雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種抗氧化活性肽，具體涉及一種雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]鯊魚全身是寶，有的種類肉質(zhì)鮮美，是餐桌上常見的菜肴。魚皮具有良好的韌性，是皮革加工業(yè)的原料?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明鯊魚軟骨具有很大的藥用價值，1992年美國首先將鯊魚軟骨粉直接用于臨床治療腫瘤。雙髻鯊(Sphyrna lewini)為軟骨魚綱，真鯊目，雙髻鯊科，在我國主要分布于黃海、東海和南海。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用的雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽。
[0004]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽:抗氧化肽為十肽化合物，氨基酸序列為Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly，ES1-MS測定分子量為950.03 Da
該雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法為:
I)雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取雙髻鯊軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的雙髻鯊軟骨浸于4?6倍體積的1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA，pH 7?8)，于4 °C下攪拌抽提36?48 h。提取液在4 °C下以4000?6000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續(xù)在4°C、10000?12000 r/min離心15?25 1^11，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)。將濾液裝入分子截留量為8000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4°C下透析24?48h，透析袋內(nèi)溶液即為雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0005]2)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物在冰浴下緩慢加入預(yù)冷丙酮至丙酮濃度為30%，在_20°C下靜置4?6h后，于4°C、10000?12000 r/min高速離心20min，取上清液，加入預(yù)冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得雙髻鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，即為60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0006]3)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取雙髻鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig: 3?5 mL溶于Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L，pH 7.5?8.5)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.0?3.0%加入胰蛋白酶(1.9 X 14 U/g)，于40°C酶解3?5h，然后于90°C、1min滅酶活，酶解液于4°C、10000?12000 r/min離心15?25 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0007]4)雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，凍干，得超濾酶解物;將超濾酶解物次經(jīng)離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0008]作為優(yōu)選，所述的步驟I)中的雙髻藍為雙髻藍(Sphyrna Iewini)。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟4)的離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述超濾酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為45?55 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據(jù)對DPPH自由基和羥基自由基的清除活性得I個高活性抗氧化肽Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)，ESI_MS測定分子量為950.03 Da0
[0010]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進樣量10?15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX
4.6mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.6~1.0 mL/min;紫外檢測波長280 nm。
[0011]本發(fā)明還提供雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的用途:由于其具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優(yōu)點，因而可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用;Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優(yōu)點，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明的DEAE-52離子交換樹脂層析圖。
[0014]圖2是本發(fā)明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0015]圖3葡聚糖凝膠SephadexG-15制備酶解物的RP-HPLC^H
[0016]圖4Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)的質(zhì)譜圖。
[0017]圖5Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)的抗脂質(zhì)氧化能力。
【具體實施方式】
[0018]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0019]實施例:
一種雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:雙髻鯊軟骨—軟骨總蛋白—軟骨60%丙酮沉淀蛋白—胰蛋白酶酶解—酶解物—超濾—離子交換層析—凝膠過濾層析4高效液相色譜制備4抗氧化肽。
[0020]I)雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物的制備:稱取雙髻鯊(Sphyrna lewini)軟骨切成小碎塊，加入適量蒸餾水，在高速組織搗碎機中勻漿至糊狀，將糊狀的雙髻鯊軟骨浸于4倍體積的 1.0 mol/L鹽酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA’pH 7.0)，于4 °C下攪拌抽提48 h。提取液在4 °C下以5000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液;上清液繼續(xù)在4 0C ,12000 r/min離心20 min，取上清液用0.22 μπι微孔濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)。將濾液裝入分子截留量為8 000的透析袋中，用Tris-HCKpH 7.6)緩沖液于4 °C下透析48 h，透析袋內(nèi)溶液即為雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物。
[0021]2)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的制備:取雙髻鯊軟骨總蛋白粗提物，在冰浴下緩慢加入預(yù)冷丙酮至丙酮濃度為30%，在-20 °C下靜置5 h后，于4 0CaOOOO r/min高速離心20 min，取上清液，加入預(yù)冷丙酮至溶液最終丙酮濃度為60%，獲得雙髻鯊軟骨60%丙酮沉淀蛋白，凍干，得60%丙酮分級沉淀蛋白。
[0022]3)雙髻鯊軟骨丙酮分級沉淀蛋白的酶解:取雙髻鯊軟骨60%丙酮分級沉淀蛋白按照料液比Ig:4mL溶于Tris-鹽酸緩沖液(0.05mol/L，pH 8.0)，按照60%丙酮分級沉淀蛋白重量的2.5%加入胰蛋白酶(1.9\1041]/^)，于40 °C酶解4 h，然后于90 °C、10 min滅酶活，酶解液于4 0C ,12000 r/min離心20 min，棄殘渣收集上清液，得軟骨蛋白酶解液。
[0023]4)雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分(SP60-1)，得到超濾酶解液，將超濾酶解液依次經(jīng)離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得抗氧化肽。
[0024]①離子交換樹脂層析:將SP60-1溶于雙蒸水配成濃度為50mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52離子交換樹脂層析柱，用水、0.1 mol/L,0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速為0.6 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥自由基清除能力，選擇抗氧化能力最強組分凍干，即為離子交換層析酶解物SP60-3(圖1);
②凝膠柱層析:將SP60-3溶于雙蒸水配成濃度為50mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.6?0.8 mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于280 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的DPPH自由基和羥自由基清除能力，選擇抗氧化能力最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物SP60-3-1 (圖2);
③RP-HPLC純化:將SP60-3-1用雙蒸水配成80?100yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(RP-HPLC條件為:進樣量 15 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?32min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.8 mL/min;紫外檢測波長280 nm)，根據(jù)對DPPH自由基和羥自由基的清除活性得I個高活性抗氧化肽DCPE-B(圖3)。
[0025]④結(jié)構(gòu)檢測:收集DPPH自由基和羥自由基清除活性最高的抗氧化肽DCPE-B，經(jīng)RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Gly-Phe-Thr-Gly-Pr0-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNG)，ESI_MS測定分子量為950.03 Da([M+H]+ 951.24Da)(圖 4)0
[0026]將制得的雙髻藍軟骨蛋白抗氧化肽Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly(GFTGPPGFNG)進行自由基清除實驗和脂質(zhì)過氧化抑制實驗，實驗結(jié)果表明:Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly (GFTGPPGFNGW^DPPH 自由基(EC5Q 2.76 mg/mL)、羥基自由基(EC50 0.22 mg/mL)、ABTS自由基(EC50 0.08 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC50 0.13mg/mL)具有良好的清除作用；同時，Gly-Phe-Thr-Gly-Prο-Prο-Gly-Phe-Asn-Gly(GFTGPPGFNG)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用(圖5 )。
[0027]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽，其特征在于:該抗氧化肽為十肽化合物，氨基酸序列為Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly，ESI_MS測定分子量為950.03 Da02.雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的用途，其特征在于:該抗氧化肽用于制備抗氧化保健食品或食品或食品添加劑的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙髻鯊軟骨蛋白抗氧化肽的制備方法。本發(fā)明以雙髻鯊軟骨為原料，通過總蛋白提取、丙酮分級沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly，ESI-MS測定分子量為950.03？Da；制備的高活性抗氧化肽具有較強的自由基清除活性和良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用，可以作為藥品、保健食品或食品添加劑等進行開發(fā)。
【IPC分類】C07K1/20, C07K1/16, C07K1/36, C07K7/06, C07K1/34, C07K1/18, C12P21/06
【公開號】CN105646657
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】王斌, 李雪榮, 趙玉勤, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年12月31日