豬3號(hào)染色體上與窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的snp位點(diǎn)及其引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，具體涉及豬3號(hào)染色體上一個(gè)與窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其引物，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀是豬繁殖性狀的主要組成部分，提高豬產(chǎn)仔數(shù)對(duì)提高養(yǎng)豬業(yè)的總體經(jīng)濟(jì)效益意義重大。我國(guó)的太湖豬以高產(chǎn)而聞名，窩產(chǎn)仔數(shù)比大多數(shù)其它中國(guó)地方豬種以及國(guó)外豬種的窩產(chǎn)仔數(shù)多4-5頭(《中國(guó)豬品種志》張仲葛主編，上海科技出版社，1986)。太湖豬中與高產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，能夠作為遺傳標(biāo)記用于提高母豬的產(chǎn)仔數(shù)。
[0003]全基因組重測(cè)序方法已廣泛應(yīng)用于各個(gè)物種的相關(guān)研究，它能夠快速全面地篩選出與性狀、功能相關(guān)的基因或突變位點(diǎn)，彌補(bǔ)了 QTL定位以及候選基因方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、單一等不足。
[0004]在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)本發(fā)明中SNP位點(diǎn)與豬窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的是提供豬3號(hào)染色體上一個(gè)與窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其引物。
[0006]本發(fā)明選擇了二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，及滇南小耳豬5個(gè)中國(guó)地方豬種以及野豬進(jìn)行了全基因組重測(cè)序。6個(gè)豬種的重測(cè)序個(gè)體數(shù)分別為11個(gè)，11個(gè)，9個(gè)，10個(gè)，10個(gè)和10個(gè)。重測(cè)序數(shù)據(jù)跟參考基因組(NCBI Build Sscrofa 10.2)進(jìn)行比對(duì)，利用SAMTools軟件進(jìn)行SNPs位點(diǎn)的提取。發(fā)明人比較了二花臉豬與其它5個(gè)豬種，在3號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)(基因組版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr3:59537592)與豬的產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。該位點(diǎn)的等位基因?yàn)門(mén)和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型。
[0007]篩選到該位點(diǎn)后，發(fā)明人在白色杜洛克X二花臉豬雜交資源群內(nèi)代母豬個(gè)體中對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證和相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與豬產(chǎn)仔數(shù)有顯著相關(guān)性。
[0008]本發(fā)明的有益效果在于:全基因組重測(cè)序方法能夠快速、批量地篩選與性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)或基因，基因組版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr3:59537592這個(gè)SNP位點(diǎn)能夠作為遺傳標(biāo)記用于豬的遺傳育種提高母豬的產(chǎn)仔數(shù)。
【附圖說(shuō)明】
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[0009]圖1為白色杜洛克X二花臉豬F2代母豬資源群中Chr3:59537592位點(diǎn)3種基因型的產(chǎn)仔數(shù)比較(圖中兩種基因型產(chǎn)仔數(shù)比較時(shí)，*表示0.01 ^ P ^ 0.05;林表示P<0.01)。
具體實(shí)施方案:
[0010](I) SNP位點(diǎn)的群體分布特征
[0011]本發(fā)明選擇二花臉豬(太湖豬的一種)，藏豬，巴馬香豬，萊蕪豬，及滇南小耳豬5個(gè)中國(guó)地方豬種以及野豬進(jìn)行了全基因組重測(cè)序。6個(gè)豬種的重測(cè)序個(gè)體數(shù)分別為11個(gè)，11個(gè)，9個(gè)，10個(gè)，10個(gè)和10個(gè)。重測(cè)序數(shù)據(jù)跟參考基因組(NCBI Build Sscrofa 10.2)進(jìn)行比對(duì)，利用SAMTools軟件進(jìn)行SNPs位點(diǎn)的提取。發(fā)明人比較了二花臉豬與其它5個(gè)豬種，在3號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn)(基因組版本NCBI Build Sscrofa 10.2的Chr3:59537592)與豬的產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)。從重測(cè)序的分析結(jié)果來(lái)看，其它4個(gè)中國(guó)地方豬種和野豬中該位點(diǎn)等位基因C的頻率平均為84.2%，而在二花臉豬中等位基因T的頻率為100%。
[0012](2)SNP位點(diǎn)的鑒定
