一種基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨缺損是臨床治療常見的棘手病癥，每年都有數(shù)以萬計(jì)的病例由于遺傳、腫瘤、創(chuàng)傷、感染等原因而導(dǎo)致缺損需要進(jìn)行骨修復(fù)治療。對(duì)于骨組織修復(fù)材料的構(gòu)建，不但要滿足與天然骨組織力學(xué)性能的匹配性，還要能確保植入體內(nèi)的組織工程材料能長期穩(wěn)固并行使骨修復(fù)能力。因此，運(yùn)用再生醫(yī)學(xué)、組織工程和微納制造的基本原理設(shè)計(jì)新型人工合成材料，從而更好地行使再生、修復(fù)并重建骨缺損的功能，并表現(xiàn)更優(yōu)異的骨誘導(dǎo)性和骨整合能力，是骨缺損修復(fù)的新方法和發(fā)展趨勢。
[0003]天然骨是一種由模板蛋白分子介導(dǎo)鈣磷礦物沉積，進(jìn)而組裝成一種多層級(jí)的生物礦化復(fù)合物，具有獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)和完美的性能。在超微納尺寸上，兩種不同形態(tài)的骨-松質(zhì)骨和密質(zhì)骨均是由礦化膠原以纖維束的形式，逐層平行排列或同心圓排列等形式呈現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)納米骨修復(fù)材料與生物體的匹配性，材料的設(shè)計(jì)不但要從成分組成上接近天然骨，還要從微納結(jié)構(gòu)上模擬天然骨的層級(jí)有序排列，從而實(shí)現(xiàn)植入生物材料的高度仿生。因此，構(gòu)建具有仿生微圖案有序結(jié)構(gòu)的納米骨材料，是骨組織工程研究和臨床應(yīng)用的新策略，也是對(duì)現(xiàn)有納米骨修復(fù)材料僅僅是單一骨的組分模擬研究進(jìn)行了補(bǔ)充，更使得圖案結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了從二維平面到三維支架的突破。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜及其制備方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]—種基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜，其特征在于，所述人工仿生骨膜包括微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層以及在微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層上交聯(lián)固化的高分子有機(jī)物。
[0007]上述方案中，所述微圖案為直條紋、環(huán)狀條紋和網(wǎng)狀條紋中的一種。
[0008]上述方案中，所述微圖案化仿生礦化鈣磷納米顆粒層，其原料組分中，除了仿生礦化鈣磷納米顆粒，還可以包括有利于細(xì)胞粘附的高分子、促成骨生長相關(guān)的生長因子、和/或抗炎癥藥物。
[0009]上述方案中，所述高分子有機(jī)物為膠原蛋白、明膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸/乙醇酸(PLGA)、聚氨酯(PU)和聚碳酸酯(PC)中的一種。
[0010]上述方案中，所述惰性基底為玻片、硅片、石英片和PDMS膠中的一種。
[0011]上述基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0012](I)微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層的制備:
[0013]以蛋白質(zhì)、多糖或合成分子為礦化模板，加入鈣、磷鹽后，仿生礦化共沉積、自組裝制備得到仿生礦化鈣磷納米顆粒；將仿生礦化鈣磷納米顆粒分散于水中配置成仿生礦化鈣磷納米顆粒水懸液；通過負(fù)光刻膠光刻在硅片上制備微圖案陣列，通過PDMS膠倒模成二級(jí)印章，隨后再用瓊脂糖倒模形成可親水的、軟性的瓊脂糖微圖案印章；在瓊脂糖微圖案印章表面滴加或涂覆仿生礦化鈣磷納米顆粒水懸液，形成均勻的薄層并晾半干后，采用微接觸法影印在惰性基底表面，揭除瓊脂糖凝膠后得到微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層；或
[0014]以蛋白質(zhì)、多糖或合成分子為礦化模板，將礦化模板分散于水中配置成礦化模板水懸液；通過負(fù)光刻膠光刻在硅片上制備微圖案陣列，通過PDMS膠倒模成二級(jí)印章，隨后再用瓊脂糖倒模形成可親水的、軟性的瓊脂糖微圖案印章；在瓊脂糖微圖案印章表面滴加或涂覆礦化模板水懸液，形成均勻的薄層并晾半干后，采用微接觸法影印在惰性基底表面，揭除瓊脂糖凝膠后得到微圖案化的礦化模板層，然后在礦化模板上仿生礦化共沉積制備仿生礦化鈣磷納米顆粒，得到微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層；
