專利名稱：制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)共同培養(yǎng)無(wú)菌松樹芽苗和松口蘑菌(Tricholoma matsutake)制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)將無(wú)菌的松樹芽苗與松口蘑分離菌菌絲體一起培養(yǎng)，而只用松口蘑菌選擇性感染松樹芽苗根部的方法。
背景技術(shù)：
松口蘑菌是屬于擔(dān)子菌亞綱(Basidiomycotina)傘菌目(Agaricales)白蘑科(Tricholomataceae)的真菌，其天然生長(zhǎng)于包括赤松(Pinus densiflora)、偃松(Pinus pumila)、歐洲云杉(Piceaabies)和魚鱗云杉(Picea jezoensis)的針葉林中。特別地，在韓國(guó)，已知該真菌只生長(zhǎng)于松樹林中。在韓國(guó)和日本，松口蘑菌是最受歡迎的食用菌之一，特別是在韓國(guó)東部沿海地區(qū)，其是主要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源。該真菌發(fā)出獨(dú)特的香味，該香味的芳香成分包括1-辛烯-3-醇、2-辛醇、1-辛烯和4-甲基肉桂酸。寄生于活樹根部的食用真菌松口蘑，主要寄生在松樹(例如，赤松)的細(xì)根上，與樹共生并形成外生菌根。然而，還沒(méi)有該外生菌根的真菌形成體外的子實(shí)體的報(bào)道。韓國(guó)的一個(gè)研究小組試圖通過(guò)將松樹芽苗移植到松口蘑真菌的蘑菇圈周圍的土壤中這種傳統(tǒng)方法來(lái)產(chǎn)生體外由其感染的松樹，但是結(jié)果并不令人滿意。(TS Kim，GH Ga，H Park，YC Park，GH Yoon和GY Lee，1999，體外培養(yǎng)松口蘑和其產(chǎn)量的提高(In vitro cultivation of T.matsutake and increase of itsproduction yield)，韓國(guó)森林研究協(xié)會(huì)出版(Publications published bythe Korean Forest Research Institute)Vol.15313-16)。茨城地方林業(yè)中心(Ibaraki Prefectural Forestry Center)報(bào)道了在赤松的芽苗上成功形成松口蘑真菌外生菌根(Akiyoshi Yamada，Ken Maeda和Masatake Ohmasa，1999，體外松口蘑分離菌在赤松芽苗上的外生菌根的形成(Ectomycorrhizal formation of Tricholoma matsutake isolateson seedling of Pinus densiflora in vitro，真菌科學(xué)(Mycoscience)40455-463)。
由于該真菌是活樹的根部寄生菌，所以體外很難形成松口蘑真菌的子實(shí)體(蘑菇)。鑒于此，傳統(tǒng)上培養(yǎng)松口蘑為簡(jiǎn)單控制影響松口蘑發(fā)育的環(huán)境因素，例如，濕度、光強(qiáng)度、溫度等。即，通過(guò)一系列野外作業(yè)包括灌溉、移走落葉和用杯狀物覆蓋蘑菇，獲得適于松口蘑發(fā)育的環(huán)境。這種培養(yǎng)方法可以顯著提高蘑菇產(chǎn)量，但是其應(yīng)用只限于松口蘑天然存在的地方。更具體地，這種培養(yǎng)蘑菇方法的例子包括如下首先，將培養(yǎng)的松口蘑菌絲體播撒于存在松口蘑的田地中，接著，新形成的菌絲體移植入土壤中；第二，從松口蘑菌的子實(shí)體收集孢子并播撒于存在松口蘑的田地中；第三，將含有活的松口蘑菌絲體的土壤播撒于沒(méi)有生長(zhǎng)松口蘑的地方的田地中。通過(guò)上述方法移植的松口蘑真菌沒(méi)有長(zhǎng)成真菌菌落是由于其菌絲體生長(zhǎng)速率比細(xì)菌和其它絲狀真菌低，由于雨或土壤狀況導(dǎo)致松口蘑真菌丟失而松樹根部卻沒(méi)有感染該真菌。
另外，松口蘑可以通過(guò)將松樹芽苗種植于松口蘑蘑菇圈周圍的土壤中來(lái)培養(yǎng)，所述蘑菇圈天然形成于松樹周圍。使芽苗生長(zhǎng)幾年，然后將得到的松樹移植到?jīng)]有生長(zhǎng)松口蘑的田地中。然而，這種方法使種植的松樹芽苗在感染松口蘑菌之前，感染并生長(zhǎng)了天然存在于該田地中的許多其它相似真菌。而且，鑒定生長(zhǎng)的真菌需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，沒(méi)有高產(chǎn)量地獲得感染松口蘑菌的松樹。

發(fā)明內(nèi)容
基于松口蘑菌絲體滲入松樹根部并且該真菌與松樹共生的事實(shí)，本發(fā)明人通過(guò)將無(wú)菌松樹芽苗與松口蘑分離菌體外共同培養(yǎng)，選擇性感染松樹根部。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法。
上述目的通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將松口蘑菌KBFERI 20T05接種于滅菌的培養(yǎng)容器中，所述松口蘑菌分離自液體培養(yǎng)于PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(Potato Dextrose Broth)，Difco)的天然存在的松口蘑的子實(shí)體；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼(sphagnum peatmoss)的土壤混合物及K-液體培養(yǎng)基放置于接種的真菌上；將松樹子在無(wú)菌狀態(tài)下發(fā)芽產(chǎn)生的無(wú)菌芽苗種植入混合土壤中；然后將松樹芽苗與松口蘑菌一起培養(yǎng)以在松樹芽苗的細(xì)根上形成外生菌根。