[0013]在引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)SNAPSHOT引物，包括一對(duì)PCR擴(kuò)增引物(Chr3-1_PCRU: 5 ’ -TTGGTC CTC AGT CAT GTG G-3，；Chr3_卜PCRL:5，-AAC CTC TTC CCT TGA CCT GA-3’)和延伸引物(Chr3-1-SNPU:5’-TGA CTA GTA GGC AGG CAA GAA CAT TCA GAG-3’)。該位點(diǎn)與其它11個(gè)位點(diǎn)共24條(12對(duì))引物各取Ιμ?混合為新的多重PCR弓丨物池。首先進(jìn)行12重PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系所用試劑為:多重 PCR 引物池(6.25μΜ each)8yl、dNTP(10mM each)8yl、10 X PCRBuffer II 116μ1、MgCl2(25mM Stock)234yl、Fast Start Taq(5U/yl)24μ1和ddH20 460μ1，將以上試劑混合液8.5μ1和1.5μ1 DNA(50ng/yl)混合成IΟμ?體系進(jìn)行12重PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C 4min；94°C 30s,55°C 30s,72°C Imin，共40個(gè)循環(huán)。下一步進(jìn)行PCR反應(yīng)純化，所需試劑為:Exo I(10U/yl)60yKSAP(lU/yl)130yK10XSAP Buffer 35μ1 和ddH20 125μ1，在每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物中加入3.5μ1上述純化混合液離心后按以下程序進(jìn)行反應(yīng):37°C 40min，96°C I Omin。然后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，所需試劑為:SNAPSHOTMultiplex ready react1n Mix 100μ1、延伸引物池(6.25μΜ each，12條延伸引物各取Ιμ?混合)8μ1、5 X Sequencing Buffer 200μ1 和ddH20 300μ1，將以上試劑混合液6μ1 和4μ1 的純化產(chǎn)物混合成10μ1體系進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)條件為:96°C 10s,50°C 5s，60°C 30s，共25個(gè)循環(huán)。接著進(jìn)行延伸反應(yīng)產(chǎn)物的純化，所需試劑為:SAP(lU/yl )120μ1、10 X SAP Buffer70μ1和ddH20 140μ1，在每個(gè)樣品的延伸反應(yīng)產(chǎn)物中加入上述3.3μ1純化混合液離心后按以下程序進(jìn)行反應(yīng):37 °C 40min，75°C 20min，4°C保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)樣品取5_4μ1上述純化后的SNAPSHOT反應(yīng)產(chǎn)物和5-6μ1的高純甲酰胺(H1-Di Formamide)混合成10μ1體系離心后上樣于ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行基因分型，使用GeneMarker軟件分析分型結(jié)果。
[0014](注:以上4個(gè)步驟的反應(yīng)試劑混合液用量均為100個(gè)樣品所需試劑量，從單堿基延伸反應(yīng)開(kāi)始，需要避光進(jìn)行。)
[0015](3)白色杜洛克X 二花臉豬繁殖性能雜交資源群構(gòu)建
[0016]后續(xù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用資源群個(gè)體樣品及其性狀數(shù)據(jù)由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地提供。
[0017]1998年12月，在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研豬場(chǎng)將從江蘇省3個(gè)二花臉豬保種場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的二花臉母豬進(jìn)行場(chǎng)間血緣的交叉配種。2001年I月根據(jù)親本產(chǎn)仔性能，從3頭公豬和11頭母豬的純繁后代中選擇了 17頭二花臉母豬作為資源群體的祖代母本。把Sygen PIC公司惠贈(zèng)的2頭優(yōu)質(zhì)白色杜洛克公豬作為資源家系的祖代父本。將這2頭白色杜洛克和17頭二花臉豬雜交產(chǎn)生的^代個(gè)體進(jìn)行配種，避免全同胞交配，且每頭公豬通常與同一頭母豬配種，以獲得大樣本的內(nèi)半同胞家系。2003年I月、3月和6月，項(xiàng)目組分別將第I批和第2批&母豬送往江西省宜春市畜牧良種場(chǎng)(59頭)、江西省國(guó)營(yíng)紅星種豬場(chǎng)(52頭)和江西上猶縣四元雜交豬場(chǎng)(118頭)用于母豬繁殖性狀的測(cè)定。
[0018](4)SNP位點(diǎn)在雜交資源群F2R母豬群體的基因分型
[0019]按照上述步驟(2)所述的方法，以192個(gè)白色杜洛克X二花臉豬雜交資源群F2代母豬個(gè)體DNA為模板檢測(cè)該SNP位點(diǎn)的基因型。192fF2代資源群個(gè)體中有176個(gè)個(gè)體成功分型，3種基因型C/C，T/C和T/T的個(gè)體數(shù)分別是60，84和32。
[0020](5) SNP位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)仔數(shù)性狀的調(diào)控效應(yīng)
[0021]在F2代資源群個(gè)體中，帶有C/C基因型個(gè)體的平均產(chǎn)仔數(shù)為10.5507，標(biāo)準(zhǔn)差為
