香豆素類化合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及香豆素類化合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用 途，具體涉及一種從藥用植物山芝麻中分離得到的香豆素類化合物6, 7, 9α-三羥 基-3, 8, 11 a -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)有關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示，全世界約有3億多人為慢性乙肝病毒（HBV)攜帶者，我國(guó)約占半 數(shù)。乙肝病毒感染已成為全球性的影響人類健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以導(dǎo)致 慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，因此成為影響人類壽命的九大疾病之一。由于慢性HBV感 染者較非攜帶者發(fā)生肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)率為217,因此在全世界每年大約有200萬人死于乙 肝引起的肝硬化和肝癌，而我國(guó)又是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，每年約有25萬人死于與乙肝相關(guān) 的慢性肝病（肝硬化與肝癌）。上述疾病給人民健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失。因此，尋求 高效低毒的抗HBV藥物已成為刻不容緩的問題。
[0003] 藥物化學(xué)工作者在篩選抗HBV藥物的過程中進(jìn)行了不懈的努力，但到目前為止還 在尋找能治愈HBV感染的特效藥。臨床上已獲得FDA正式批準(zhǔn)使用的α -干擾素和核苷類 藥物拉米呋啶能在某種程度上獲得治療效果，但對(duì)大多數(shù)病人還達(dá)不到治愈的目的，且停 止治療后的"反跳"現(xiàn)象是醫(yī)藥工作者最感棘手的問題，所以開發(fā)研制高效、低毒、不"反跳" 的抗HBV新藥向藥物化學(xué)工作者提出了挑戰(zhàn)。在篩選抗HBV新藥的過程中，越來越多的藥 物化學(xué)工作者將注意力轉(zhuǎn)向了植物來源豐富、價(jià)廉易得、毒副作用小、分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的 天然化合物。
[0004] 山芝麻為梧桐科植物山芝麻（Helicteres angustifolia L.)的干燥根或全株，味 苦、性寒，歸肺、大腸經(jīng)，可解表清熱、解毒消腫，用于治療感冒發(fā)熱、痄腮、乳娥、麻疹、咳嗽、 泄瀉痢疾、癰腫。藥理研究表明山芝麻具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗腫瘤等活性。有研究表 明山芝麻粗提物具有抗HBV活性，但對(duì)其抗HBV的藥效物質(zhì)卻缺乏研究，迄今為止，尚未見 有關(guān)涉及本發(fā)明的6, 7, 9 α -三羥基-3, 8, 11 α -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]-香豆素抗HBV活 性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從山芝麻中分離得到的香豆素類化合物6, 7, 9 α -三羥 基-3, 8, 11 α -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
[0006] 本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代藥理篩選方法，從梧桐科山芝麻屬（Helicteres)植物山芝麻 (H. angustifolia)中提取分離得到1個(gè)香豆素類化合物：6, 7, 9 α -三羥基-3, 8, 11 α -三 甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素，并經(jīng)與陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶藥理試驗(yàn)比較，結(jié)果證實(shí)前者具 有顯著的抗乙肝病毒作用，對(duì)HBsAg的IC 5。值為11. 8 μ g/ml，對(duì)HBeAg的IC5。值為34. 2 μ g/ ml，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶。
[0007] 本發(fā)明所述的活性化合物具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0008]
[0009] 本發(fā)明的化合物通過下述方法制備：
[0010] 取山芝麻干燥根25kg，95%乙醇回流提取，濃縮后分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁 醇萃取，共得0. 95kg，取乙酸乙酯萃取物200g進(jìn)行硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫，所得流份以不同洗脫劑進(jìn)行反復(fù)硅膠柱色譜、MPLC和半制備HPLC等分離純化手段分離 得到化合物6, 7, 9 a -三羥基-3, 8, 11 a -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素。
[0011] 本發(fā)明所述的6, 7, 9 Ct -三羥基-3, 8, 11 Ct -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]-香豆素可作 為活性成分用于制備抗HBV的藥物。
【附圖說明】
[0012] 圖1是6, 7, 9 a -三羥基-3, 8, 11 a -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]-香豆素的提取分離 工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1制備6, 7, 9α-三羥基-3, 8, Ila-三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素
