專利名稱：電場克服植物交配不親和性的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電場處理工藝方法，特別是涉及電場克服植物交配不親和性的工藝方法。
自交不親和系的選育和利用是雜種優(yōu)勢利用上的一個重要發(fā)現(xiàn)，可以節(jié)省人工去雄的勞力，降低種子生產(chǎn)成本，提高制種效率，保證較高的雜種率，利用其雜種優(yōu)勢，至今仍是許多作物雜種優(yōu)勢利用的主要方式。利用自交不親和系生產(chǎn)雜種是一種非常簡便的制種方法。但是，由于自交不親和性的存在，對自交不親和系的繁殖和保持存在一定的困難。因此，克服自交不親和性的方法也是自交不親和性利用的重要組成部分之一?？v觀已發(fā)表的研究報告和文獻，應用于克服自交不親和性的方法已有20余種，可歸納為四類1、生物學方法(1)蕾期授粉，Pearson(1929)報道的蕾期授粉法是眾多育種專家廣泛采用的克服自交不親和性的基本方法之一，蕾期授粉在孢子體和配子體系統(tǒng)中均有效，效果好壞因物種而異。具有簡易、直觀、可操作性強的特點，該方法效率低，費工費時，生產(chǎn)成本很高，制約制種效率。
(2)延遲授粉，即用不親和的同種植物花粉給開花后幾天的老齡雌蕊授粉。原理在于開花后幾天的老齡雌蕊仍然有接受雄配子的能力，但是產(chǎn)生或貯藏有活性的不親和性物質(zhì)的能力已下降或柱頭乳突細胞解體有關(guān)。
(3)子房內(nèi)授粉，即將花粉或萌發(fā)花粉做成懸浮液直接注入子房使之受精這樣就繞過了自交不親和的障礙區(qū)——柱頭和花柱。
(4)體外受精，即將花粉與未受精的胚珠放在合適的培養(yǎng)基上，使花粉萌發(fā)，完成受精。這種方法也排除了柱頭和花柱對自交不親和的阻礙作用。
生物學方法中的前二種方法比較簡易，可以直接應用于生產(chǎn)活動中，但工作量都很大，從而導致生產(chǎn)效率低，而生產(chǎn)成本高，后二種方法每次處理量有限，可以作為自交不親和機制的研究方法，對克服自交不親和方法的研究具有指導意義，但是應用與生產(chǎn)實踐還有一段距離。
2、化學方法(1)激素，胡繁榮等用100mg/L的BA噴施白菜，對克服自交不親和具有一定效果。
(2)CO2處理，增加植株周圍大氣中CO2的濃度，能有效地誘導自交結(jié)實。此法已被種子公司成功地應用于育種工作中。不同地區(qū)、不同植物，以及不同局部環(huán)境及其它影響因素下處理的最適濃度都是變動的，都需要具體試驗來重新制定。
化學方法的噴施作用其直接處理范圍可以很廣，但化學成分可能會產(chǎn)生一些藥害，從而使該種方法的應用存在一些潛在的危害。
3、物理學方法(1)輻射。
(2)電助授粉和熱輔助授粉法，荷蘭的Rogsconl和A.T.Vandilk分別利用了這些方法來克服自交不親和性。
物理學方法的利用中劑量是關(guān)鍵，對不同植物其最有效范圍均需具體試驗得出。
4、機械方法(1)切除柱頭和截短花柱，Sears(1937)和Tatabe(1939)報道的柱頭移植和切斷柱頭法，切除柱頭或截短花柱，對于孢子體型不親和的物種，切除柱頭后就消除了自交不親和的障礙。對于因花粉管長度不夠而達不到胚囊產(chǎn)生的自交不親和，截短花柱后，可使花粉管長度足以到達胚囊。這種方法處理量有限，工作量較大，生產(chǎn)實踐利用范圍有限。
(2)鋼刷授粉，國外有人用直徑0.1mm、長4mm的細絲制成的鋼刷，在花期先在成熟花藥上擦取花藥，然后將花粉在雌蕊柱頭上摩擦，這樣可以稍稍擦傷柱頭，破壞妨礙自交的“隔離層”，促進甘藍等自交結(jié)實。鋼刷授粉不象蕾期授粉只能利用花蕾，而是所有的花都可以利用，顯著提高了單株的結(jié)子率，但是其工作量也很大，而且容易造成機械損傷。