0.7672 ；帶有T/C基因型個(gè)體的平均產(chǎn)仔數(shù)為11.595，標(biāo)準(zhǔn)差為0.7568 ；帶有T/T基因型個(gè)體的平均產(chǎn)仔數(shù)為10.9155，標(biāo)準(zhǔn)差為0.8394。
[0022]本發(fā)明采用一般線性模型(GLM)分析了SNP位點(diǎn)對(duì)豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的影響。全部統(tǒng)計(jì)分析采用SAS軟件進(jìn)行。模型如下:
[0023]Yijkim=u+Ai+Gj+Bk+Pi+eijkim
[0024]其中Yijkim為豬總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)，u為群體均值，Ai為第i個(gè)個(gè)體的加性效應(yīng)，Gj為第j個(gè)SNP位點(diǎn)基因型的固定效應(yīng)，Bk為批次效應(yīng)(k= 1,2,3,4), Pi為隨機(jī)效應(yīng)(I = I，2，3)0
[0025]分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Chr3:59537592這個(gè)SNP位點(diǎn)跟產(chǎn)仔數(shù)有顯著相關(guān)性。帶有T/C基因型的F2代母豬的產(chǎn)仔數(shù)比帶有C/C基因型的母豬平均多1.04(P = 0.0181)，從圖1看出，帶有C/C基因型的母豬產(chǎn)仔數(shù)最低。T為提高豬產(chǎn)仔數(shù)的有益等位基因并且T/C雜合豬產(chǎn)仔數(shù)最尚O
[0026]從SNP位點(diǎn)與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性分析看出，Chr3:59537592這個(gè)SNP位點(diǎn)能夠作為分子標(biāo)記應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)來(lái)提高母豬的產(chǎn)仔數(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.豬3號(hào)染色體上一個(gè)與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)在白色杜洛克X 二花臉豬雜交資源群F2代母豬產(chǎn)仔數(shù)分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用，其特征在于:所述SNP位點(diǎn)的等位基因?yàn)門(mén)和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型，帶有C/C基因型的母豬產(chǎn)仔數(shù)最低，T為提高豬產(chǎn)仔數(shù)的有益等位基因并且T/C雜合豬產(chǎn)仔數(shù)最高。2.—種檢測(cè)權(quán)利要求1中所述SNP位點(diǎn)的引物在白色杜洛克X 二花臉豬雜交資源群F2R母豬產(chǎn)仔數(shù)分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用，其特征在于:所述引物的核苷酸序列如下所示:Chr3-1-PCRU:5'-TTG GTC CTC AGT CAT GTG G_3’；Chr3-1-PCRL:5'-AAC CTC TTC CCT TGA CCT GA_3’； Chr3-1-SNPU:5’-TGA CTA GTA GGC AGG CAA GAA CAT TCA GAG-3’，所述SNP位點(diǎn)帶有C/C基因型的母豬產(chǎn)仔數(shù)最低，T為提高豬產(chǎn)仔數(shù)的有益等位基因并且T/C雜合豬產(chǎn)仔數(shù)最高。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)，具體涉及豬3號(hào)染色體上一個(gè)與窩產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)及其引物，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。該SNP位點(diǎn)為基因組版本NCBI？Build？Sscrofa？10.2的Chr3:59537592；該位點(diǎn)的等位基因?yàn)門(mén)和C，有C/C、T/C和T/T三種基因型，擴(kuò)增該位點(diǎn)的引物及延伸引物為：Chr3-1-PCRU：5’-TTG？GTC？CTC？AGT？CAT？GTG？G-3’；Chr3-1-PCRL：5’-AAC？CTC？TTC？CCT？TGA？CCT？GA-3’；Chr3-1-SNPU：5’-TGA？CTA？GTA？GGC？AGG？CAA？GAA？CAT？TCA？GAG-3’。帶有T/C基因型的豬產(chǎn)仔數(shù)高于C/C基因型,T為提高豬產(chǎn)仔數(shù)的有益等位基因并且T/C雜合豬產(chǎn)仔數(shù)最高。本發(fā)明的有益效果在于：全基因組重測(cè)序方法能夠快速、批量地篩選與性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)或基因，基因組版本NCBI？Build？Sscrofa？10.2的Chr3:59537592這個(gè)SNP位點(diǎn)能夠作為遺傳標(biāo)記用于豬的遺傳育種提高母豬的產(chǎn)仔數(shù)。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105603065
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610003243
【發(fā)明人】張亞平, 黃路生, 謝海兵, 任軍, 艾華水, 徐丹
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所, 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2016年1月4日