從下列詳細(xì)描述并結(jié)合所附附圖將更清楚理解本發(fā)明的上述和其它目的、特征、和其它優(yōu)點(diǎn)。其中圖1為顯示松口蘑真菌KBFERI 20T05液體培養(yǎng)結(jié)果的照片，所述松口蘑真菌KBFERI 20T05分離自天然存在的松口蘑；圖2為在無(wú)菌下發(fā)芽的松樹芽苗的照片；圖3為插入紙杯的培養(yǎng)容器的照片；圖4為顯示用于共同培養(yǎng)無(wú)菌松樹芽苗和松口蘑分離菌的感染培養(yǎng)基的組合物的照片；圖5為被松口蘑分離菌菌絲體感染的幼松樹的照片；圖6為根部形成外生菌根的松樹的細(xì)根照片，其中在立體顯微鏡下觀察細(xì)根；圖7為滲入松樹芽苗細(xì)根的松口蘑菌絲體的照片，其中在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體；圖8為滲入松樹芽苗細(xì)根的松口蘑菌絲體的照片，其中在熒光顯微鏡下觀察菌絲體；和圖9為當(dāng)根部具有菌絲體的松樹的一根細(xì)根培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基上時(shí)，松口蘑菌絲體生長(zhǎng)于PDA固體培養(yǎng)基上的照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及通過(guò)將松樹芽苗和松口蘑菌的子實(shí)體共同培養(yǎng)來(lái)制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括如下步驟制備能夠含有感染培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器；將松口蘑菌KBFERT 20T05的子實(shí)體接種到培養(yǎng)容器中；制備用于松樹芽苗生長(zhǎng)的混合土壤和K-液體培養(yǎng)基以提供感染培養(yǎng)基；將松樹芽苗種植到該感染培養(yǎng)基中。
具體地講，本發(fā)明提供了通過(guò)共同培養(yǎng)無(wú)菌松樹芽苗和松口蘑菌制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括以下步驟將真菌菌絲體以0.01-0.02mg干重/mL無(wú)菌水的量接種于滅菌的培養(yǎng)容器底部，該真菌菌絲體通過(guò)將液體培養(yǎng)于PDB培養(yǎng)基的松口蘑菌的子實(shí)體粉碎獲得；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2的比率混合并將得到的混合土壤放置于接種的真菌菌絲體上；制備K-液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基的pH至5.5-5.6并將K-液體培養(yǎng)基平分至混合土壤上，所述K-液體培養(yǎng)基為每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g (NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5mlFe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在無(wú)菌條件下，使松樹子發(fā)芽至3cm長(zhǎng)，將得到的無(wú)菌芽苗種植到含有混合土壤和K-液體培養(yǎng)基的感染培養(yǎng)基上，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器；將松樹芽苗和松口蘑菌在10-40,000勒克斯(lux)光強(qiáng)度下于15-25℃共同培養(yǎng)24小時(shí)。
以下將更詳細(xì)描述本發(fā)明的方法。
步驟1含有感染培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器的制備和滅菌首先，制備用于共同培養(yǎng)松樹芽苗和松口蘑菌的含有感染培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器，并在1.2個(gè)大氣壓下，121℃高壓滅菌20分鐘。培養(yǎng)容器應(yīng)該由在滅菌過(guò)程中不改變和熔化的材料制成，并且在共同培養(yǎng)過(guò)程中，也不受微生物感染的攻擊。
另一方面，培養(yǎng)容器優(yōu)選由生物可降解材料制備。然而，當(dāng)將被松口蘑真菌感染的松樹以放置于生物可降解的培養(yǎng)容器中的形式種植于田地中時(shí)，這種材料需很長(zhǎng)時(shí)間才生物降解。因此，優(yōu)選制備同時(shí)考慮到共同培養(yǎng)和移植到田地因素的培養(yǎng)容器。在這點(diǎn)上，在本發(fā)明中，當(dāng)進(jìn)行共同培養(yǎng)時(shí)，使用的培養(yǎng)容器內(nèi)部具有紙杯，當(dāng)感染了真菌菌絲體的松樹芽苗移植到田地中時(shí)，丟棄紙杯。優(yōu)選，參見圖3，可商購(gòu)獲得的紙杯(相當(dāng)小型的杯子)緊密插入培養(yǎng)容器的內(nèi)部但不暴露于培養(yǎng)容器的上部分，并且培養(yǎng)容器用透明蓋子覆蓋。盡管滅菌和培養(yǎng)中，紙杯的外形可發(fā)生變化，但是由于紙杯在共同培養(yǎng)至移植到田地中的過(guò)程中，保持其內(nèi)含物不改變，并且，幾乎不影響松樹芽苗和松口蘑菌絲體的生長(zhǎng)，因而紙杯是有用的。更優(yōu)選在高壓滅菌后，可以立即將培養(yǎng)容器在超凈臺(tái)上暴露于紫外光下進(jìn)一步滅菌。
