專利名稱:花粉介異的植物的轉(zhuǎn)化的制作方法
本發(fā)明涉及植物遺傳工程的一般領(lǐng)域，具體地說，涉及通過以物理方式將傳遺物質(zhì)引入到植物花粉之中使外源的遺傳物質(zhì)進(jìn)入到一種植物系的種系的轉(zhuǎn)化。
目前，人們正大力致力于植物種的基因轉(zhuǎn)化方面研究。據(jù)認(rèn)為，把外源基因轉(zhuǎn)入植物種系的有效手段的發(fā)展將使重要的經(jīng)濟(jì)作物種的遺傳材料的多樣性得到擴(kuò)大，并能把特別感興趣的功能基因有選擇地引入作物種。以往關(guān)于植物種的轉(zhuǎn)化或者遺傳工程方面的努力和研究已取得一些成果，這些成果極其明顯地取決于植物的種。
以往業(yè)已用作把外源基因引入植物的主要機構(gòu)是從作為原生質(zhì)體或者在稱之傷愈組織的未經(jīng)分化的組織中的單一植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化開始。有人通過electroporation和顯微注射將在植物細(xì)胞中起作用的嵌合基因引入到單胞植物的原生質(zhì)體。然而，以往最廣泛采用的轉(zhuǎn)化技術(shù)是利用植物病原體根癌病土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的天然特征的優(yōu)點，它具有天生的能力可把部分DNA從藏于其中的Ti(Tumor-inducing)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感染的植物細(xì)胞之中。通過把外源基因插入到帶有來自Ti質(zhì)粒的某些順序的土壤桿菌中的一些質(zhì)粒中，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化特征可以被用來把外源基因輸入到經(jīng)感染的植物細(xì)胞的染色體組。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，土壤桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用可用在許多典型的作物種例如煙草、矮牽牛屬植物及胡蘿卜中得到應(yīng)用，但是它有兩個很大局限性。第一個局限性是，介導(dǎo)作用只能在細(xì)胞水平上例如用體細(xì)胞組織進(jìn)行，然后必須用人工方法使它們再生為整株植物。這就限制了土壤桿菌介導(dǎo)的桿菌遺傳轉(zhuǎn)化在那些可容易地從易感染土壤桿菌各種類型組織再生的作物中的可應(yīng)用性。第二個局限性是土壤桿菌的天然宿主范圍僅包括雙子葉植物和有限的幾個Liliaceae科的單子葉植物種。因此，尚未證明，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用對有商業(yè)價值的單子葉植物種，如谷類作物種是有效的工具。采用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的另一個困難在于體細(xì)胞無性系變異體的產(chǎn)生，體細(xì)胞變異體在組織培養(yǎng)中的植物組織是自發(fā)地出現(xiàn)，從而可使轉(zhuǎn)化突變型(轉(zhuǎn)移基因接受體)的鑒定復(fù)雜化。
業(yè)已證明，至少某些嵌合基因的結(jié)構(gòu)對外源基因在多數(shù)植物細(xì)胞中的表達(dá)是有效的。采用如electroporation一類技術(shù)對培養(yǎng)中的玉米原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化已證明這些嵌合結(jié)構(gòu)在單子葉植物及雙子葉植物中的功能度。然而，目前尚沒有建立起從這種原生質(zhì)體再生整株玉米或者整株其它任何重要作用物的一套方法。公知的是非整株、完整的轉(zhuǎn)化的玉米植物已生產(chǎn)出來。盡管如此，玉米和其它作物的遺傳轉(zhuǎn)化是一個人們所期望的目標(biāo)，因為這種普通作物具有很大的農(nóng)業(yè)價值，并且有潛力可提高它們的價值和產(chǎn)量。
