一種快速檢測(cè)top2a基因異常的熒光原位雜交探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速FISH探針的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，特別是快速檢測(cè)T0P2A基因是否異 常的熒光原位雜交探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是婦女中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在西方國(guó)家其發(fā)病率和病死率居腫瘤之 首，近年來(lái)，，在我國(guó)的發(fā)病率也呈直線上升的趨勢(shì)。
[0003] 臨床研究表明，T0P2A基因異常的乳腺癌患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS)縮短，預(yù)后 差，尤其是T0P2A基因缺失的乳腺癌患者預(yù)后更差。T0P2A基因異常的患者接受蒽環(huán)類(lèi)藥 物的化療方案效果要優(yōu)于T0P2A基因正常的患者，T0P2A異常的患者使用CEF方案（環(huán) 磷酰胺+表阿霉素+氟尿嘧啶，其中表阿霉素為蒽環(huán)類(lèi)藥物）進(jìn)行治療可降低65%的復(fù)發(fā) 風(fēng)險(xiǎn)和71 %的死亡風(fēng)險(xiǎn)，而T0P2A正常的患者使用此方案只能降低6%的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和10% 的死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此，檢測(cè)乳腺癌患者中T0P2A的基因狀態(tài)有助于判斷預(yù)后以及指導(dǎo)臨床合 理用藥。
[0004] 目前檢測(cè)T0P2A基因的方法包括：免疫組織化學(xué)法（IHC)檢測(cè)T0P2A蛋白過(guò)表 達(dá)、熒光原位雜交法（FISH)檢測(cè)T0P2A基因拷貝數(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測(cè)血 清T0P2A E⑶(上皮鈣黏附素）或腫瘤組織。其中最實(shí)用的方法是FISH。由于傳統(tǒng)FISH探 針序列的長(zhǎng)度較大，導(dǎo)致所需要的雜交時(shí)間很長(zhǎng)(一般是過(guò)夜雜16-18小時(shí))，不能及時(shí)的得 到檢測(cè)結(jié)果，這不利于臨床的診斷及治療。對(duì)FISH探針進(jìn)行改進(jìn)，縮短雜交時(shí)間，提高檢測(cè) 效率，有利于臨床的診斷及治療。
[0005] 有必要開(kāi)發(fā)出一種快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，包括T0P2A基因特異性探針，17號(hào)染色 體特異性探針。
[0008] 1.探針的序列分別為： T0P2A基因特異性探針序列：
17號(hào)染色體特異性探針序列：
2.上述探針是對(duì)應(yīng)染色體上為重復(fù)性高，特異性好的短序列。
[0009] 3.上述檢測(cè)試劑盒中的使用的探針中，T0P2A基因特異性探針連接的熒光基團(tuán)為 綠色熒光基團(tuán)；17號(hào)染色體特異性探針連接的熒光基團(tuán)為紅色熒光基團(tuán)。
[0010] 4.探針?biāo)镁彌_液為：2〇1111~5〇11111^8-此1(?!18.0~8.8)，1〇11111%(31 2，10%~ 30%甲酰胺。
[0011] 5.將探針玻片上的雜交區(qū)域置于雜交儀中進(jìn)行變性雜交，變性溫度為95°C，變性 時(shí)間為lOmin，雜交溫度為42°C，雜交時(shí)間為20min。
[0012] 6.結(jié)果的判定，雜交完畢，在熒光顯微鏡下觀察，觀察50個(gè)計(jì)數(shù)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)每個(gè) 細(xì)胞核中的紅色信號(hào)數(shù)量和綠色信號(hào)數(shù)量并計(jì)算比值（比值=50個(gè)細(xì)胞核中綠色信號(hào) 總數(shù)/50個(gè)細(xì)胞核中紅色信號(hào)總數(shù)）。若比值大于2.0,則判定T0P2A基因擴(kuò)增；若比值小 于〇. 8,則判定T0P2A基因缺失；若比值處于0. 8-2. O之間，則再次觀察計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果仍處 于0. 8-2. O之間的判定為T(mén)0P2A基因正常。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明試劑盒，采用優(yōu)化的短序列熒光探針，將原有的FISH檢測(cè)時(shí)間由16~18小時(shí) 縮短至1~2小時(shí)，可以快速地檢測(cè)T0P2A基因狀態(tài)，有利于更準(zhǔn)確地制定后續(xù)的治療方 案。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1表示的是樣本通過(guò)處理后，用T0P2A基因特異性探針和17號(hào)染色體特異性探 針進(jìn)行雜交后的鏡檢結(jié)果，如圖所示，雜交染色后，細(xì)胞核輪廓清楚，細(xì)胞核中紅色信號(hào)和 綠色信號(hào)清晰可見(jiàn)，可選擇為計(jì)數(shù)細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 : 一、快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，包括T0P2A基因特異性探針和17 號(hào)染色體特異性探針。
[0016] 1.其中，探針的序列分別為： T0P2A基因特異性探針序列：
CN 105177120 A 說(shuō)明書(shū) 3/4 頁(yè)
2.上述探針是對(duì)應(yīng)染色體上為重復(fù)性高，特異性好的短序列。
[0017] 3.上述檢測(cè)試劑盒中的使用的探針中，T0P2A基因特異性探針連接的熒光基團(tuán)為 綠色熒光基團(tuán)；17號(hào)染色體特異性探針連接的熒光基團(tuán)為紅色熒光基團(tuán)。