步驟2將液體培養(yǎng)的松口蘑菌KBFERI 20T05接種于感染培養(yǎng)基中獲自天然存在的松口蘑的松口蘑菌KBFERI 20T05均勻分布地接種于步驟1制備的滅菌的培養(yǎng)容器的底部。
優(yōu)選使用來(lái)自松口蘑蘑菇子實(shí)體的松口蘑分離菌作為接種體，其中已鑒定所述松口蘑分離菌與常規(guī)已知的松口蘑菌具有DNA序列同源性，而不使用常規(guī)已知或通過(guò)外觀或感官評(píng)價(jià)方式鑒定的松口蘑菌。因此，本發(fā)明應(yīng)用的松口蘑菌KBFERI 20T05與常規(guī)已知松口蘑菌的Gene Bank登記的ITS區(qū)、5.8S整個(gè)區(qū)域和18S的一部分的DNA序列具有超過(guò)99％的同源性。該真菌KBFERI 20T05的DNA序列已在Gene Bank登記。松口蘑分離菌KBFERI 20T05培養(yǎng)于PDB培養(yǎng)基(Difco)中。得到的菌絲體團(tuán)以K-液體培養(yǎng)基(pH 5.6)洗滌，以滅菌網(wǎng)孔過(guò)濾，并于K-液體培養(yǎng)基中利用Waring氏可高壓滅菌的攪拌器31L91粉碎為精細(xì)顆粒，所述培養(yǎng)基按照如下表1列出的組成制備。然后，將粉碎的菌絲體轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，并且，在打開培養(yǎng)容器后，利用10ml玻璃吸液管均勻接種于滅菌的培養(yǎng)容器底部。接種的菌絲體生長(zhǎng)成為多層菌落，這種生長(zhǎng)形式增加了松樹芽苗的細(xì)根與松口蘑真菌的接觸。在這里，優(yōu)選利用攪拌器將菌絲體團(tuán)粉碎得非常精細(xì)。此外，由于在粉碎過(guò)程中產(chǎn)生的熱對(duì)松口蘑菌絲體的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響，優(yōu)選粉碎過(guò)程使用，例如，放置于冰箱中預(yù)冷的5℃以下的K-液體培養(yǎng)基進(jìn)行。真菌菌絲體與5ml K-液體培養(yǎng)基以0.05-0.10mg干重的量接種。接種體的干重通過(guò)以下方法進(jìn)行計(jì)算將5ml含有粉碎的真菌菌絲體的K-液體培養(yǎng)基放置于小的容器中，使之干燥，將得到物稱重并減去濾紙重量，然后重復(fù)上述方法20次，并將得到的重量值平均。接種量極大地影響松樹芽苗細(xì)根與松口蘑菌絲體的接觸。增加真菌菌絲體的接種量，將提高它們與松樹芽苗根部的接觸。然而，由于松口蘑真菌在較高濃度接種時(shí)，其菌絲體生長(zhǎng)率較低，因此認(rèn)為上述的接種量是合適的。
另一方面，為了提高松口蘑菌絲體與松樹芽苗細(xì)根的接觸，可以在培養(yǎng)容器的底部加入pH5.5-5.6的K-固體培養(yǎng)基。
所述K-固體培養(yǎng)基的組成列于如下表1。通常，植物體外培養(yǎng)的最佳pH值約為5.7-5.8，松口蘑真菌的最佳pH約為5.4。為了提供適于這兩種共同培養(yǎng)生物的環(huán)境，調(diào)整K-固體培養(yǎng)基的pH至5.5-5.6。另外，通常在液體培養(yǎng)基中松口蘑的真菌增殖速度慢，因此，為了提高松口蘑真菌的生長(zhǎng)率，放置于培養(yǎng)容器底部的K-固體培養(yǎng)基含有高的碳源。為了在短時(shí)間內(nèi)增加松口蘑菌生物團(tuán)，并且完全消耗K-固體培養(yǎng)基中的高的碳源，將最少量的K-固體培養(yǎng)基等分至培養(yǎng)容器的底部，優(yōu)選，厚度小于2cm，更優(yōu)選，0.5mm。當(dāng)使用高濃度的K-固體培養(yǎng)基時(shí)，松口蘑菌僅僅利用存在的高濃度的碳源繼續(xù)生長(zhǎng)而不滲入松樹芽苗的細(xì)根中，結(jié)果在松樹根部不形成外生菌根。
表1

步驟3利用混合土壤和K-液體培養(yǎng)基制備感染培養(yǎng)基為了培養(yǎng)松樹芽苗，將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼的混合物及K-液體培養(yǎng)基傾倒于步驟2中的接種的松口蘑菌絲體上，其中K-液體培養(yǎng)基用于防止松樹芽苗由于干燥而凋零。
感染培養(yǎng)基中使用的床土是珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2比率的混合物。珍珠巖廣泛地用作床土。并且，由于珍珠巖幾乎不含有其它有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，其適于K-固體培養(yǎng)基或K-液體培養(yǎng)基的加入。泥炭蘚泥炭沼用于濕度控制。由于泥炭蘚泥炭沼的強(qiáng)酸性，其使用濃度非常低。當(dāng)使用含有紙杯的培養(yǎng)容器時(shí)，在紙杯被放置于容器中滅菌后，混合土壤傾倒入按照上述步驟制備的接種了松口蘑菌絲體的培養(yǎng)容器中，并使其達(dá)到與紙杯同樣的高度，以防止將要傾倒于混合土壤的K-液體培養(yǎng)基進(jìn)入培養(yǎng)容器與紙杯之間的空間，其中在超凈臺(tái)上加入土壤。
