一種檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的rt-lamp試劑盒及其專用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑 盒及其專用引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)為 RNA 病毒, 是侵染甘薯的主要病毒之一,分布于世界各甘薯產(chǎn)區(qū),屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、 馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)可與甘薯裡綠矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)協(xié)生共侵 染甘薯引起甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease,SPVD),為甘薯的一種毀滅性病 害。甘薯感染甘薯病毒病害后,減產(chǎn)可達(dá)50%-98%,甚至絕收。目前,檢測(cè)甘薯羽狀斑駁 病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)的方法主要有:ELISA,RT-PCR 等方 法,這些方法的弊端在于耗時(shí)長(zhǎng)、依賴昂貴的檢測(cè)設(shè)備。
[0003] 近年來(lái)開發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別祀序列上6個(gè)特 異區(qū)域的引物和1個(gè)具有鏈置換特性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在等溫條件下 高效擴(kuò)增靶基因,靈敏度和特異性高,該方法已廣泛應(yīng)用于病毒、類病毒、細(xì)菌、真菌及轉(zhuǎn)基 因的檢測(cè),而迄今尚未應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決技術(shù)問(wèn)題是如何檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)〇
[0005] 本發(fā)明首先提供了一種成套引物,由引物SPFMV-F3、引物SPFMV-B3、引物 SPFMV-FIP、引物SPFMV-BIP、引物SPFMV-LF和引物SPFMV-LB組成,它們均為單鏈DNA分子, 核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。其中,序列表 的序列1由20個(gè)核苷酸組成,序列表的序列2由21個(gè)核苷酸組成,序列表的序列3由43 個(gè)核苷酸組成,序列表的序列4由42個(gè)核苷酸組成,序列表的序列5由20個(gè)核苷酸組成, 序列表的序列6由20個(gè)核苷酸組成。所述成套引物可以對(duì)甘薯羽狀斑駁病毒的總RNA進(jìn) 行特異性的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。
[0006] 所述成套引物中,所述引物SPFMV-F3、所述引物SPFMV-B3、所述引物SPFMV-FIP、 所述引物SPFMV-BIP、所述引物SPFMV-LF和所述引物SPFMV-LB的摩爾比可為 1:1:8:8:4:4〇
[0007] 所述成套引物中,各引物的量如下:0· 2μπιο1所述引物SPFMV-F3、0. 2μπιο1所述 引物 SPFMV-B3、L 6 μ mol 所述引物 SPFMV-FIP、L 6 μ mol 所述引物 SPFMV-BIP、0· 8 μ mol 所 述引物 SPFMV-LF、0. 8 μπιο? 所述引物 SPFMV-LB。
[0008] 所述摩爾比是總摩爾數(shù)之比,所述總摩爾數(shù)是引物中各種單鏈DNA摩爾數(shù)之和。
[0009] 所述成套引物的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述成套引物的制備方法可 為如下(I )、( II )或(III):
[0010] ( I )所述成套引物中各條引物分別單獨(dú)包裝;
[0011] ( II )所述成套引物中各條引物按照所述摩爾比混合在一起;
[0012] (III)所述成套引物中各條引物按照所述量混合在一起。
[0013] 所述成套引物的用途為如下a)或b)或c)或d) :a)制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)甘 薯羽狀斑駁病毒的試劑盒;b)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有甘薯羽狀斑駁病毒;c) 制備用于鑒定或輔助鑒定甘薯羽狀斑駁病毒的試劑盒;d)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否 為候選的甘薯羽狀斑駁病毒。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)所述成套引物的應(yīng)用,為如下a)或b)或c)或d) :a)制備用于檢測(cè) 或輔助檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的試劑盒;b)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有甘薯羽 狀斑駁病毒;c)制備用于鑒定或輔助鑒定甘薯羽狀斑駁病毒的試劑盒;d)鑒定或輔助鑒定 待測(cè)病毒是否為候選的甘薯羽狀斑駁病毒。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述成套引物的試劑盒。所述試劑盒的用途為如下e) 或f) :e)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有或疑似含有甘薯羽狀斑駁病毒;f)鑒定或輔 助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的甘薯羽狀斑駁病毒。
[0016] 所述試劑盒還可包括IOX反應(yīng)緩沖液、Bst DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶和/或甜菜堿。 所述IOX反應(yīng)緩沖液可為New England Biolabs公司產(chǎn)品。所述反轉(zhuǎn)錄酶具體可為M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶。
[0017] 所述試劑盒還可包括熒光顯色劑。所述熒光顯色劑具體可為SYBR Green I核酸 染料或鈣黃綠素?zé)晒馊玖稀?br>[0018] 本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的應(yīng)用,為如下e)或f) :e)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中 是否含有或疑似含有甘薯羽狀斑駁病毒;f)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為候選的甘薯 羽狀斑駁病毒。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)待測(cè)樣品是否含有甘薯羽狀斑駁病毒的方法,包括如下 步驟:
