一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤生物治療發(fā)展迅速，目前有大量疫苗進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，腫瘤疫苗包括腫瘤細(xì)胞疫苗，腫瘤相關(guān)抗原疫苗，核酸疫苗及相關(guān)活性免疫細(xì)胞疫苗等，但是由于免疫逃逸等因素，蛋白抗原或抗原肽等單一抗原成分的疫苗在臨床上很難體現(xiàn)顯著療效。
[0003]腫瘤全細(xì)胞來(lái)源的腫瘤抗原組分多樣，但是由于腫瘤細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制完善，只能保留容易誘發(fā)免疫耐受的長(zhǎng)壽蛋白抗原，且在自身免疫系統(tǒng)中很容易形成對(duì)這些抗原的耐受，缺乏目前研究認(rèn)為的可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的短壽蛋白等組分?，F(xiàn)有技術(shù)的自噬小體來(lái)源的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)了一定的腫瘤抑制效果，但在臨床應(yīng)用中由于人體免疫機(jī)制及個(gè)體發(fā)病差異，自噬小體疫苗的臨床效果仍有可提高的空間。
[0004]自噬小體疫苗可以有效的誘導(dǎo)CD8T效應(yīng)細(xì)胞靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)。自噬小體疫苗主要是一種藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞而得到的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，我們用雷帕霉素或氯化銨誘導(dǎo)自噬形成，同時(shí)用蛋白酶體抑制劑抑制某些有效抗原蛋白的降解，從而富集得到一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)，富含自噬小體，大小約100-900 nm的囊泡結(jié)構(gòu)的疫苗。
[0005]目前的研究中，認(rèn)為HSP704Q7-426具有一定的免疫活化功能，可以協(xié)助免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別和遞呈，轉(zhuǎn)化T細(xì)胞應(yīng)答的類型等。不斷增加自噬小體疫苗在現(xiàn)有工作中有限的抗腫瘤效果，提高免疫應(yīng)答效率，是未來(lái)腫瘤疫苗研究需要解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的提供一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗制備方法，包括自噬小體疫苗的制備和HSP70407-426修飾，經(jīng)過(guò)該方法制備的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗比現(xiàn)有的自噬小體疫苗有更強(qiáng)的激活抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力，且具有更強(qiáng)的抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)的能力。
[0007]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是這樣的，1、一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，包括如下步驟:
步驟I，將經(jīng)培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞在含有氯化銨及硼替佐米的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，誘導(dǎo)自噬小體的形成;24-48小時(shí)后，收集全部的細(xì)胞培養(yǎng)物，4°C下先經(jīng)1500rpm離心10分鐘，去除大顆粒細(xì)胞雜質(zhì)，收集離心上清;再將收集的上清經(jīng)12000rpm離心15分鐘;得到的沉淀經(jīng)緩沖液洗滌，再次經(jīng)12000rpm離心15分鐘;收集沉淀并懸浮在緩沖液中，電鏡下觀察其結(jié)構(gòu)為100-900nm的小泡結(jié)構(gòu)，即為自噬小體疫苗；
步驟2，將自噬小體疫苗中的蛋白終濃度調(diào)整為lmg/ml，與濃度為lmg/ml化學(xué)合成的HSP704Q?-426肽段混合，緩慢加入戊二醛，持續(xù)攪拌下，在4°C中反應(yīng)3-4小時(shí)；12000rpm離心15分鐘去除上清中多余的戊二醛，得到的沉淀就是經(jīng)過(guò)HSP70407-426修飾后的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗;疫苗重懸在凍存保護(hù)液中，分裝后凍存于_80°C冰箱或液氮中備用。
[0008]本發(fā)明還提供一種采用上述方法制備的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗。
[0009]本發(fā)明制備的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗強(qiáng)化抗原免疫原性原理為:硼替佐米及氯化銨為蛋白酶體抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑，可以抑制溶酶體中蛋白酶對(duì)短壽蛋白的降解，而SLiPs、DRiPs作為MHC-1類抗原可以有效被抗原遞呈細(xì)胞識(shí)別，交叉遞呈至CD8+T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性CD8 + T淋巴細(xì)胞活化，在維持了腫瘤抗原優(yōu)勢(shì)的情況下，自噬小體疫苗再經(jīng)HSP70407-426修飾后，HSP70407-426作為免疫激活分子，進(jìn)一步加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，達(dá)到更強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。
[0010]有益效果:本發(fā)明的抗腫瘤的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗是基于以硼替佐米及氯化銨誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)短壽蛋白和缺損的核糖體產(chǎn)物作為抗原蛋白，這些抗原通過(guò)自噬途徑進(jìn)入雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，收集分泌至胞外的自噬小體而得到自噬小體疫苗，經(jīng)HSP704Q7-426修飾后，得到本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，其比現(xiàn)有的自噬小體疫苗有更強(qiáng)的激活抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的能力，且具有更強(qiáng)的抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)的能力。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗與已有的疫苗抑制腫瘤生長(zhǎng)的對(duì)比圖；