(3)鹽水授粉，開花期用一定濃度的鹽水噴霧處理，任其自由授粉。張文邦等(1984)介紹的用5％NaCl噴甘藍花，安彩泰等(1983)用10％NaCl噴施油菜。本課題組選用成本低、操作簡便、便于推廣的NaCl溶液處理自交不親和系材料，取得明顯效果。曹必好(1998)，對甘藍花期噴灑5％NaCl和8％NaCl均可克服甘藍自交不親系的不親和性，5％NaCl+0.3％硼砂水溶液后使其花期自交，可以提高自交不親和系的親和指數(shù)，增加種子的千粒重，提高種子的生活力。陳越(1997)NaCl溶液可克服白菜型油菜自交不親和性，試驗結(jié)果表明，NaCl溶液確有克服自交不親和，提高親和指數(shù)的作用，其處理的最適濃度是4％～6％。曹壽椿(2002)，用碘鹽(5％)+硼砂(0.2％)水溶液噴灑甘藍自交不親和系的花序，再行授粉，結(jié)實率增效明顯，且可比蕾期自交授粉節(jié)約費用，可在生產(chǎn)上推廣應用。
克服自交不親和性的若干種方法中以蕾期授粉、鹽水授粉、CO2處理最為常用。雖然克服植物自交不親和的方法很多，但每一種方法僅在某一些植物上適用，而且一般來講受環(huán)境影響較大，且都有一定的局限性，因此，急需找到一種具有廣泛適應性，能夠完善自交不親和性的利用系統(tǒng)和克服自交不親和性的方法。
雜交育種以基因型不同的植物種或品種進行交配或結(jié)合形成雜種，通過培育選擇，獲得新品種的方法。它是培育新品種的主要途徑，是近代育種工作最重要的方法之一。
但是，種間雜交在育種工作中的作用卻因為種間的生殖隔離而受到嚴重的限制。因此，就要尋求克服不育的最佳途徑，總結(jié)前人的經(jīng)驗有以下方法(1)親和性規(guī)律和調(diào)整雜交方向。
變更雜交方向可以改變雜種胚乳中的基因劑量，調(diào)整胚及胚乳細胞中的核質(zhì)矛盾，以及改變胚、胚乳和母體之間在染色體數(shù)目上的不平衡狀況。孟金陵等在蕓薹屬中以芥菜型油菜×甘藍型油菜雜交高度親和，反交則高度不親和。
(2)篩選和創(chuàng)造可交配基因型。
在茄屬和番茄屬中均在自交不親和種內(nèi)發(fā)現(xiàn)了可以接受自交親和種花粉的植株。鮑文奎等測定了29個小麥品種與黑麥的可雜交性，鑒定出結(jié)實率可達70％以上的三種小麥品種中國春、Penkop和Srutnik。已經(jīng)成為小麥和黑麥、大麥等近緣種雜交時克服不親和性的“國際通用型”。此種方法尋找合適的物種難度較大，成功機率較小。
(3)改變雜交親本染色體倍數(shù)。
植物生殖遺傳學曾寫到孟金陵等將亞洲棉加倍為同源四倍體后再授以陸地棉花粉，大多數(shù)胚均能正常分化發(fā)育，產(chǎn)生具有一定生活力的雜種種子。此種方法，染色體加倍難度較大，周期較長。
(4)橋梁雜交。
橋梁法首先應用于果樹方面。栽培桃與蒙古桃之間的雜交不成功，米丘林先將蒙古桃與山桃雜交獲得雜種，再用該雜種與栽培桃雜交，獲得后代。此種方法較為繁瑣，費力費時，不可預見行強。
(5)遺傳轉(zhuǎn)化。
遺傳轉(zhuǎn)化是避開各種種間不可交配基因或不協(xié)調(diào)性表達的條件，而讓異源基因進入異種基因組的一類特殊的遠緣雜交方法。其中包括卵細胞轉(zhuǎn)化法、親和花粉管導入法、DNA注入法和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法。Hess用親和花粉管作載體完成了花色苷基因的種間轉(zhuǎn)移。此種方法難度較大。
(6)混合授粉。
Beasley在過量的父本花粉中混入6-12粒母本花粉，成功的獲得了棉屬二倍體與異源四倍體種間的雜種。
(7)提前或延遲授粉的方法。
母本柱頭對花粉的識別或選擇能力，一般在未成熟和過熟時最低。所以，提早開花前1-5天或延遲到開花后數(shù)天授粉，可提高遠緣雜交結(jié)實率。但這種方法受到了植物本身開花時間的限制，要求嚴格。
(8)射線處理的方法。
用γ射線輻射花粉或柱頭，能克服番茄的栽培種和野生種間雜交的難交配性，如用處理花粉授粉者獲得了1.8％的雜種，而用未經(jīng)處理的花粉授粉者，只獲得了0.19％的雜種。此種方法適當劑量不容易找到，往往導致花粉變異或死亡，成功的幾率較小。
(9)用生理活性物質(zhì)處理雌蕊。
A、促進異源花粉粒萌發(fā)和花粉管生長，提高受精頻率；B、加快受精過程，使雜種合子或幼胚不至于因延遲受精而造成配子或子房退化；C、刺激子房發(fā)育，使多胚珠子房中的個別受精胚珠中的雜種胚不至于因子房早期脫落而失去繼續(xù)發(fā)育的機會；D、協(xié)調(diào)雜種胚或胚乳的發(fā)育，協(xié)調(diào)胚、胚乳和母體組織三者的平衡。
