一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，屬于酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌(LAB)作為益生菌，是一類在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的工業(yè)菌株。 為了有效發(fā)揮其益生功能，乳酸菌需要耐受來(lái)自宿主胃腸道環(huán)境的各種生理化學(xué)屏障，其 中，腸道膽汁中的結(jié)合膽鹽是乳酸菌面臨的脅迫之一。目前已知廣泛存在與腸道微生物胞 內(nèi)的膽鹽水解酶(BSH)具有廣泛的底物特異性，幾乎能夠水解膽汁中所有的結(jié)合膽鹽生成 游離膽酸和氨基酸，解除結(jié)合膽鹽的毒性，但是過(guò)多的膽酸又會(huì)造成新的脅迫，因此提高 BSH的底物專一性，可以起到減少膽酸生成的目的。
[0003] 同時(shí)，膽汁酸作為一種信號(hào)物質(zhì)，在生物循環(huán)中，參與了機(jī)體脂質(zhì)、膽固醇和糖的 生化代謝及調(diào)節(jié)，因此，研究人員認(rèn)為改變膽汁酸的組成和流量可以作為一種治療代謝綜 合征的新方向。運(yùn)用基因工程手段提高膽鹽水解酶的底物專一性不僅能夠提高乳酸菌的腸 道定植能力，也為運(yùn)用BSH調(diào)節(jié)宿主健康狀況提供技術(shù)平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，所 述突變是對(duì)氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的來(lái)源于唾液乳酸桿菌的膽鹽水解酶BSH1內(nèi)部 氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而提高了膽鹽水解酶的底物專一性。
[0005] 所述突變是將膽鹽水解酶第24位的酪氨酸突變?yōu)楸彼?，得到突變體Y24A;或?qū)?58位的丙氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，得到突變體A58Q;或?qū)?5位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼幔玫?突變體F65A。
[0006] 所述膽鹽水解酶突變體Y24A、A58Q、F65A的氨基酸序列分別如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7所示。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述膽鹽水解酶突變體的核苷酸片段、含有所述 膽鹽水解酶突變體的載體，以及表達(dá)所述膽鹽水解酶突變體的的基因工程菌。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌為大腸桿菌，是將含有編碼所述膽 鹽水解酶突變體的基因與表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
[0010]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌是pET-20b(+)為載體、E.coli BL21 (DE3)為宿主表達(dá)所述突變體。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法，是利用編碼所述膽鹽水 解酶突變體的核苷酸片段、含有所述膽鹽水解酶突變體的載體或者表達(dá)所述膽鹽水解酶突 變體的基因工程菌。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將表達(dá)所述膽鹽水解酶突變體的基因工 程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集菌體，并破壁純化獲得;所述破壁純化是收集菌體后，用Ο . 1Μ、ρΗ 6.0 的磷酸鹽緩沖液洗滌離心2次，并重懸，超聲破碎5min，離心收集上清液，經(jīng)過(guò)鎳柱親和柱層 析和截留分子量為lOkDa的超濾膜進(jìn)行純化濃縮，獲得單一重組蛋白。
[0013]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)，是培養(yǎng)種子液，按接種量為1 %接種到TB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)； 菌體長(zhǎng)到OD6QQ為0.5-0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培養(yǎng)溫度降到20°C，培養(yǎng)24h。
[0014] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述膽鹽水解酶突變體，或者利用生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法生產(chǎn) 得到的膽鹽水解酶在食品、農(nóng)業(yè)或制備藥物方面的應(yīng)用，尤其是在制備微生態(tài)制劑、藥物表 達(dá)載體或飼料添加劑方面的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種提高膽鹽水解酶BSH1底物專一性的方法，是將氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的膽鹽水解酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第24位的酪氨酸突變?yōu)楸?酸，或?qū)⒌?8位丙氨酸突變?yōu)楣劝滨０?，或?qū)⒌?5位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼帷?br>[0016] 關(guān)于突變體命名：
