)建好的質(zhì)粒pRSFD-SUMO-bFGF轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.ColiBL21(DE3)中； 2) 工程菌發(fā)酵： 將構(gòu)建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上選育菌種，在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培 養(yǎng)，加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體； 3) 純化： 裂解菌體，離心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni膠親和吸附，將 上清液與Ni膠混合使之結(jié)合到Ni膠上，加入SUMO蛋白酶ULPl酶切，bFGF用砂芯漏斗過 濾；收集的bFGF溶液中還有少量雜質(zhì)，使用Heparin柱親和吸附bFGF，沖洗雜質(zhì)后，用緩沖 液洗脫，純化后的bFGF溶液進(jìn)行凍干，即得到bFGF蛋白凍干粉。2. 如權(quán)利要求1所述利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子的方法，其特征在 于在步驟2)中，所述液體培養(yǎng)基采用加有Kana霉素的LB培養(yǎng)基。3. 如權(quán)利要求1所述利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子的方法，其特征在 于在步驟 3)中，所述緩沖液的配方為：lXPBS，lmMPMSF，0. 3MNaCl，0. 1%TritonX-100。
【專利摘要】利用pSUMO系統(tǒng)制備堿性成纖維細(xì)胞生長因子的方法，涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程。1)工程菌構(gòu)建；2)工程菌發(fā)酵：將構(gòu)建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上選育菌種，在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。3)純化。應(yīng)用SUMO表達(dá)系統(tǒng)高效穩(wěn)定、可溶性地表達(dá)SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO肽段N端前設(shè)計(jì)組氨酸標(biāo)簽，融合蛋白可以特異結(jié)合Ni-NTA？resin，經(jīng)過同樣含有組氨酸標(biāo)簽的SUMO蛋白酶ULP1切割后可以獲得無任何氨基酸殘基殘留的高純度的bFGF蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)表達(dá)量高達(dá)28％，最終得到的bFGF蛋白純度達(dá)到97％。
【IPC分類】C12P21/02, C12N1/21, C12N15/70
【公開號】CN105177033
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】鄭扶桑, 張健, 高偉, 蔣妙婷
【申請人】廈門歐瑞捷生物科技有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年9月23日