另一方面，具有如上表1所示組成的K-液體培養(yǎng)基在1.2個(gè)大氣壓，于121℃高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，在超凈臺(tái)上將100ml K-液體培養(yǎng)基傾倒于混合土壤上。這些加入的少量的K-液體培養(yǎng)基可以防止在培養(yǎng)過(guò)程中干燥，因此，防止松樹芽苗的凋零。
步驟4無(wú)菌松樹芽苗的準(zhǔn)備并將其種植到感染培養(yǎng)基在無(wú)菌條件下，使松樹子發(fā)芽，將得到的松樹芽苗種植到步驟3中制備的含有混合土壤和K-液體培養(yǎng)基的感染培養(yǎng)基中，并使根面向下，子葉面向上。然后，用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器。
另一方面，為了獲得松樹芽苗，將松樹子在70％乙醇中浸泡10-60秒消毒，然后用0.5-3％(最佳2％)的次氯酸鈉處理1-7分鐘，再用無(wú)菌水洗滌3-4次。當(dāng)用次氯酸鈉處理更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，松樹子的發(fā)芽率降低。因此，用次氯酸鈉處理芽苗約5分鐘是合適的。當(dāng)在無(wú)菌條件下剝離種皮后，將消毒的種子種植于固體培養(yǎng)基中并在15-28℃培養(yǎng)，(最佳溫度23-26℃，通常種子發(fā)芽溫度24℃)，所述固體培養(yǎng)基利用營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基(Nutrient Broth，Scharlau)和瓊脂(8g/L)制備并在滅菌的一次性培養(yǎng)皿中變硬。選擇3cm長(zhǎng)沒(méi)有被微生物污染的發(fā)芽種子。超過(guò)3cm長(zhǎng)的芽苗容易倒下或凋零。將選擇的松樹芽苗種植于步驟3中準(zhǔn)備的培養(yǎng)容器中，該容器中含有接種了松口蘑菌絲體的感染培養(yǎng)基。這里，將芽苗種植入混合土壤約2cm深，小于1cm高，并且使根面向下，子葉面向上。
步驟5制備感染松口蘑菌的幼松樹的培養(yǎng)步驟為了制備細(xì)根被松口蘑菌感染的幼松樹，將步驟4中種植于培養(yǎng)容器中的松樹芽苗在10-40,000lux光強(qiáng)度下于15-25℃共同培養(yǎng)24小時(shí)。
通常在15-25℃下進(jìn)行松口蘑菌進(jìn)入松樹芽苗細(xì)根的感染。已知根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacience)作為將外源基因整合入植物染色體的載體，感染植物的最佳溫度為20℃。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的感染松口蘑菌過(guò)程在20℃進(jìn)行。最重要的因素，光強(qiáng)度，在10-40,000lux范圍內(nèi)。自然光約為20,000lux，但是由于包括培養(yǎng)容器的透射率低和照明設(shè)備過(guò)熱等重大問(wèn)題，難以人工維持這樣的自然光強(qiáng)度。因此，本發(fā)明應(yīng)用三個(gè)波長(zhǎng)的熒光燈。感染過(guò)程在裝有4個(gè)或多個(gè)熒光燈的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，并使培養(yǎng)容器維持在超過(guò)8,000lux光強(qiáng)度下，以維持供應(yīng)對(duì)于植物生長(zhǎng)必需的碳源。由于松口蘑菌試圖獲得碳源，這些培養(yǎng)條件自發(fā)誘導(dǎo)松口蘑菌的感染機(jī)制。
步驟6對(duì)于在松樹芽苗細(xì)根上的菌根形成的評(píng)價(jià)在共培養(yǎng)松樹芽苗和松口蘑菌絲體后，評(píng)價(jià)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下觀察滲入松樹芽苗的細(xì)根的真菌菌絲體狀態(tài)。
發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)后70天內(nèi)，松樹芽苗感染了松口蘑菌絲體。還發(fā)現(xiàn)在松樹芽苗細(xì)根上形成的菌根發(fā)出與松口蘑蘑菇相同的香味。并且，在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)菌絲體滲入細(xì)根中。在無(wú)菌下切除形成的菌根的一部分，種植于MMN(改進(jìn)的Melin-Norkron)培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基上形成的菌絲體具有與松口蘑蘑菇相同的形態(tài)和香味。
將參考下列實(shí)施例并結(jié)合附圖更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。然而，提供下列實(shí)施例只是為了闡述本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1使用用于金針菇的培養(yǎng)容器制備感染松口蘑菌的幼松樹為了獲得如圖4所示的感染松口蘑菌的幼松樹，將滅菌的K-固體培養(yǎng)基傾倒于滅菌的培養(yǎng)容器中并使之變硬，該K-固體培養(yǎng)基通常用于培養(yǎng)金針菇(Flammulina velutipes)蘑菇。