無論是克服自交不親和性的方法還是克服遠緣雜交的方法均不完善，因此我們力求探索一種行之有效，且可重復的方法。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，電場等生物技術(shù)作為最有前途的技術(shù)手段，正在被廣泛的應用。我們早在80年代開始對高壓靜電場克服植物交配不親和性進行的大膽深入的嘗試，經(jīng)過大量的實踐研究開發(fā)出了高壓靜電場處理花粉的可行性技術(shù)方案，并完善了簡化了試驗步驟。成為一種簡單易行的技術(shù)手段，易于推廣普及。
為達到上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是采集成熟的花藥，在通風干燥的條件下，干燥1-3小時，待花粉開始散出時，對花粉進行電場處理，處理之后在1-5小時內(nèi)授粉于成熟的柱頭上。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、通過電場處理后的花粉，其生物活性提高，即電場處理的花粉比對照組合提早萌發(fā)，且萌發(fā)率提高。
2、電場處理后的花粉的生物效應具有較高的重復性。
3、電場處理花粉對交配不親和性強的植物均可不同程度的提高親和率，遠緣雜交的親和率提高，結(jié)實率可提高10-30％；自交親和率提高，結(jié)實率的提高幅度較大，結(jié)實率可提高20-40％。
4、經(jīng)過電場處理的花粉，其自交所獲得的種子質(zhì)量明顯高于對照組合。
5、工藝方法簡單方便，易于重復，適合于大量處理生物試材，可操作性強。
2、所述的電場處理輸出電壓為5KV-30KV，電場強度為100KV/m-900KV/m。
3、所述電場處理時間為10-60分鐘。
4、電場處理使用的種類為高壓平板靜電場、高頻電場、勻強半波整流電場、工頻交流電場。
實施例1采集成熟的黑芥花藥，在通風干燥的條件下1.5-2小時，待花粉開始散出時對花粉進行高壓平板靜電場處理，授粉于羽衣甘藍成熟的柱頭上。選用電場輸出電壓為20KV，處理場強是200KV/m，處理時間為30min，比對照組合的雜交結(jié)實率提高兩倍。
實施例2采集成熟的草原龍膽花藥，在通風干燥的條件下2-3小時，待花粉開始散出時對花粉進行高壓平板靜電場處理，授粉于成熟的柱頭上。選用電場輸出電壓為5KV，處理場強是500V/m，處理時間為30min，結(jié)實率提高20％
實施例3采集成熟的百合花藥，在通風干燥的條件下2-2.5小時，待花粉開始散出時對花粉進行高頻電場處理，授粉于成熟的柱頭上。選用高頻電場的輸出功率為20W，處理時間為1-3min。
權(quán)利要求
1.一種電場克服植物交配不親和性的工藝方法，其特征在于采集成熟的花藥，在通風干燥的條件下，干燥1-3小時，待花粉開始散出時，對花粉進行電場處理，處理之后在1-5小時內(nèi)授粉于成熟的柱頭上。
2.按照權(quán)利要求1所述的電場克服植物交配不親和性的工藝方法，其特征在于所述的電場處理輸出電壓為5KV-30KV，電場強度為100KV/m-900KV/m。
3.按照權(quán)利要求1所述的電場克服植物交配不親和性的工藝方法，其特征在于所述電場處理時間為10-60分鐘。
4.按照權(quán)利要求1所述的電場克服植物交配不親和性的工藝方法，其特征在于電場處理使用的種類為高壓平板靜電場、高頻電場、勻強半波整流電場、工頻交流電場。
全文摘要
一種電場克服植物交配不親和性的工藝方法，采集成熟的花藥，在通風干燥的條件下，干燥1－3小時，待花粉開始散出時，對花粉進行電場處理，處理之后在1－5小時內(nèi)授粉于成熟的柱頭上。該工藝方法簡單方便，易于重復，可操作性強。通過電場處理后的花粉，其生物活性提高，并對遠緣雜交不親和性及自交不親和性強的植物均可不同程度的提高交配親和率，遠緣雜交結(jié)實率提高10－30％，自交結(jié)實率提高幅度較大，結(jié)實率可提高20－40％。
文檔編號A01H1/02GK1456045SQ02145000
公開日2003年11月19日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者李玉花, 丁兵, 解麗楠, 于曉艷, 藍興國, 佟友麗, 王繼剛, 馮國軍 申請人:東北林業(yè)大學, 李玉花