遠(yuǎn)緣雜交小麥的ssr分子標(biāo)記引物及用途和篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小麥遺傳育種領(lǐng)域，尤其涉及一種遠(yuǎn)緣雜交小麥的SSR分子標(biāo)記引物 及其用途和篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥赤霉?。‵HB)主要是由小麥感染禾谷鐮刀菌引起的。它多發(fā)生在溫暖濕熱的 地區(qū)。由于近十年來(lái)空氣污染帶來(lái)的全球氣候變暖，小麥赤霉病的受害面積逐年擴(kuò)大，使得 小麥產(chǎn)量降低。在我國(guó)，小麥作為僅次于水稻的主要糧食作物，歷年種植面積為全國(guó)耕地 總面積的22-30%和糧食作物總面積的20-27%，分布遍及全國(guó)各?。ㄊ?、區(qū)）。小麥赤霉 病在我國(guó)長(zhǎng)江中下游和華南冬麥區(qū)及東北東部春麥區(qū)尤為嚴(yán)重，近年在黃河流域及其它地 區(qū)也偶有發(fā)生。近年來(lái)，小麥赤霉病在國(guó)內(nèi)有向北方麥區(qū)擴(kuò)展的趨勢(shì)，我國(guó)有三分之二的省 份發(fā)生赤霉病，嚴(yán)重流行時(shí)，受害面積超過(guò)700萬(wàn)公頃。
[0003] 培育赤霉病抗性品種是目前防治小麥赤霉病危害的最有效的手段之一。導(dǎo)致小麥 赤霉病發(fā)生發(fā)展的因素很多。環(huán)境和病原菌的不同，都會(huì)影響到對(duì)赤霉病抗性的評(píng)價(jià)結(jié)果。 如遇到少雨天氣，采用田間鑒定就有可能會(huì)出現(xiàn)假抗病性。并且這種方法的周期較長(zhǎng)，不容 易做重復(fù)鑒定。所以就同時(shí)需要其他的方法進(jìn)行輔助。毒素鑒定法就補(bǔ)充了田間鑒定的缺 陷。它的結(jié)果還可以反證田間鑒定的結(jié)果。
[0004] 由于小麥赤霉病抗性具有典型的數(shù)量性狀特征，受多基因控制，易受環(huán)境影響，早 期世代很難對(duì)其進(jìn)行選擇。此外，許多抗赤霉病種質(zhì)的農(nóng)藝性狀較差，地區(qū)適應(yīng)性較強(qiáng)，利 用傳統(tǒng)育種方法培育抗性品種費(fèi)時(shí)費(fèi)力可能也得不到預(yù)期的結(jié)果，分子標(biāo)記及其輔助選擇 育種，為小麥育種提供了一條有效的途徑。利用分子標(biāo)記，可直接對(duì)品系的基因型進(jìn)行選 擇。它可以大大減弱環(huán)境條件對(duì)結(jié)果的影響。并且它的周期短，可在播種后數(shù)天對(duì)幼苗進(jìn) 行檢測(cè)。這將大大節(jié)省，培育植株中所浪費(fèi)的人力，財(cái)力和物力。
[0005] 利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，可較好地探明其抗性QTL的位點(diǎn)，進(jìn)行小麥抗赤霉病的輔 助選擇育種。利用分子標(biāo)記鑒定，具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)。通過(guò)目標(biāo)性狀相關(guān)分子標(biāo)記的輔 助選擇結(jié)合與綜合性狀優(yōu)良的小麥品種回交，可望打破性狀的不良連鎖，從而培育出抗赤 霉病優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)小麥新品種。SSR和DArT標(biāo)記具有豐富遺傳變異的特點(diǎn)，在小麥的基因作圖 和關(guān)聯(lián)分析中廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記。其中，SSR標(biāo)記是根據(jù)基因組中微衛(wèi)星兩端的相對(duì)保 守序列設(shè)計(jì)的特異引物，PCR擴(kuò)增穩(wěn)定，檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單且成熟，較適合用于分子標(biāo)記基因定 位和輔助育種選擇
[0006] 但是，現(xiàn)有技術(shù)中，抗赤霉病較好的品種，農(nóng)藝性狀不佳。而且由于不良基因連鎖 的影響，直接用其與豐產(chǎn)性好的品種雜交，難以獲得理想的抗赤霉病同時(shí)又豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)小麥 新品種。因此，創(chuàng)造新的赤霉病抗源，對(duì)小麥抗赤霉病育種具有很重要的意義?？茖W(xué)家們?cè)?小麥近緣物種中篩選，但一直沒(méi)有突破性進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種可以鑒定遠(yuǎn)緣雜交小麥赤霉病抗病性相關(guān)基因的SSR 分子標(biāo)記引物及其用途和篩選方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的遠(yuǎn)緣雜交小麥的SSR分子標(biāo)記引物及其用 途和篩選方法是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種遠(yuǎn)緣雜交小麥的SSR分子標(biāo)記引物，所述引物包括Xssrpl9、Xssrp81、 Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl38、Xssrpl57 及 Xssrp201，各引物所對(duì)應(yīng)的序列為：Xssrpl9 :正 向 ACATCATCAACTATGCCGAACA