用濾紙覆蓋K-固體培養(yǎng)基后，將菌絲體與5ml無(wú)菌水以0.075mg干重接種于濾紙上，該菌絲體來(lái)自液體培養(yǎng)的松口蘑菌KBFERI 20T05的子實(shí)體，將80∶1.5比率的珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼的混合物加到接種的真菌菌絲體上并將pH 5.6的K-液體培養(yǎng)基加入土壤中，以此形成感染培養(yǎng)基。然后，將從無(wú)菌下發(fā)芽松樹子獲得的芽苗種植到含有混合土壤和K-液體培養(yǎng)基的感染培養(yǎng)基上，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器，然后在25,000lux光強(qiáng)度下，于20℃將松樹芽苗和松口蘑真菌共同培養(yǎng)24小時(shí)。評(píng)價(jià)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下研究它們滲入根部的狀態(tài)。
這里，加入的K-固體培養(yǎng)基的深度小于5.0mm。使用的濾紙為Adantec公司生產(chǎn)的N05B。加入的混合土壤的深度小于5mm。
另外，用達(dá)到感染培養(yǎng)基高度的鋁箔將含有感染培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器的外部包圍，以防止光透過(guò)而保護(hù)松口蘑菌絲體和松樹芽苗的根部。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)松樹芽苗細(xì)根上形成的外生菌根具有與松口蘑蘑菇相同的香味，并且在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在細(xì)根上觀察到菌絲體的細(xì)胞間滲透。另外，在共同培養(yǎng)后70天內(nèi)，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲體感染了松樹芽苗。當(dāng)在無(wú)菌下切除外生菌根的細(xì)根的一部分并種植于MMN(改進(jìn)的Melin-Norkron)培養(yǎng)基上時(shí)，真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(zhǎng)(附圖未顯示)，并且新形成的蘑菇發(fā)出與天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
制備例1來(lái)自液體培養(yǎng)的松口蘑接種體的制備本發(fā)明中用作接種體的松口蘑真菌分離自天然存在的恰好在其菌蓋打開前的松口蘑蘑菇，該松口蘑蘑菇是從位于韓國(guó)的慶尚北道(Gyeongsangbuk-do)慶州市(Gyeongju-si)Namsan-dong的10公頃(ha)的Doyoo森林采集的。在采集后8小時(shí)內(nèi)，將采集的蘑菇中的菌蓋和菌褶之間的部分切成0.5mm大小的塊，并且種植到按照如下表2所示的組成的pH 5.5的MMN培養(yǎng)基上。然后，在松口蘑生長(zhǎng)的最佳生長(zhǎng)溫度，23±0.5℃，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)分離的菌絲體60天。松口蘑真菌成功地分離自約98％的培養(yǎng)的菌絲體。發(fā)現(xiàn)分離的菌絲體與已知的松口蘑真菌的ITS序列，整個(gè)5.8S rRNA和部分18S的DNA序列具有超過(guò)99％同源性。鑒定的rDNA序列于2001年4月3日在Gene Bank登記，指定登記號(hào)AF367417。在本發(fā)明中，分離的松口蘑真菌命名為“KBFERI20T05”。這里，作為松口蘑接種體，可以應(yīng)用來(lái)自天然存在的松口蘑蘑菇的菌絲體，其與松口蘑的已知ITS序列和整個(gè)5.8S和18S的DNA序列具有超過(guò)99％同源性。
為了獲得制備本發(fā)明感染松口蘑菌的幼松樹的接種體的菌絲體團(tuán)，將分離自天然存在的松口蘑蘑菇子實(shí)體的松口蘑菌KBFERI 20T05培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基中(按照表2列出的組成除去瓊脂后制備)。得到的真菌菌絲體團(tuán)用pH5.0的無(wú)菌水洗滌，然后利用Waring氏可高壓滅菌的攪拌器31L91于無(wú)菌水中粉碎為精細(xì)顆粒。利用10ml玻璃吸液管將粉碎的真菌菌絲體均勻接種于培養(yǎng)容器中放置于K-固體培養(yǎng)基上的濾紙上。
表2

制備例2利用混合土壤和K-液體培養(yǎng)基制備感染培養(yǎng)基應(yīng)用珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼作為培養(yǎng)松樹芽苗的床土。以80∶1.5比率混合后，將它們?cè)谌萜髦袦缇?。在超凈臺(tái)上，滅菌的混合土壤傾倒至接種了松口蘑菌絲體的培養(yǎng)容器中至合適的高度。
按照如上表1所示的組成制備K-液體培養(yǎng)基。在高溫下高壓滅菌后，在超凈臺(tái)上將100ml K-液體培養(yǎng)基傾倒至混合土壤上。
制備例3在無(wú)菌條件下使松樹子發(fā)芽并種植它們以制備松樹芽苗將松樹子在70％乙醇中浸泡60秒消毒，然后用2％次氯酸鈉處理4分鐘，再用無(wú)菌水洗滌3次。在無(wú)菌條件下剝離種皮后，將消毒種子種植于固體培養(yǎng)基上并在24℃培養(yǎng)，所述固體培養(yǎng)基利用營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基(Scharlau)和瓊脂(8g/L)制備并在滅菌的一次性培養(yǎng)皿中變硬。選擇3cm長(zhǎng)沒(méi)有被微生物污染的發(fā)芽種子并種植于制備例2中制備的培養(yǎng)容器中的感染培養(yǎng)基中。