[0018] 4.探針?biāo)镁彌_液為：2〇1111~5〇11111^8-此1(?!18.0~8.8)，1〇11111%(31 2，10%~ 30%甲酰胺。
[0019] 5.將探針玻片上的雜交區(qū)域置于雜交儀中進(jìn)行變性雜交，變性溫度為95°C，變性 時(shí)間為lOmin，雜交溫度為42°C，雜交時(shí)間為20min。
[0020] 二、FISH 檢測(cè) 1. 將石錯(cuò)包埋樣本玻片放入65±5°C恒溫箱中烤片過(guò)夜； 2. 取出玻片，將其放入室溫二甲苯中15分鐘，重復(fù)一次； 3. 取出玻片，再將其放入室溫?zé)o水乙醇中10分鐘； 4. 取出玻片，再將其依次放入室溫100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇各3分鐘； 5. 取出玻片，再將其放入室溫去離子水中3分鐘； 6. 取出玻片，再將其放入95°C -99°C的樣本處理液中煮片10分鐘(切片水平放置于容 器中，樣本面朝上）； 7. 取出玻片，等其涼至室溫后，再將其放入無(wú)菌純水中3分鐘，用無(wú)絨紙巾吸去多余水 分(不能觸碰到組織）； 8. 室溫晾干，將玻片平攤放在恒溫箱或加熱平臺(tái)上，在樣本區(qū)域滴加適量(覆蓋整個(gè)樣 本區(qū)即可）的蛋白酶K反應(yīng)液，37°消化5~15分鐘； 9. 倒去玻面上的多余液體，將其放入室溫洗液1中5分鐘，重復(fù)一次 10. 取出玻片，再將其依次放入室溫70%，90%，100%梯度乙醇脫水各2分鐘，室溫晾干 11. 從_20°C冰箱中取出IOnmol/管的探針干粉12000r/min離心5min ;加入IOOul的 緩沖液，震蕩混勻。
[0021] 12.在玻片上加10 μ 1的雜交探針到雜交區(qū)域，迅速蓋上22 X 22mm蓋玻片，輕壓使 雜交液均勻分布，避免產(chǎn)生氣泡； 13. 用橡皮膠沿蓋玻片邊緣封片，完全覆蓋蓋玻片和載玻片接觸的部位； 14. 將玻片放入雜交儀中，濕潤(rùn)原位雜交儀濕度條，插入濕條，蓋上雜交儀上蓋，設(shè)置 "Denat&Hyb" 程序，雜交(變性 95°C lOmin，雜交 42°C 20min)。
[0022] 15.將玻片取出，輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片(若蓋玻片難以去除，可以將其放入 洗液2中微微搖晃，以利于其脫落）； 16. 玻片放入洗液3中室溫孵育5分鐘； 17. 取出玻片，再將其放入洗液4中室溫孵育2分鐘； 18. 取出玻片，室溫自然干燥玻片； 19. 室溫，滴加10 ul DAPI復(fù)染劑到22 X 22mm的蓋玻片，載玻片目標(biāo)區(qū)域朝下，輕放 于蓋玻片上，輕壓，避免產(chǎn)生氣泡，在暗處存放，待觀察。
[0023] 注意事項(xiàng)：FISH檢測(cè)第15-19步需避光操作。
[0024] 三、檢測(cè)結(jié)果： 鏡檢結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中所使用的探針，可以與 目的序列穩(wěn)定的結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號(hào)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，同時(shí)大大縮短了 T0P2A基因的 熒光檢測(cè)時(shí)間，利于疾病的早期診斷與治療。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，包括T0P2A基因特異性探針，17 號(hào)染色體特異性探針，緩沖液和染色液，其中，探針的序列分別為： T0P2A基因特異性探針序列：17號(hào)染色體特異性探針序列：〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，其特征在于： T0P2A基因特異性探針連接的熒光基團(tuán)為綠色熒光基團(tuán)；17號(hào)染色體特異性探針連接的熒 光基團(tuán)為紅色熒光基團(tuán)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1，2所述的快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，其特征在 于：探針是對(duì)應(yīng)染色體上為重復(fù)性高，特異性好的短序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1，2所述的快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，其特征在 于：將T0P2A基因特異性探針與17號(hào)染色體特異性探針按照1 :1混合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)T0P2A基因異常的熒光原位雜交探針，其特征在于： 探針?biāo)镁彌_液為：20mM ~50mM Tris-Hcl (PH8. O ~8. 8)，IOmM Mgcl2,10% ~30% 甲酰 胺。6. 根據(jù)權(quán)利要求1，2,3,4,5所述的快速檢測(cè)1'(^24基因異常的熒光原位雜交探針， 其特征在于：將探針加到樣本玻片上的雜交區(qū)域內(nèi)于雜交儀中進(jìn)行變性雜交，變性溫度為 95°C變性時(shí)間為lOmin，雜交溫度為42°C雜交時(shí)間為20min。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了TOP2A基因和17號(hào)染色體特異性探針序列，以及對(duì)快速檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行細(xì)致的描述。這種快速檢測(cè)的方法大大提高了熒光原位雜交檢測(cè)效率，有利于臨床的診斷及治療。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105177120
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳華云, 劉淑園, 陳嘉昌, 丁渭, 肖湘文, 黃爽, 曾燁, 鄧金萍, 劉孝禮
【申請(qǐng)人】廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年8月13日