以往，至少有一種建議，即通過玉米花粉的遺傳轉(zhuǎn)化可以在遺傳上使玉米轉(zhuǎn)化。Dewet的公開的PCT專利申請WO85/01856大致上描述了一種通過植物花粉的轉(zhuǎn)化把外源基因轉(zhuǎn)移到顯花植物的方法。其他人證實這一技術(shù)以及重復(fù)該實驗的試圖均遭失敗。參見Sanford等人，Theor.Appl.Genet.，69(5-6)，571-74(1985)。業(yè)有人作出得到相似結(jié)果的報告。參見Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83∶715-719(1986)。
本發(fā)明概括為一種從遺傳上使植物系轉(zhuǎn)化的方法。所說的方法包括以下步驟制備一種包含外源基因和調(diào)節(jié)順序的DNA順序;將DNA順序涂蓋在生物學(xué)上的隋性的微粒上，用物理學(xué)方法使帶有DNA的微粒向植物的花粉加速，以致該微粒進(jìn)入并固定在花粉中;用所說的花粉使雌性親本授粉;從授粉的后代中選擇轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明還對準(zhǔn)具有在插入到它們的功能表達(dá)的外源基因的玉米系。
本發(fā)明的另一個目的在于通過花粉轉(zhuǎn)化以及在不需要植物的組織培養(yǎng)或者再生的情況下，不僅對玉米而且對其它重要的作物，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的優(yōu)點在于所說的方法是快而有效，易于檢證和重復(fù)。
本發(fā)明的所說方法和由此所生成物質(zhì)的優(yōu)點在于可以簡便快速地把經(jīng)鑒定或未經(jīng)鑒定的外源遺傳物質(zhì)引入到用于作物育種、分子生物學(xué)或者其它相似的農(nóng)學(xué)或科學(xué)的目的的玉米的任何要求的遺傳背景之中。
本發(fā)明的方法的另一個優(yōu)點在于要得到無數(shù)的即幾千個轉(zhuǎn)化突變型是可能的和行得通的，因為與難以實施或者要求一個細(xì)胞一個細(xì)胞地處理的已有的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)或者顯微注射相比，實施本方法是容易的。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點以及特點通過以下結(jié)合附圖的說明將會更加清楚。
圖1為實施本發(fā)明方法的裝置的分解透視圖;
圖2為制作質(zhì)粒pCMC 1208的方法中的質(zhì)粒操作的圖解說明;
圖3為制作質(zhì)粒pCMC 1022的方法中的質(zhì)粒操作的圖解說明。
在根據(jù)本發(fā)明所進(jìn)行的花粉介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化的實踐中，以物理的方式把DNA傳遞到植物花粉的細(xì)胞溶質(zhì)中，把DNA帶到生物學(xué)上隋性的物質(zhì)的單個小微粒上，使所說的微粒向花粉加速，以致于所說的微粒進(jìn)入單個花粉細(xì)胞，但是既沒有破壞它們也沒有使它們失去能力。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，以這種方式供給的DNA將被結(jié)合在該花粉的后代的遺傳物質(zhì)中。以這種方式所得的轉(zhuǎn)化花粉可供植物和植物系的遺傳工程應(yīng)用。
有幾種因素影響花粉介導(dǎo)的的轉(zhuǎn)化的成功。其中使微粒加速的方式要優(yōu)先仔細(xì)地安排，以使各個帶有DNA的微粒具有適合的動量和速度，并且微粒本身應(yīng)處于較均勻的圖式中，當(dāng)接觸花粉時，它們穿過大量花粉細(xì)胞，并沒有在生物學(xué)上使它們失去能力。因此，微粒上的DNA應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，而且能使植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和表達(dá)植物細(xì)胞中的所要求的特征。