[0010] 反向 CGCCTTTAGATCCCACCC
[0011] Xssrp81 :正向 CGAGGGTCAAACGCAAAG
[0012] 反向 ATCTCCGACGACGAGGGTG
[0013] Xssrp9I :正向 CTACTTTGCCGTGTTCTTCTC
[0014] 反向 GCCGTGGACTTCCATTTCT
[0015] Xssrp97 :正向 CTGAAAGGAGCAACATAT
[0016] 反向 TAAACAACCAAGGAAGAA
[0017] Xssrpl38 :正向 GGAGCGGAATGGATAAATAA
[0018] 反向 GGAAGGAAACGCAGGAGA
[0019] Xssrpl57 :正向 GTCGTGCTTGCGTTAGAT
[0020] 反向 GACTTGGAATGGAGGTTG
[0021] Xssrp201 :正向 TTGCCACGAAGTGATTGC
[0022] 反向 TTGGATGATGCCCTGACC。
[0023] 可選的，所述引物的退火溫度分別為：
[0024] Xssrp 19 :55°C
[0025] Xssrp81 ：60°C
[0026] Xssrp91 ：50°C
[0027] Xssrp97 ：55〇C
[0028] Xssrpl38 ：50°C
[0029] Xssrpl57 ：55〇C
[0030] Xssrp201 :55°C。
[0031] 可選的，小麥的遠(yuǎn)緣品種是小黑麥。
[0032] 可選的，Xssrpl9、Xssrp81、Xssrpl38 位于染色體 7A 上，Xssrp91、Xssrp97、 Xssrpl57和Xssrpl38位于染色體3BS上。
[0033] SSR分子標(biāo)記引物的篩選方法，包括：
[0034] A、從小麥遠(yuǎn)緣物種中確定赤霉病高感品種和赤霉病高抗品種；
[0035] B、通過(guò)小麥赤霉病高感品種和小麥赤霉病高抗品種對(duì)201對(duì)SSR分子標(biāo)記引物進(jìn) 行多態(tài)性初步篩選；
[0036] C、通過(guò)小麥赤霉病高抗品種、普通小麥以及上述高抗品種與普通小麥的RIL株系 對(duì)初步篩選出的SSR分子標(biāo)記引物進(jìn)行多態(tài)性復(fù)篩，對(duì)復(fù)篩出的SSR分子標(biāo)記引物進(jìn)行分 子連鎖圖譜構(gòu)建。
[0037] 可選的，所述的小麥遠(yuǎn)緣物種包括小黑麥、小偃麥和小賴麥。
[0038] 可選的，所述步驟A包括：（1)小麥開(kāi)花時(shí)，采用單花滴注法進(jìn)行赤霉病接種鑒定， 接種后21d，調(diào)查接種穗的病小穗數(shù)；用EXCEL計(jì)算每個(gè)品種的病情指數(shù)；參照江蘇省農(nóng)科 院制定的單花滴注接種等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)劃分；（2)同時(shí)對(duì)小麥進(jìn)行室內(nèi)毒素鑒定， 使用赤霉菌粗毒素處理小麥幼苗并計(jì)算根長(zhǎng)抑制率、芽長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞損傷度，檢測(cè)不同 品種小麥對(duì)于赤霉菌粗毒素的抗性；（3)根據(jù)間單花滴注赤霉病抗性鑒定和室內(nèi)毒素鑒定 結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)比較和相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，確定赤霉病高抗品種和赤霉病高感品種；
[0039] 所述步驟B包括：提取赤霉病尚抗品種和赤霉病尚感品種各品種小麥的DNA ;分別 用201對(duì)SSR分子標(biāo)記引物對(duì)上述各品種小麥的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳分析，初 步篩選出具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記引物；
[0040] 所述步驟C包括：提取小麥赤霉病高抗品種、普通小麥以及上述高抗品種與普通 小麥的RIL株系各品種小麥的DNA ;分別用步驟B篩查出的SSR分子標(biāo)記引物對(duì)上述各品 種小麥的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳分析，復(fù)篩出具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記引物， 應(yīng)用Joinmap4. 0軟件構(gòu)建其分子連鎖圖譜。