如圖2所示，選擇的沒(méi)有被微生物污染的松樹芽苗種植于感染培養(yǎng)基中。
實(shí)施例2利用含有紙杯的培養(yǎng)容器制備感染松口蘑菌的幼松樹如圖3所示，為了制備感染松口蘑菌的幼松樹，將滅菌的K-固體培養(yǎng)基傾倒入滅菌的含有紙杯的培養(yǎng)容器中。來(lái)自松口蘑菌KBFERI 20T05子實(shí)體的菌絲體按照如制備例1相同的方法制備。所述菌絲體與5ml無(wú)菌水以0.075mg干重接種至紙杯的底部。將按照制備例2相同方法制備的混合土壤和100ml K-液體培養(yǎng)基傾倒至接種的真菌菌絲體上，由此制備感染培養(yǎng)基。然后，將按照制備例3相同方法制備的松樹芽苗種植到感染培養(yǎng)基上，并且用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器，然后，在25,000lux光強(qiáng)度下于培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)24小時(shí)。該培養(yǎng)箱裝有4個(gè)或多個(gè)三個(gè)波長(zhǎng)的熒光燈。評(píng)價(jià)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下研究它們滲入根部的狀態(tài)。
作為松樹芽苗和松口蘑真菌共同培養(yǎng)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的外生菌根與松口蘑蘑菇具有相同的香味，并且在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在細(xì)根上觀察到菌絲體的細(xì)胞間滲透。另外，在共同培養(yǎng)后70天內(nèi)，松樹芽苗感染了松口蘑菌絲體。當(dāng)在無(wú)菌下切除外生菌根的細(xì)根的一部分并種植于MMN(改進(jìn)的Melin-Norkron)培養(yǎng)基中時(shí)，真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(zhǎng)(附圖未顯示)，并且新形成的蘑菇發(fā)出與天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
另一方面，當(dāng)真菌菌絲體均勻接種于培養(yǎng)容器的紙杯的底部時(shí)，接種的菌絲體生長(zhǎng)成為多層菌落，這種生長(zhǎng)形式增加了松樹芽苗的細(xì)根與松口蘑真菌的接觸。
制備例4培養(yǎng)容器的制備如圖3所示，為了制備感染松口蘑菌的幼松樹，可商購(gòu)獲得的紙杯(相當(dāng)小型的杯子)緊密插入培養(yǎng)容器的內(nèi)部但不暴露于容器的上部分，然后用透明蓋子覆蓋培養(yǎng)容器。然后，培養(yǎng)容器在1.2個(gè)大氣壓，121℃下高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，將培養(yǎng)容器在超凈臺(tái)上暴露于紫外光下進(jìn)一步滅菌。
實(shí)施例3在含有K-固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，利用生長(zhǎng)松口蘑蘑菇的田地土壤制備感染松口蘑菌的幼松樹為了在插入紙杯并含有K-固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器(按照與實(shí)施例1相同的方法制備)中制備感染松口蘑菌的幼松樹，將來(lái)自松口蘑菌KBFERI20T05子實(shí)體的菌絲體(按照與制備例1相同的方法制備)與5ml無(wú)菌水以0.075mg干重的量接種于放置在紙杯底部的K-固體培養(yǎng)基上。將收集于生長(zhǎng)松口蘑蘑菇的田地土壤(按照如下制備例6相同方法制備)和50ml K-液體培養(yǎng)基傾倒于接種了的真菌菌絲體上，由此制備感染培養(yǎng)基。然后，將按照制備例3相同方法制備的松樹芽苗種植于感染培養(yǎng)基上，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器。然后在25,000lux光強(qiáng)度下于培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)24小時(shí)。該培養(yǎng)箱裝有4個(gè)或多個(gè)三個(gè)波長(zhǎng)的熒光燈。評(píng)價(jià)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下研究它們滲入根部的狀態(tài)。
作為松樹芽苗和松口蘑真菌共同培養(yǎng)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的外生菌根與松口蘑蘑菇具有相同的香味，并且在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在細(xì)根上觀察到菌絲體的細(xì)胞間滲透。另外，在共同培養(yǎng)后70天內(nèi)，發(fā)現(xiàn)松樹芽苗感染了松口蘑菌絲體。當(dāng)在無(wú)菌下切除外生菌根的細(xì)根的一部分并種植于MMN(改進(jìn)的Melin-Norkron)培養(yǎng)基中時(shí)，真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(zhǎng)(附圖未顯示)，并且新形成的蘑菇發(fā)出與天然存在的松口蘑蘑菇相同的香味。