[0017] 以"親本氨基酸位點(diǎn)取代后氨基酸"表示突變體，比如S32A，是指在親本氨基酸序 列的基礎(chǔ)上將第32位的氨基酸S(絲氨酸，Ser)突變?yōu)榘被酇(丙氨酸，Ala)。本發(fā)明中，以 SEQ ID NO. 1所示的序列為親本序列。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方式，將膽鹽水解酶底物結(jié)合口袋中的氨基酸進(jìn)行突變， 改變了酶分子與底物之間的疏水相互作用，進(jìn)而影響酶分子的底物結(jié)合方式，提高了膽鹽 水解酶的底物專一性。本發(fā)明的突變體F24A僅對(duì)六種底物中的四種有水解活性，且對(duì)GCDCA 和丁004的相對(duì)酶活降低了30%左右;而突變體蛋白458〇和?65六都是僅對(duì)六種底物中的五種 有水解活性，且A58Q對(duì)⑶0六、6(^^、11^、了004都降低了50%以上^654對(duì)0^4的特異性得到 顯著提高。本發(fā)明的突變體F24A、A58Q和F65A的底物專一性和特異性都得到了提高，為運(yùn)用 BSH調(diào)節(jié)宿主健康狀況提供技術(shù)平臺(tái)，也為益生菌株的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1:膽鹽水解酶野生型BSH1與突變體蛋白的底物特異性比較;底物特異性的測(cè)定 通過(guò)分
[0021 ]別以六種結(jié)合膽鹽為底物，測(cè)定比酶活，最高者為100%。
【具體實(shí)施方式】
[0022] LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0;
[0023] TB培養(yǎng)基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/L KH2P〇4，72mmol/L K2HP〇4〇
[0024] 膽鹽水解酶酶活測(cè)定方法:取10yL酶液用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)稀釋至90μ L，加入10yL結(jié)合膽鹽(200mM)混合，于37°C孵育30min，加入等體積的15 % (w/v)三氯乙酸終 止反應(yīng)，離心后取10yL上清液與190yL茚三酮試劑混合，于100°C反應(yīng)15min，冷卻后于570nm 處測(cè)定吸光值，根據(jù)甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。其中，茚三酮試劑的組成為:〇.5mL l%(w/ v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5檸檬酸鹽緩沖液），1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的檸檬酸緩 沖液。
[0025] 實(shí)施例1:重組菌的構(gòu)建
[0026]以前期構(gòu)建的攜有膽鹽水解酶BSH1編碼基因（氨基酸序列如SEQ ID NO. 1)的重組 質(zhì)粒PET21的DNA為模板，按照KOD-Plus-Neo試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：
[0033] PCR產(chǎn)物為重組質(zhì)粒pET22Q58A轉(zhuǎn)化至克隆宿主E.coil JM109的感受態(tài)細(xì)胞，于氨 芐青霉素的LB平板上，挑取陽(yáng)性菌落。37°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)上海生工測(cè)序鑒 定。測(cè)序正確的質(zhì)粒(含有氨基酸序列分別如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4,核 苷酸序列如SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7的序列），轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coilBL21 (DE3)，得到重組菌。
[0034] 實(shí)施例2:重組菌中酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及活性鑒定
[0035] 將實(shí)施例1中表達(dá)膽鹽水解酶突變體的重組大腸桿菌，挑選單菌落接種到LB液體 培養(yǎng)基中，37°C，200rpm下培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，接種量為1 %，于37°C、200rpm條件 下培養(yǎng)至菌體長(zhǎng)到〇D6Q()為0.5-0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，IPTG濃度為ImM，并將培養(yǎng)溫度降到20 °C，培養(yǎng) 24h。