[0020] 提取待測(cè)樣品的總RNA,以上述任一所述成套引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,然 后進(jìn)行如下評(píng)判:如果所述成套引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述總RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,則 待測(cè)樣品中含有或疑似含有甘薯羽狀斑駁病毒;如果所述成套引物不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,則所述待測(cè)樣品不含有或疑似不含有甘薯羽狀斑駁病毒。
[0021] 所述"檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染甘薯羽狀斑駁病毒的方法"具體可為方法一,包括如 下步驟:提取待測(cè)樣品的總RNA,以所述檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 成套引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,如果擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)為典型的"S型"、則待測(cè)樣品中含有或疑 似含有甘薯羽狀斑駁病毒,如果擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)為水平直線、則所述待測(cè)樣品不含有或疑似 不含有甘薯羽狀斑駁病毒。
[0022] 所述"檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染甘薯羽狀斑駁病毒的方法"具體可為方法二,包括如 下步驟:提取待測(cè)樣品的總RNA,以所述檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 成套引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(反應(yīng)體系中含有鈣黃綠素?zé)晒馊玖希玫酱郎y(cè)樣品反應(yīng) 液,目測(cè)待測(cè)樣品反應(yīng)液的顏色變化,如果待測(cè)樣品反應(yīng)液為綠色、則待測(cè)樣品中含有或疑 似含有甘薯羽狀斑駁病毒,如果待測(cè)樣品反應(yīng)液為橙色、則所述待測(cè)樣品中不含有或疑似 不含有甘薯羽狀斑駁病毒。
[0023] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)病毒是否為候選的甘薯羽狀斑駁病毒的方法,包括如 下步驟:
[0024] 提取待測(cè)病毒的總RNA,以上述任一所述成套引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,然 后進(jìn)行如下評(píng)判:如果所述成套引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所述總RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,則 待測(cè)病毒為候選的甘薯羽狀斑駁病毒;如果所述成套引物不能實(shí)現(xiàn)對(duì)所述總RNA的逆轉(zhuǎn)錄 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,則所述待測(cè)病毒為候選的非甘薯羽狀斑駁病毒。
[0025] 所述"鑒定待測(cè)病毒是否為甘薯羽狀斑駁病毒的方法"具體可為方法三,包括如下 步驟:提取待測(cè)樣品的總RNA,以所述檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增成 套引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增,如果擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)為典型的"S型"、則待測(cè)病毒為候選的甘薯 羽狀斑駁病毒,如果擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)為水平直線、則所述待測(cè)病毒為候選的非甘薯羽狀斑駁 病毒。
[0026] 所述"鑒定待測(cè)病毒是否為甘薯羽狀斑駁病毒的方法"具體可為方法四,包括如下 步驟:提取待測(cè)樣品的總RNA,以所述檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增成 套引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(反應(yīng)體系中含有鈣黃綠素?zé)晒馊玖希?,得到待測(cè)樣品反應(yīng)液, 目測(cè)待測(cè)樣品反應(yīng)液的顏色變化,如果待測(cè)樣品反應(yīng)液為綠色、則待測(cè)病毒為候選的甘薯 羽狀斑駁病毒,如果待測(cè)樣品反應(yīng)液為橙色、則所述待測(cè)病毒為候選的非甘薯羽狀斑駁病 毒。
[0027] 上述任一所述鈣黃綠素焚光染料可為向IOOmg 鈣黃綠素 (Thermo fisher公司產(chǎn) 品,產(chǎn)品目錄號(hào)為S-34854)中加入100mL生理鹽水得到的染料。
[0028] 上述任一所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可在60_65°C條件下進(jìn)行。更具體可在63°C條件下 進(jìn)行。
[0029] 上述任一所述待測(cè)樣品可為植物樣品或微生物樣品。所述待測(cè)樣品具體可為未感 染甘薯羽狀斑駁病毒的健康甘薯葉片或感染甘薯羽狀斑駁病毒的甘薯葉片。
[0030] 上述任一所述待測(cè)病毒可為甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯C病毒、甘薯G病毒、甘薯卷 葉病毒、甘薯病毒2號(hào)、或甘薯無(wú)癥病毒1。
[0031] 實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明提供的一種檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒及其專用 引物能特異性地檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒,而且與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng),如甘薯卷葉病毒、甘 薯C病毒或甘薯G病毒。同時(shí),本發(fā)明提供一種檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒 及其專用引物對(duì)甘薯羽狀斑駁病毒的RNA的最小檢測(cè)限為25fg。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒的特異性。
[0033] 圖2為檢測(cè)甘薯羽狀斑駁病毒的RT-LAMP試劑盒的靈敏度。
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