專利名稱：番茄耐鹽性狀篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種番茄耐鹽性狀篩選方法，可用于所有果菜類，如番茄、茄子、辣椒、黃瓜、甜瓜等耐鹽新品種培育，側枝扦插部分內容可用于所有性狀的培育，屬于農作物育種技術領域。
番茄為嚴格的自花授粉植物，長期的人工馴化和有性雜交，使其基因背景越來越窄，一些耐逆境基因，如耐鹽基因已很難在其栽培種中找到，故近年來國內外許多專家都試圖通過基因工程技術和細胞工程技術來培育番茄耐鹽新品種，但大都只有獲得耐鹽植株的報道，育成品種的報道甚少。就其原因，一則因為耐鹽性的表達大多受多基因控制；二則研究證明番茄不同的生育時期耐鹽性的表達不盡相同，這給耐鹽性狀的篩選帶來不便，從而延長了篩選時間，且降低了篩選的有效性，最終阻礙了耐鹽育種的進程。(陳火英等，番茄耐鹽性狀的離體篩選(英文)，上海交通大學學報(農業(yè)科學版)，2002，20(1)，1-6)，(M.Ashraf.Breedingfor salinity tolerance in plants，Critical Reviews in Plant Sciences，1994，13(1)17-42)。
為實現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明利用在氯化鈉NaCl脅迫下番茄芽體的生根情況、子葉愈傷組織的增殖情況、幼苗的生長勢、成株期的側枝扦插的生根情況以及下一世代種子的發(fā)芽勢，綜合評判番茄植株的耐鹽性，同時加快番茄耐鹽育種的進程。
本發(fā)明的技術方案中，各個時期的技術關鍵包括
①芽體的生根情況將要鑒定材料的種子浸種24小時，飽和漂白粉液消毒20分鐘，再在無菌條件下催芽，接著將處于萌動狀態(tài)的種子播種于1/2的MS(Murashige and Skoog的基本培養(yǎng)基)大量元素培養(yǎng)基中；出苗后10天，將其芽體切下，接種于附加有75mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，10天后觀察和統(tǒng)計生根情況。
②子葉愈傷組織的增殖量取上述生根快的植株的子葉作為外植體，接種于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，每15天繼代1次，將繼代2次的愈傷組織接種于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的增殖情況，并測定其干重，以重復進行耐鹽性的鑒定。
③幼苗生長勢將芽體生根快的植株移栽于大棚苗床或育苗缽中。緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進行耐鹽性的脅迫篩選。
④成株期側枝扦插的生根情況將上述在鹽脅灌溉下生長勢強的、葉片鹽害癥狀輕的植株移栽于大棚中，觀察農藝性狀；取第一花穗下的具4-5片葉子的側枝，側枝的基部用100mmol/L的NAA(萘乙酸)處理10分鐘，爾后扦插于基質槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計側枝的生根情況。
⑤下一世代種子的發(fā)芽勢將上述由生根快的側枝形成的植株定植于大棚或大田中進一步觀察該材料的其它農藝性狀，并將其相對應植株留一穗果打頂以加快種子的成熟，加快世代進程。將種子在無菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進行發(fā)芽試驗，7天后統(tǒng)計發(fā)芽勢。將發(fā)芽勢大于50％的材料，進入下一世代的篩選。
與傳統(tǒng)篩選技術相比，本發(fā)明方法簡便，一般常規(guī)育種工作者易于掌握；整個系統(tǒng)的耐鹽性篩選都在可控條件下，使得篩選結果更加可靠；利用組培室有限的空間進行大量材料的初步篩選；利用側枝在基質槽進行鹽池鑒定，即可以減少工作量，又可做到育種材料的不間斷；耐鹽植株留一穗果打頂，可使番茄在長江中下游地區(qū)的氣候條件下繁殖4個世代，大大縮短了育種時間。
本發(fā)明選用試驗材料為上海交通大學農業(yè)與生物學院耐鹽番茄育種課題組的育種材料，可分為兩組①以擬改良品種“鮮豐”為受體，通過花粉管通道技術分別將野生耐鹽的奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716的Total DNA及帶有耐鹽目的基因HVA1的pBY520質粒作為供體導入到受體的后代材料；②以擬改良品種“鮮豐”為對象，進行體細胞突變體篩選的后代。
研究表明，利用本發(fā)明可在1年到1年半的時間內完成番茄變異體的穩(wěn)定性篩選，而傳統(tǒng)的篩選技術則需要2-3年的時間；耐鹽性鑒定覆蓋了整個種子到種子的過程，避免了鹽脅過程中生理適應性的干擾，從而大大提高了選擇的有效性；利用本發(fā)明在不到3年的時間內已成功獲得了7個耐鹽的、農藝性狀穩(wěn)定的系統(tǒng)。其中，2個系統(tǒng)耐鹽且農藝性狀優(yōu)良，在上海崇明東旺沙新圍墾的，鹽度達到0.7％-0.8％的大棚中，且用鹽度達0.8％海水灌溉(由于崇明島的海水鹽度不穩(wěn)定，故根據(jù)每次取水的實際濃度加上一定量的NaCl復配而成)條件下正常生長，成品率達到80％-100％；而對照“鮮豐”葉片有嚴重的鹽害癥狀，所結果實臍腐病的發(fā)病率達到80％以上，成品率最高達20％。
將24個果實的種子浸種24小時，飽和漂白粉液消毒20分鐘，再在無菌條件下催芽，接著將處于萌動狀態(tài)的種子播種于1/2的MS大量元素培養(yǎng)基中；出苗后10天，將其芽體切下，接種于附加有75mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，10天后統(tǒng)計生根情況，并初步斷定耐鹽植株15株。