此外，DNA本身可含有一種可供選擇的標(biāo)記物，該標(biāo)記可在已推定轉(zhuǎn)化了的植物種子或者植物苗中被測到，以便證明該特定植物已發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化。如果轉(zhuǎn)化頻率足夠高，那么這種可選擇的標(biāo)記物就不需要采用。可以預(yù)見到加速生物學(xué)上隋性的小載體微粒的機械系統(tǒng)有多種類型。可能的裝置可包括微粒的彈道式爆炸加速、微粒的離心加速、微粒的靜電加速或者能夠給小的隋性微粒提供動量和速度的任何其它類似的系統(tǒng)。圖1以圖解方式說明了申請人優(yōu)先采用的一種新的方法。這里所說明的方法采用由高壓放電產(chǎn)生的沖擊波。在圖1中和通常以10表示的是用所說的方法加速隋性微粒用的加速器。如圖1所示，一般以22表示的是用于在其上帶花粉靶子的靶子表面。
加速器10是由幾部分組成?；鸹ǚ烹娛?2設(shè)有一對電極14，延伸到它的內(nèi)部。火花放電室12的幾何形狀對本發(fā)明來說并非至關(guān)緊要，只要該室被配置到能產(chǎn)生和提供具有可用于推動載體微粒的合適的特性和合適的方向的沖擊波。申請人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)徑為13毫米的聚氯乙烯塑料管的一段對用作火花放電區(qū)12是滿意的。電極14以相對的兩側(cè)延伸到管的內(nèi)部，設(shè)置在低于火花室12頂大約5毫米處。電極14本身由螺紋螺栓構(gòu)成，延伸到在火花室12壁本身的內(nèi)側(cè)壁表面中形成的合適的螺紋中。構(gòu)成電極14的螺紋螺栓的端部均用高壓繼電器上斷開的觸點的耐電弧合金保護(hù)，其尺寸為大約2毫米×2毫米×3毫米，并且焊接在螺紋螺栓的端部。通過適當(dāng)?shù)匕崖菟ㄐM(jìn)或旋出火花室12可調(diào)整電極14之間的間隙。電極端部之間的放電電壓大約為15千伏時的最佳間隙為1-1.5毫米。電極14本身的制作和安裝的方法顯然有多種方式，盡管優(yōu)先采用的電極是相當(dāng)耐用的，電極之間的放電間隙的距離要易于調(diào)整。
火花室12上面設(shè)有間隔圈16。間隔圈16可以由與火花室12相同的PVC管構(gòu)成，最好切割成垂直長度為6毫米。在用于單一作物種轉(zhuǎn)化的固定裝置中，間隔圈16應(yīng)當(dāng)僅被構(gòu)成火花放電室12的垂直延伸部分，雖然可移動的和可替換的間隔圈16可調(diào)節(jié)火花放電到承載板的可變更的距離，使得粒的加速力可以按條件或者種來加以改變。如果采用大的承載板18，則可以使間隔圈16在頂上開口，但也可以方便地通過適當(dāng)?shù)拿芊獠糠值叵拗祈敳块_口以形成一個大約9毫米×13毫米的長方形孔。在間隔圈16頂上放置的是承載板18。承載板18是一塊具有合適尺寸的光亮平板，放置在間隙圈12的頂上。承載板18是由柔軟的生物學(xué)上隋性的板材構(gòu)成，能夠在其上裝載生物學(xué)上隋性的微粒。承載板18的作用是把由火花放電發(fā)生的沖擊波的力傳遞到加速的載體微粒上。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，承載板18是由1毫米或0.5毫米涂復(fù)浸鋁的聚酯薄膜的塑料構(gòu)成，最好采用0.5毫米板，因為在實踐中這種板具有較好的透入花粉的性能。根據(jù)通常的實踐，承載板18的實際表面積越小，載體微粒進(jìn)入花粉的穿透性越好。關(guān)于穿透性的這種看法由需要具有的承載板的尺寸來權(quán)衡，所說的板要易于處理且在足夠大的范圍內(nèi)提供能夠使塞滿每種單獨注入的大量花粉細(xì)胞的沖擊圖式。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，9×11毫米的承載板是一種較好的尺寸，它可能以要求的沖擊圖式使微粒穿過花粉靶。
承載板的作用還在于安排微粒的圖式，當(dāng)它們接觸靶子表面時。為了保證靶子上的許多細(xì)胞盡可能地被沖擊，對微粒的圖式的均勻性要求相當(dāng)高，以便使轉(zhuǎn)化突變型的效率達(dá)到最大。未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、花粉或者相反可以與轉(zhuǎn)化突變型一起處于競爭的有利地位或者它們被載體微粒部分地變?nèi)?。故而，要求盡可能以接近100%注入靶子細(xì)胞中，而承載板18上微粒的均勻?qū)雍蛨D式有助于這個目的。