制備例5制備含有K-固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器如下方法制備用于共同培養(yǎng)松樹芽苗和松口蘑真菌的培養(yǎng)容器。如圖3所示，可商購(gòu)獲得的紙杯(相當(dāng)小型的杯子)緊密插入培養(yǎng)容器的內(nèi)部但不暴露于培養(yǎng)容器的上部分，并且用透明蓋子覆蓋培養(yǎng)容器。然后，培養(yǎng)容器在1.2個(gè)大氣壓，121℃下高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，將培養(yǎng)容器在超凈臺(tái)上暴露于紫外光下進(jìn)一步滅菌。在超凈臺(tái)上，將按照表1列出的組成制備的K-固體培養(yǎng)基(pH5.6)傾倒入培養(yǎng)容器的紙杯中至厚度2cm，優(yōu)選約0.5mm，并使之變硬。
制備例6利用生長(zhǎng)松口蘑蘑菇的田地土壤和K-液體培養(yǎng)基制備感染培養(yǎng)基用于培養(yǎng)松樹芽苗的床土利用生長(zhǎng)松口蘑蘑菇的田地土壤制備。土壤分別收集于三層土壤層表面土壤層，精細(xì)顆粒土壤層和粗糙顆粒土壤層，并將所述土壤加入制備例5中的紙杯中的K-固體培養(yǎng)基中，并保持其自然結(jié)構(gòu)，即，將K-液體培養(yǎng)基、粗糙顆粒土壤、精細(xì)顆粒土壤和表面土壤依次加入紙杯中。然后，將按照表1列出的組成制備的K-液體培養(yǎng)基(pH5.6)在1.2個(gè)大氣壓，121℃下高壓滅菌20分鐘，并冷卻。然后，在超凈臺(tái)上，將50ml冷卻的K-液體培養(yǎng)基傾倒入土壤上。
實(shí)施例4利用含有K-固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中的混合土壤制備感染松口蘑菌的幼松樹為了在插入紙杯并含有K-固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器(按照與實(shí)施例1相同的方法制備)中制備感染松口蘑菌的幼松樹，將來(lái)自松口蘑菌KBFERI20T05子實(shí)體的菌絲體(按照與制備例1相同的方法制備)與5ml無(wú)菌水以0.075mg干重的量接種于放置于紙杯底部的K-固體培養(yǎng)基上。將按照制備例2相同方法制備的混合土壤和100ml K-液體培養(yǎng)基傾倒于接種的真菌菌絲體上，由此制備感染培養(yǎng)基。然后，將按照制備例3相同方法制備的松樹芽苗種植于感染培養(yǎng)基上，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器。然后在25,000lux光強(qiáng)度下于培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)24小時(shí)。該培養(yǎng)箱裝有4個(gè)或多個(gè)三個(gè)波長(zhǎng)的熒光燈。評(píng)價(jià)在松樹芽苗的細(xì)根上形成的外生菌根的香味，并且在立體顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，研究它們滲入根部的狀態(tài)。
如圖5所示，發(fā)現(xiàn)松樹芽苗感染了松口蘑真菌。在松樹芽苗細(xì)根上形成的外生菌根具有與松口蘑蘑菇相同的香味。并且，如圖6所示，在立體顯微鏡下形成菌絲體膜。如圖7和圖8所示，在光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡下，在線狀細(xì)根上觀察到菌絲體的細(xì)胞間滲透。另外，在共同培養(yǎng)后70天內(nèi)，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲體感染了松樹芽苗。
如圖9所示，當(dāng)在無(wú)菌條件下切除外生菌根的細(xì)根的一部分并種植于MMN(改進(jìn)的Melin-Norkron)培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲體顯示松口蘑真菌的特征性菌絲體生長(zhǎng)。
如實(shí)施例所描述，根據(jù)本發(fā)明制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法是有效的，其通過(guò)體外共同培養(yǎng)無(wú)菌松樹芽苗和真菌菌絲體，只用松口蘑真菌選擇性感染松樹根部。本發(fā)明的方法通過(guò)應(yīng)用松口蘑分離菌，該松口蘑分離菌與常規(guī)已知松口蘑的ITS區(qū)，5.8S的整個(gè)區(qū)域和18S一部分具有DNA序列同源性，有利于為松口蘑接種體和感染了真菌的松樹芽苗提供客觀現(xiàn)實(shí)條件。另外，由于一旦移植入田地容易移去紙杯，本發(fā)明的方法為種植工作提供了方便，并且對(duì)松口蘑菌生根相對(duì)有效。進(jìn)一步地，該方法使整年大規(guī)模生產(chǎn)感染松口蘑菌的松樹成為可能，其對(duì)于體外培養(yǎng)松口蘑蘑菇特別有用。
權(quán)利要求