[0036] 實(shí)施例3:突變體蛋白的制備及其底物專一性的測(cè)定
[0037]收集實(shí)施例2發(fā)酵后的菌體，用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)洗滌離心2次，并重懸， 超聲破碎5min(工作時(shí)間：間歇時(shí)間= 2:4)，離心收集上清液，經(jīng)過(guò)鎳柱親和柱層析和截留 分子量為10kDa的超濾膜獲得純化濃縮后的膽鹽水解酶突變體蛋白。
[0038] 比較了膽鹽水解酶突變體F24A、A58Q、F65A和野生型BSH1(SEQ ID N0:1)對(duì)六種底 物的專一性。其中六種底物分別為甘氨結(jié)合膽鹽(GCA)、甘氨脫氧結(jié)合膽鹽(GDCA)、甘氨鵝 脫氧結(jié)合膽鹽(GCDCA)、牛磺結(jié)合膽鹽(TCA)、?；敲撗踅Y(jié)合膽鹽(TDCA)、?；蛆Z脫氧結(jié)合膽 鹽(TCDCA)。
[0039] 底物專一性性的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。與野生型膽鹽水解酶BSH1相比，膽鹽水解酶 突變體F24A僅對(duì)六種底物中的四種有水解活性，且對(duì)GCDCA和TDCA的相對(duì)酶活降低了 30 % 左右；而突變體蛋白A58Q和F65A都是僅對(duì)六種底物中的五種有水解活性，且A58Q對(duì)GDCA、 G⑶CA、TCA、TDCA都降低了 50 %以上，F(xiàn)65A對(duì)⑶CA的特異性得到顯著提高。以上數(shù)據(jù)表明，本 發(fā)明的突變體F24A、A58Q和F65A的底物專一性和特異性都得到了提高。
[0040]此外，發(fā)明人也對(duì)F130位點(diǎn)進(jìn)行了突變，結(jié)果顯示底物專一性并沒(méi)有發(fā)生改變，對(duì) 這六種底物仍有水解活性。
[0041]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列 如SEQIDN0:2、SEQIDN0:3或者SEQIDN0:4所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5、SEQIDN0:6或者SEQIDN0:7所示。3. 編碼權(quán)利要求1所述膽鹽水解酶突變體的核苷酸片段。4. 含有權(quán)利要求1所述膽鹽水解酶突變體的載體。5. 表達(dá)權(quán)利要求1所述膽鹽水解酶突變體的的基因工程菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為大腸桿菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是pET-20b( + )為載 體、E.coli BL21(DE3)為宿主表達(dá)所述突變體。8. 在一種生產(chǎn)膽鹽水解酶的方法，其特征在于，是利用權(quán)利要求3所述的核苷酸片段、 權(quán)利要求4所述的載體或者權(quán)利要求5-7任一所述的基因工程菌。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是將基因工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集 菌體，并破壁純化獲得;所述破壁純化是收集菌體后，用〇. 1Μ、ρΗ 6.0的磷酸鹽緩沖液洗滌 離心2次，并重懸，超聲破碎5min，離心收集上清液，經(jīng)過(guò)鎳柱親和柱層析和截留分子量為 lOkDa的超濾膜進(jìn)行純化濃縮，獲得單一重組蛋白。10. 權(quán)利要求1-2任一所述膽鹽水解酶突變體，或者權(quán)利要求8-9任一所述方法得到的 膽鹽水解酶在食品、農(nóng)業(yè)或制備藥物方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種底物專一性提高的膽鹽水解酶突變體，屬于酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)定點(diǎn)突變的方式，將來(lái)源于唾液乳酸桿菌的膽鹽水解酶BSH1位于底物結(jié)合口袋中的氨基酸位點(diǎn)酪氨酸(Tyr24)、丙氨酸(Ala58)、苯丙氨酸(Phe65)分別突變成丙氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，改變酶分子與底物之間的疏水相互作用和結(jié)合方式，提高了膽鹽水解酶的底物專一性。改造后的酶蛋白，有利于減少結(jié)合膽鹽水解反應(yīng)中膽酸的生成量，提高乳酸菌的膽鹽耐受性，有助于膽鹽水解酶在調(diào)節(jié)宿主膽汁組成及流量中的應(yīng)用研究。
【IPC分類】C12R1/19, C12N15/70, C12N9/80, C12N15/55, C12N1/21
【公開號(hào)】CN105524907
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610070608
【發(fā)明人】劉松, 堵國(guó)成, 陳堅(jiān), 畢潔
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2016年2月1日