至于載體微粒本身，任何生物學(xué)上隋性的高密度材料均可用作本發(fā)明范圍內(nèi)的DNA載體微粒。最好采用金屬材料，例如鎢和金，其比重為19。銥也可優(yōu)先采用，其比重為22，但申請人尚未用過，因為通常它只易買到粉末，而最好采用球粒。與金相比，鎢也很少被采用，因為它在具有極低濕度的空氣中就會氧化。載體微粒上的這種氧化層會使微粒結(jié)合在一起，當(dāng)微粒聚集在一起時會引起平均粒度顯著增大。以不規(guī)則聚集成塊的粒顆對實施本發(fā)明是不適宜的，因為這種聚集將使其質(zhì)量和大小有很大的變化，因此難以獲得有規(guī)律的重復(fù)的結(jié)果。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，金是用作本發(fā)明的微粒的一種最佳材料，因為它具有高的比重，對生物物質(zhì)和氧化均是比較隋性的，并且具有1-3微米直徑的球狀體也容易從市場上買到?？梢园押线m的DNA順序施加到金微粒上，再把金微粒以將在下文詳細(xì)討論的方式施加到承載板上。
在承載板18上放置的是保持篩20。保持篩20是一種100目不銹鋼篩，以物理方式設(shè)置在間隔圈16上大約5毫米的塑料支架中。保持篩20的作用是把載體板18限制得它不能對靶子動作。
靶子表面22是一塊平板材，能夠懸浮靶子細(xì)胞，也即其上的花粉或者其它植物細(xì)胞。實踐中業(yè)已發(fā)現(xiàn)，易于采用的靶子是一種陪替氏培養(yǎng)皿，尺寸為60毫米×15毫米，倒置在固定保持篩的組合件的頂上。從保持篩20到靶子表面22上靶細(xì)胞的間距最好為大約15毫米。在下述的電壓條件和氣壓下，間距大于15毫米會降低載體微粒進(jìn)入花粉的穿透性，而間距小于10毫米，會導(dǎo)致壓碎細(xì)胞，結(jié)果使保持篩20在沖擊波的力作用下變形。
如果用花粉作靶細(xì)胞，則必須以這樣的方式，即用能存活的花粉可使靶子轉(zhuǎn)化，將花粉施加于靶子。因為一般來說花粉對濕度是敏感的，所以把花粉附著在靶子上所用的方法應(yīng)當(dāng)是盡可能無濕度。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，礦物油可用作這種附著劑。如果把礦物油的薄層施加在用作靶表面22的陪替氏培養(yǎng)皿的底部，則將花粉撒入培養(yǎng)皿，然后把培養(yǎng)皿翻過來去除多作的花粉，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，較均勻的單層花粉粒保持在靶子上，所說靶子是在進(jìn)行注射顆粒時將保持在原位，并且將保持存活。如果在該裝置中用細(xì)胞而不是花粉，采用其它支承培養(yǎng)基如瓊膠可能是較為合適的。
微粒加速器10和靶表面22的整個組合件必須被部分地抽成真空，以防大氣阻力使微粒和(或)承載板18減速。真空應(yīng)當(dāng)僅僅是部分真空，因為高真空會使靶花粉細(xì)胞干燥，從而使它們不能存活。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，足夠且有利的真空度為460-480mmHg。
以下最簡單地說明圖1裝置的操作，使加速器10點火的方法以在電極14之間放置一滴蒸餾水或者軟化水24開始。水量必須加以選擇，不使在電極之間出現(xiàn)的電弧減弱，但還是要有足夠的水量，以便在出現(xiàn)放電時在火花室12的內(nèi)部形成沖擊波。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，優(yōu)先采用的水量大約為2-4微升。水量可用移液管使其懸掛在電極的端部之間來施加。水滴24跨接在電極之間并保持在位置中。
然后，把間隔圈16放置在火花室12的頂上，再把承載板18放置在間隙圈16的頂上。保持篩20被設(shè)置在承載板18上面5毫米處，由倒置陪替氏培養(yǎng)皿組成的靶表面22放置在安裝保持篩20的上面。然后，把組合件抽真空到480mmHg。