[0014] 取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合 并提取液并濃縮得浸膏〇.95kg，加水（4L)混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和正 丁醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物200g。將乙酸乙酯萃取部 位經(jīng)硅膠（200-300目）柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫， 得到11個(gè)流份（Fr.l-ΙΙ)，其中流份Fr.3(32g)再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇， 30:1,20:1，10:1,5:1,3:1，1:1)、MPLC(甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脫）和半制備 HPLC 等手段純化，分離得到化合物6, 7, 9 a -三羥基-3, 8, 11 a -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆 M (6, 7, 9 a -trihydroxy-3, 8, 11 a -trimethylcyclohex〇-[d, e]-coumarin, I)〇
[0015] 所得化合物為棕色無定型粉末，[n原：+27. 6(c I. 15，Me0H) ;UV(MeOH) λΜχ nm(l og ε ) ：322. 3(3. 54), 210. 6(4. 67) ；IR(KBr) : unax(cm :3358, 2939, 1687, 1626, 1562, 1392 ，1238 ;ESI-MS m/z: 277 [M+H]+。1H-NMR (600MHz, DMS0-d6) δ H: 4· 90 (1H, brs, H-9)，3· 33 (1H, m，H-I I)，2. 19 (3H，s，13-0CH3)，2. 10 (3H，s，12-0CH3)，2. 06 (1H，brd，J = 14. 4Hz，H-lOa)，I. 85 (1H，m，H-lOb)，I. 37 (3H，d，J = 7. 2Hz，H-OCH3) ;13C-NMR(150MHz，DMS0-d6) δ c: 163. I (C-2)，147. 7 (C-8a)，147. 5 (C-7)，145. 7 (C-6)，139. 0 (C-4)，125. I (C-5)，117. 2 (C-3)，109. 4 (C -8)，107. 5 (C-4a)，62. 8 (C-9)，35. 6 (C-10)，25. 6 (C-l I)，22. I (H-OCH3)，12. 2 (12-0CH3)，8. 9(13-0CH3) o
[0016] 實(shí)施例2體外抗HBV實(shí)驗(yàn)
[0017] 應(yīng)用Ifep G2的2. 2. 15細(xì)胞株（教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海），以每孔IOX IO5個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)基為DMEM，生長(zhǎng)液含10 %胎牛血清， 38〇μ8/πι1 G418,0.03%谷胺酰胺，青霉素、鏈霉素各lOOμg/ml，在5% CO2孵箱中37°C培 養(yǎng)，48小時(shí)后，換成二甲基亞砜助溶的含藥物的培養(yǎng)液，每種藥物設(shè)3~5個(gè)濃度，每個(gè)濃 度設(shè)4個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)9天（每3天換液一次），收集上清液用ELISA檢測(cè)HBsAg及 HBeAg含量。同樣條件下以不含藥物的培養(yǎng)液上清液作為對(duì)照組。同時(shí)用上述細(xì)胞株，用 MTT法測(cè)定藥物的細(xì)胞毒性。陽(yáng)性對(duì)照為拉米呋啶（3TC)，結(jié)果證實(shí)本發(fā)明所述化合物具有 顯著的抗HBV活性，且有效濃度低，其對(duì)HBsAg的IC 5。值為IL 8 μ g/ml，對(duì)HBeAg的IC5。值 為34. 2 μ g/ml，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶（如表1所示）。
[0018] 表1.化合物1對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用
[0020] / :當(dāng)細(xì)胞毒性> 25%時(shí)不進(jìn)行抑制率測(cè)試
[0021] 本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)采用的試劑均為本領(lǐng)域公知技術(shù)，可市購(gòu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 6, 7, 9 (I -三羥基-3, 8, 11 (I -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素在制備抗乙肝病毒藥 物中的用途，2. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物通過下述方法制備： 取山芝麻干燥根，95%乙醇回流提取，濃縮后分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取， 得乙酸乙酯萃取物，取乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，所 得流份以不同洗脫劑進(jìn)行反復(fù)硅膠柱色譜、MPLC和半制備HPLC分離純化，得到化合物 6, 7, 9 α -三羥基-3, 8, 11 α -三甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素。3. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物6, 7, 9 α -三羥基-3, 8, 11 α -三 甲基環(huán)己烷嵌-[d，e]_香豆素抗HBV活性。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種香豆素類化合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。本發(fā)明從山芝麻屬Helicteres植物山芝麻H.angustifolia中提取分離得到一種香豆素類化合物6,7,9α-三羥基-3,8,11α-三甲基環(huán)己烷嵌-[d,e]-香豆素并證實(shí)其抗乙肝病毒活性。所述的化合物經(jīng)與陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶藥理試驗(yàn)比較，結(jié)果證實(shí)前者具有顯著的抗乙肝病毒作用，對(duì)HBsAg的IC50值為11.8μg/ml，對(duì)HBeAg的IC50值為34.2μg/ml，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照拉米呋啶，可作為活性成分用于制備抗乙肝病毒的藥物。
【IPC分類】A61K31/37, C07D311/92, A61P31/20
【公開號(hào)】CN105520937
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410505699
【發(fā)明人】陳道峰, 殷翔, 史訓(xùn)龍, 朱海燕, 盧燕
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2014年9月28日