圖2為本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗與已有的疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，包括如下步驟:
步驟I，將經(jīng)培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞在含有氯化銨及硼替佐米的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，誘導(dǎo)自噬小體的形成;24-48小時(shí)后，收集全部的細(xì)胞培養(yǎng)物，4°C下先經(jīng)1500rpm離心10分鐘，去除大顆粒細(xì)胞雜質(zhì)，收集離心上清;再將收集的上清經(jīng)12000rpm離心15分鐘;得到的沉淀經(jīng)緩沖液洗滌，再次經(jīng)12000rpm離心15分鐘;收集沉淀并懸浮在緩沖液中，電鏡下觀察其結(jié)構(gòu)為100-900nm的小泡結(jié)構(gòu)，即為自噬小體疫苗；
步驟2，將自噬小體疫苗中的蛋白終濃度調(diào)整為lmg/ml，與濃度為lmg/ml化學(xué)合成的HSP704Q?-426肽段混合，緩慢加入戊二醛，持續(xù)攪拌下，在4°C中反應(yīng)3-4小時(shí)；12000rpm離心15分鐘去除上清中多余的戊二醛，得到的沉淀就是經(jīng)過(guò)HSP70407-426修飾后的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗;疫苗重懸在凍存保護(hù)液中，分裝后凍存于_80°C冰箱或液氮中備用。
[0013]應(yīng)用實(shí)施例1以小鼠Lewis肺癌為模型，驗(yàn)證實(shí)施例1所制備的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗在小鼠肺癌治療中的作用
首先建立小鼠肺癌模型，將0.5-1 X 16個(gè)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞皮下接種于小鼠左前肢附近腋下，待腫瘤生長(zhǎng)I周后，基本可以觸到約綠豆大小的皮下移植瘤。
[0014]建模成功后，每組5只，隨機(jī)將小鼠分為空白對(duì)照組，HSP7040?-426組，自噬小體疫苗組(實(shí)施例1中步驟I所制備的自噬小體疫苗)，經(jīng)HSP704Q7-426+修飾后自噬小體疫苗組(實(shí)施例I所制備的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗)以及腫瘤全細(xì)胞疫苗組，不同組的小鼠分別在腹股溝淋巴結(jié)注射蛋白量為20yg的疫苗，此后，每2天在相同時(shí)間用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤細(xì)胞大小，觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖1所示，經(jīng)HSP70407-426修飾的自噬小體疫苗能更好的抑制小鼠肺癌生長(zhǎng)。
[0015]待免疫2-3周后，處死小鼠，取出小鼠脾臟，制成單細(xì)胞懸液，以自噬小體疫苗為抗原刺激脾細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中小鼠T細(xì)胞表達(dá)IFN- γ的水平，結(jié)果如圖2所示，HSP70407-426修飾的自噬小體疫苗有更強(qiáng)的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟I，將經(jīng)培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞在含有氯化銨及硼替佐米的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，誘導(dǎo)自噬小體的形成;24-48小時(shí)后，收集全部的細(xì)胞培養(yǎng)物，4°C下先經(jīng)1500rpm離心10分鐘，去除大顆粒細(xì)胞雜質(zhì)，收集離心上清;再將收集的上清經(jīng)12000rpm離心15分鐘;得到的沉淀經(jīng)緩沖液洗滌，再次經(jīng)12000rpm離心15分鐘，收集沉淀并懸浮在緩沖液中；電鏡下觀察其結(jié)構(gòu)為100-900nm的小泡結(jié)構(gòu)，即為自噬小體疫苗； 步驟2，將自噬小體疫苗中的蛋白終濃度調(diào)整為lmg/ml，與濃度為lmg/ml化學(xué)合成的HSP704Q?-426肽段混合，緩慢加入戊二醛，持續(xù)攪拌下，在4°C中反應(yīng)3-4小時(shí)；12000rpm離心15分鐘去除上清中多余的戊二醛，得到的沉淀即為亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗;疫苗重懸在凍存保護(hù)液中，分裝后凍存于-80°C冰箱或液氮中備用。2.一種如權(quán)利要求1所述方法制備的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗及其制備方法<b>，</b>本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗是基于以硼替佐米及氯化銨誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)短壽蛋白和缺損的核糖體產(chǎn)物作為抗原蛋白，通過(guò)自噬途徑進(jìn)入雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體中，收集這樣包裹腫瘤抗原的自噬小體，再經(jīng)HSP70免疫激活肽段修飾，修飾后的自噬小體即為本發(fā)明的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗，將疫苗經(jīng)淋巴結(jié)給藥可以有效誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)的交叉遞呈，激活CD4+、CD8+？T淋巴細(xì)胞及CTL細(xì)胞，達(dá)到更好的腫瘤殺傷的作用。
【IPC分類】A61K47/48, A61K39/00, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105641712
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】邢蕓, 曹榮月, 胡紅明, 周鎮(zhèn)先
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年2月29日