[0015](2)在微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層上覆蓋高分子溶液，充分交聯(lián)固化后，揭除惰性基底，得到基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜。
[0016]上述方案中，所述作為礦化模板的蛋白質(zhì)為膠原蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、纖連蛋白、層連蛋白、骨唾液酸蛋白、絲素蛋白和血清蛋白中的一種或幾種；所述作為礦化模板的多糖為氨基聚糖、蛋白聚糖和殼聚糖中的一種或幾種；所述作為礦化模板的合成分子為合成兩性肽分子和合成兩性自組裝分子中的一種或幾種。
[0017]上述方案中，步驟(2)所述交聯(lián)固化所采用的具體方法為:紫外照射5?20min、或加入交聯(lián)劑于40°C條件下反應(yīng)1min?120min。
[0018]上述方案中，步驟(I)所述仿生礦化共沉積、自組裝制備得到仿生礦化鈣磷納米顆粒的具體操作步驟為:在礦化模板溶液中加入含有鈣離子的溶液，混合均勻，逐滴加入含有磷酸根離子的溶液，并同時(shí)滴加堿溶液調(diào)整PH值為7?8之間，置于37°C水浴中攪拌并陳化后，用超純水抽濾或離心清洗所得沉淀，凍干研磨后得到仿生礦化鈣磷納米顆粒。
[0019]上述方案中，步驟(I)所述在微圖案化的礦化模板上仿生礦化共沉積制備仿生礦化鈣磷納米顆粒，得到微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層的具體操作步驟為:將模擬體液或者含有氯化鈣的DPBS緩沖溶液滴加在微圖案化的礦化模板層表面，覆蓋浸沒并置于37°C水浴中陳化后，待礦化模板上仿生礦化沉積出仿生礦化鈣磷納米顆粒，用超純水清洗除去DPBS緩沖溶液即得到微圖案化的仿生礦化鈣磷納米顆粒層。
[0020]本發(fā)明的有益效果如下:⑴本發(fā)明所述仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜，不僅從材料成分上模擬天然骨的組成，更從在結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)了微納尺度上的高度仿生，從納米尺度上模擬礦化骨膠原的自組裝，從微米尺寸上模擬天然骨組織材料的有序結(jié)構(gòu)，所述人工仿生骨膜可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分布，可使細(xì)胞高效限定在鈣磷顆粒微圖案表面并實(shí)現(xiàn)高度有序取向排列；(2)本發(fā)明所述人工仿生骨膜具有良好的組織相容性、低免疫原性、可降解能力以及優(yōu)異的機(jī)械性能，同時(shí)還具有高效的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)能力；(3)本發(fā)明所述人工仿生骨膜可直接包覆于骨折/缺損區(qū)域，應(yīng)用于骨不連的治療；亦可方便地卷成桶裝，應(yīng)用于骨缺損區(qū)域的直接填充，具有較好的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0021]圖1為仿生礦化鈣磷納米顆粒透射電鏡(TEM)照片。
[0022]圖2為仿生礦化鈣磷納米顆粒以直條紋狀規(guī)則排列于惰性基底表面的熒光和明場圖片。
[0023]圖3為仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜的熒光和明場圖。
[0024]圖4為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明所述仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜上生長并高度有序取向排列的熒光圖片，a細(xì)胞核；b細(xì)胞骨架；c納米骨顆粒；d明場。
[0025]圖5為仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案示意圖，其中I為直條紋，2為網(wǎng)狀條紋，3為環(huán)狀條紋。
【具體實(shí)施方式】
[0026]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0027]實(shí)施例1
[0028]—種基于仿生礦化鈣磷納米顆粒微圖案化的人工仿生骨膜，通過如下方法制備得到:
[0029](I)在0.05M、200ml的Ca (NO3) 2溶液中，加入20ml用0.5M乙酸溶解、濃度為5mg/ml的膠原蛋白溶液，逐滴加120ml、0.05M的(NH4)2HPO4溶液，并同時(shí)滴加IM的NaOH溶液調(diào)整PH值為7?8之間，置于37°C水浴中攪拌2h、陳化2天后，用超純水抽濾