1.一種制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括以下步驟將真菌菌絲體以0.01-0.02mg干重/mL無(wú)菌水的量接種于滅菌的培養(yǎng)容器的底部，所述真菌菌絲體通過(guò)將液體培養(yǎng)于PDB培養(yǎng)基的松口蘑子實(shí)體粉碎獲得；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2的比率混合并且將得到的混合土壤放置于接種的真菌菌絲體上；制備K-液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基的pH至5.5-5.6并將K-液體培養(yǎng)基平分至混合土壤上，所述K-液體培養(yǎng)基為每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g(NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5ml Fe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在無(wú)菌條件下，使松樹子發(fā)芽至3cm長(zhǎng)，將得到的無(wú)菌芽苗種植于含有混合土壤和K-液體培養(yǎng)基的感染培養(yǎng)基上，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器；并且將松樹芽苗和松口蘑菌絲體在10-40,000lux光強(qiáng)度下于15-25℃共同培養(yǎng)24小時(shí)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在將粉碎液體培養(yǎng)于PDB培養(yǎng)基的松口蘑子實(shí)體獲得的真菌菌絲體接種于滅菌的培養(yǎng)容器的底部的步驟之前，該方法還包括制備K-固體培養(yǎng)基，調(diào)整K-固體培養(yǎng)基的pH至5.5-5.6并將K-固體培養(yǎng)基平分至培養(yǎng)容器中的步驟，所述K-固體培養(yǎng)基為每升蒸餾水含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g(NH4)2HPO4，0.5gNH4-Tar，0.5ml Fe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白，10.0g葡萄糖和2.0g植物凝膠。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中紙杯緊緊插入所述容器中。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述K-固體培養(yǎng)基以0.5mm至2cm的厚度平分到培養(yǎng)容器的底部。
5.一種感染松口蘑菌的幼松樹，該幼松樹的制備方法包括如下步驟將真菌菌絲體以0.01-0.02mg干重/mL無(wú)菌水的量接種于滅菌的培養(yǎng)容器的底部，所述真菌菌絲體通過(guò)將液體培養(yǎng)于PDB培養(yǎng)基的松口蘑子實(shí)體粉碎獲得；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼以80∶1-2的比率混合并且將得到的混合土壤放置于接種的真菌菌絲體上；制備K-液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基的pH至5.5-5.6并將K-液體培養(yǎng)基平分至混合土壤上，所述K-液體培養(yǎng)基為每升水中含有1.65g NH4NO3，0.2g KNO3，0.002g CaCl2·2H2O，0.02g KCl，0.2g KH2PO4，0.9g MgSO4·7H2O，0.2g(NH4)2HPO4，0.5g NH4-Tar，0.5ml Fe-Cit，0.031g H3BO3，0.01516g MnSO3·4H2O，0.0086g ZnSO4·7H2O，0.00083g KI，0.00025g Na2MoO4·2H2O，100μg鹽酸硫胺，1.0g麥芽提取物，0.5g酵母提取物，0.3g酪蛋白和3.0g葡萄糖；在無(wú)菌條件下，使松樹子發(fā)芽至3cm長(zhǎng)，將得到的無(wú)菌芽苗種植于含有混合土壤和K-液體培養(yǎng)基的感染培養(yǎng)基上，并用蓋子覆蓋培養(yǎng)容器；并且將松樹芽苗和松口蘑菌絲體在10-40,000lux光強(qiáng)度下于15-25℃共同培養(yǎng)24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過(guò)共同培養(yǎng)無(wú)菌松樹芽苗和松口蘑分離菌，制備感染松口蘑菌的幼松樹的方法，該方法包括以下步驟于PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，Difco)中液體培養(yǎng)天然存在的松口蘑蘑菇子實(shí)體并將分離自培養(yǎng)的子實(shí)體的松口蘑菌KBFERI 20T05接種；將珍珠巖和泥炭蘚泥炭沼的混合土壤及K－液體培養(yǎng)基放置于接種的真菌上；將松樹子在無(wú)菌下發(fā)芽產(chǎn)生的無(wú)菌芽苗種植到混合土壤中，然后與松口蘑分離菌一起培養(yǎng)松樹芽苗以使在松樹芽苗的細(xì)根上形成外生菌根。本發(fā)明的方法通過(guò)應(yīng)用與已知常規(guī)松口蘑菌具有DNA同源性的真菌作為接種體，有利于為真菌接種體提供客觀現(xiàn)實(shí)條件，并使整年大規(guī)模生產(chǎn)感染松口蘑菌的松樹成為可能。
文檔編號(hào)A01G1/04GK1494823SQ0315661
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2003年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月6日
發(fā)明者樸武昌, 沈相甲, 千于宰 申請(qǐng)人:慶尚北道知事