[0041] 可選的，所述 PCR 反應(yīng)體系為：25ul，其中 10Xbuffer2. 5ul，25mMMg2+l. 5ul， 2. 5mMdNTPsO. 2ul，正向引物和反向引物各lul，Taq酶（5U/ul)0. 2ul，模板DNA2. 5ul，補(bǔ)水 至 25ul ;
[0042] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min后，94°C變性lmin，50~60°C退火 lmin, 72°C延伸lmin，循環(huán)34次，最后72°C延伸8min，在4°C下保存；
[0043] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳完成后，凝膠用 0. 2%硝酸銀溶液浸泡震蕩IOmin后用蒸餾水洗滌2次，然后在紫外透射儀上照相。
[0044] 可選的，所述PCR擴(kuò)增使用儀器為在Biometra公司的Tl型PCR擴(kuò)增儀。
[0045] SSR分子標(biāo)記引物可用于鑒定遠(yuǎn)緣雜交小麥赤霉病抗性的相關(guān)基因。
[0046] 本發(fā)明提供的7對(duì)SSR引物，分別初步整合到已發(fā)表的分子遺傳圖譜上，可以增加 已有的分子標(biāo)記密度，提高遺傳圖譜密度，有利于小麥抗赤霉病育種。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1是本發(fā)明提供的P138作為引物的PCR擴(kuò)增圖；
[0048] 圖2是本發(fā)明提供的P187作為引物的PCR擴(kuò)增圖；
[0049] 圖3是本發(fā)明提供的7對(duì)SSR引物中Xssrp91作為引物的PCR擴(kuò)增圖；
[0050] 圖4是本發(fā)明提供的7對(duì)SSR引物中Xssrp201作為引物的PCR擴(kuò)增圖；
[0051] 圖5是本發(fā)明構(gòu)建的小麥3BS染色體的遺傳圖譜連鎖群；
[0052] 圖6是本發(fā)明構(gòu)建的小麥7A染色體的遺傳圖譜連鎖群。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行 進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定 本發(fā)明。
[0054] 本發(fā)明提供的一種用于鑒定遠(yuǎn)緣雜交小麥赤霉病抗性相關(guān)基因的SSR分子標(biāo) 記引物序列，所述引物序列如表二中 Xssrpl9、Xssrp81、Xssrp91、Xssrp97、Xssrpl38、 Xssrpl57 及 Xssrp201 所不序列。
[0055] 上述用于鑒定遠(yuǎn)緣雜交小麥赤霉病抗性相關(guān)基因的SSR分子標(biāo)記引物的篩選方 法包括如下步驟：
[0056] 步驟101、從小麥遠(yuǎn)緣物種中確定赤霉病高感品種和小麥赤霉病高抗品種；本實(shí) 施例采用的小麥遠(yuǎn)緣物種是二體異附加系小黑麥7個(gè)品種，小偃麥5個(gè)品種及小賴麥6個(gè) 品種（具體命名見(jiàn)表1)。
[0057] 該步驟通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)：（一）上述各個(gè)品種小麥赤霉病抗性的鑒定：
[0058] (1)小麥開(kāi)花時(shí)，采用單花滴注法進(jìn)行赤霉病接種鑒定，接種后21d，調(diào)查接種穗 的病小穗數(shù)。用EXCEL計(jì)算每個(gè)品種的病情指數(shù)。參照江蘇省農(nóng)科院制定的單花滴注接種 等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)劃分；
[0059] (2)同時(shí)對(duì)小麥進(jìn)行室內(nèi)毒素鑒定，使用赤霉菌粗毒素處理小麥幼苗并計(jì)算根長(zhǎng) 抑制率、芽長(zhǎng)抑制率和細(xì)胞損傷度，檢測(cè)不同品種小麥對(duì)于赤霉菌粗毒素的抗性；
[0060] (3)根據(jù)間單花滴注赤霉病抗性鑒定和室內(nèi)毒素鑒定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)比較和相關(guān)性 統(tǒng)計(jì)分析。從中選出高抗池，高感池以進(jìn)行下一步的發(fā)明。
[0061] 結(jié)果表明，在小偃麥類型、小黑麥類型、小賴麥類型這三個(gè)品種間的抗赤霉病行存 在顯著差異：小黑麥類型的小麥品種基本都屬于抗性品種（R型），只是存在高抗和抗的區(qū) 另IJ ;小賴麥類型的小麥品種基本都屬于易感品種（S型），只是高感與感的區(qū)別；而小偃麥類 型的小麥品種抗性居中。說(shuō)明黑麥?zhǔn)浅嗝共〉妮^好抗源，可與普通小麥構(gòu)建群系用于初級(jí) 分子連鎖圖譜的構(gòu)建。如表一所示，小麥品種及編制的代碼表，從中選出BK B3、B5這3個(gè) 品種組成高抗池 ，CU C5、C6這3個(gè)品種組成高感池。
[0062] 表1小麥品種及編制的代碼表
CN 105176985 A 說(shuō)明書(shū) 5/9 頁(yè)
[0065] 步驟102、提取小麥赤霉病高感品種和小麥赤霉病高抗品種DNA ;
[0066] 用CTAB法分別提取高抗品種（BK B3、B5)、高感品種（CU C5、C6)各品種小麥的 DNA0
[0067]