取上述15株植株的子葉作為外植體，接種于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，每15天繼代1次，將繼代2次的愈傷組織接種于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的增殖情況，并測定其相對干重，以進一步鑒定材料的耐鹽性。
將上述15株植株移栽于大棚苗床中。緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進行耐鹽性的脅迫篩選。
將上述在鹽脅灌溉下生長勢強的、葉片鹽害癥狀輕的植株移栽于大棚中，觀察農藝性狀；取第一花穗下的具4-5片葉子的側枝，側枝的基部用100mmol/L的NAA處理10分鐘，爾后扦插于基質槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計側枝的生根情況。
將由生根快的9個側枝形成的植株定植于大棚中進一步觀察其它農藝性狀，并將其相對應植株(取側枝的母株)留一穗果打頂以加快種子的成熟，加快世代進程；9個植株單株留種，將9個株系的種子在無菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進行發(fā)芽試驗，7天后統(tǒng)計發(fā)芽勢有5個株系的發(fā)芽勢達到50％以上。從第3世代開始將材料種植于上海崇明東旺沙新圍墾的，鹽度達到0.7％-0.8％的大棚中，且用鹽度達0.8％海水灌溉進行篩選。
利用本發(fā)明，將上述材料連續(xù)篩選1.5年(6個世代)獲得了一個耐鹽、且農藝性狀優(yōu)良的有限生長型番茄新品種。
實施例2將利用體細胞突變體篩選獲得的10株耐鹽植株移栽于育苗缽中。緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進行耐鹽性的脅迫篩選。10株均表現(xiàn)耐鹽。接著將其移栽于大棚中，只有2株生長正常，并能開花結實。取第一花穗下具4-5片葉子的側枝，側枝的基部用100mmol/L的NAA處理10分鐘，爾后扦插于基質槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計側枝的生根情況。
將2個側枝形成的植株定植于大棚中進一步觀察該材料的其它農藝性狀，并將其相對應植株(取側枝的母株)留一穗果打頂以加快種子的成熟，加快世代進程；2個植株單株留種，將2個株系的種子在無菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進行發(fā)芽試驗，7天后統(tǒng)計發(fā)芽勢。從第3世代開始將材料種植于上海崇明東旺沙新圍墾的，鹽度達到0.7％-0.8％的大棚中，且用鹽度達0.8％海水灌溉進行篩選。
利用本發(fā)明，將上述材料連續(xù)篩選1.5年(6個世代)獲得了一個耐鹽、且農藝性狀優(yōu)良的有限生長型番茄新品種。
權利要求
1.一種番茄耐鹽性狀篩選方法，其特征在于包括①芽體的生根情況將要鑒定材料的種子浸種24小時，消毒后在無菌條件下催芽，接著將處于萌動狀態(tài)的種子播種于1/2的MS大量元素培養(yǎng)基中，出苗后10天，將其芽體切下，接種于附加有75mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基中，10天后觀察和統(tǒng)計生根情況；②子葉愈傷組織的增殖量取上述生根快的植株的子葉作為外植體，接種于附加有BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中誘導愈傷組織，每15天繼代1次，將繼代2次的愈傷組織接種于附加有175mmol/L NaCl+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+MS的培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織的增殖情況，并測定其干重，以重復進行耐鹽性的鑒定；③幼苗生長勢將芽體生根快的植株移栽于大棚苗床或育苗缽中，緩苗后，用附加有200mmol/L NaCl的水溶液作為灌溉水源，進行耐鹽性的脅迫篩選；④成株期側枝扦插的生根情況將上述在鹽脅灌溉下生長勢強的、葉片鹽害癥狀輕的植株移栽于大棚中，觀察農藝性狀；取第一花穗下的具4-5片葉子的側枝，側枝的基部用100mmol/L的萘乙酸NAA處理10分鐘，爾后扦插于基質槽中，用附加有200mmol/L NaCl的1/10MS培養(yǎng)基作為營養(yǎng)液灌溉，10天后觀察和統(tǒng)計側枝的生根情況；⑤下一世代種子的發(fā)芽勢將上述由生根快的側枝形成的植株定植于大棚或大田中，并將其相對應植株留一穗果打頂，將種子在無菌條件下，在附加有80mmol/LNaCl 1/2MS培養(yǎng)基上進行發(fā)芽試驗，7天后統(tǒng)計發(fā)芽勢，將發(fā)芽勢大于50％的材料，進入下一世代的篩選。
全文摘要
一種番茄耐鹽性狀篩選方法，利用在氯化鈉NaCl脅迫下番茄芽體的生根情況、子葉愈傷組織的增殖情況、幼苗的生長勢、成株期的側枝扦插的生根情況以及下一世代種子的發(fā)芽勢，綜合評判番茄植株的耐鹽性，同時加快番茄耐鹽育種的進程。本發(fā)明方法簡便，易于掌握，整個系統(tǒng)的耐鹽性篩選都在可控條件下，使得篩選結果更加可靠；利用組培室有限的空間進行大量材料的初步篩選；利用側枝在基質槽進行鹽池鑒定，即可以減少工作量，又可做到育種材料的不間斷；耐鹽植株留一穗果打頂，可大大縮短育種時間。
文檔編號A01H4/00GK1433680SQ03115379
公開日2003年8月6日 申請日期2003年2月13日 優(yōu)先權日2003年2月13日
發(fā)明者陳火英, 莊天明, 劉風榮 申請人:上海交通大學