在圖1所示裝置的外面，將電源連接上以產(chǎn)生15000伏DC。然后使其與電源斷開。通過接通合適的開關(guān)，再把電容器上的15000伏電荷施加在電極14之間。
當(dāng)施加電壓時，放電電弧在兩根電極14之間跳躍。電弧立刻使在電極之間延伸的小水滴汽化。來自水滴的爆炸式汽化的沖擊波在整個火花室12的內(nèi)部傳播。當(dāng)沖擊波到達(dá)承載板18時，承載板18被垂直升起脫離間隔圈16并被加速朝向保持篩20。當(dāng)承載板18擊中保持篩20時，承載板18被限制在原位上，在承載板18上所帶的微粒離開承載板，自由地飛越一段距離到靶表面22上靜置的細(xì)胞上。如果該裝置結(jié)構(gòu)和調(diào)整合適并工藝合理，則很大百分比載體微粒將以正確的速度達(dá)到靶子，穿透在靶表面22上所帶的細(xì)胞，而不破壞大量的細(xì)胞。然后，把靶表面22上的細(xì)胞從靶表面22中取出，選擇合適的方式把轉(zhuǎn)化突變型同未轉(zhuǎn)化體分開。正如本方法中所優(yōu)先采用的那樣，如果采用花粉，則從靶表面22中取出花粉，并手工將花粉傳給可結(jié)實的雌花上，例如玉米穗絲，雌花然后將結(jié)籽或者結(jié)粒。將種子收獲起、種植以及評價以在載體微粒上所帶的DNA傳入花粉所制約的形態(tài)或者生物化學(xué)的特征。另外從正在發(fā)育的種子組織切下未成熟的胚，使胚在合適的組織培養(yǎng)中長出小的植物幼苗或者完整的植物。然后，對這些植株、植物苗或者來自它們的組織進(jìn)行試驗，以基于轉(zhuǎn)化到花粉細(xì)胞的DNA中所帶的可選擇的標(biāo)記物作選擇。合適的可選擇的標(biāo)記物應(yīng)當(dāng)包括外源的抗性特征，例如對除草劑或抗菌素抗性，或者可以觀察它們表達(dá)的顯性形態(tài)特征。
可以認(rèn)為，雖然圖1的裝置是為本發(fā)明的以花粉介異的植物轉(zhuǎn)化的方法而專門研制成的，但該裝置本身也可用于其它組織類型、植物、動物或者細(xì)菌的加速微粒轉(zhuǎn)化。該裝置通過改變間距或者放電電壓容易調(diào)整微粒的力。本裝置操作相當(dāng)簡單、效率高而且穩(wěn)定，以致可重復(fù)結(jié)果。
在本發(fā)明的優(yōu)先采用的方法中，把DNA順序施加到微粒的方法、把微粒敷在載體板中的方法以及制備植物轉(zhuǎn)化用的DNA的方法都要求特別注意。這些細(xì)節(jié)將一一進(jìn)行討論。
DNA順序包括以適合于植物轉(zhuǎn)化的形式制備的外源基因，可簡單地在裸露金或者鎢丸上干燥。然而，這種形式的DNA分子就會具有相當(dāng)短期的穩(wěn)定性和由于與微粒本身的金屬的或氧化物的基質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而相當(dāng)迅速地降解。相反，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，如果載體微粒先用包復(fù)劑涂復(fù)，則DNA鏈大大地改善了穩(wěn)定性，甚至在幾個星期內(nèi)都無明顯降解。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，合適的包復(fù)劑是聚賴氨酸(分子量200，000)，可以把它施加到載體微粒后再用DNA分子。其它的包復(fù)劑，如聚合物或其他的物質(zhì)也可用作類似的包復(fù)劑。通過在0.02%的聚賴氨酸溶液中沖洗金微粒把聚賴氨酸施加到微粒上，然后在空氣干燥或加熱干燥由此對微粒涂復(fù)。一旦用聚賴氨酸鏈涂復(fù)的金屬微粒經(jīng)適合地干燥，則可以把DNA鏈載在微粒上。DNA可以每毫克金小球含有3-30微克DNA涂載在微粒上。實踐中，應(yīng)當(dāng)加100微克DNA和30毫克用聚賴氨酸預(yù)涂復(fù)的1-3微米金球，隨后是5微升10mM Na2HPO4，然后是5微升10mM Ca Cl2，以提供細(xì)的Ca HPO4沉淀物。這種沉淀物是由干燥而形成的。該沉淀物把與它一起的DNA帶到小球上。一旦小球和磷酸鹽和氯化鈣的溶液與DNA混合，則懸浮液在氮氣流中不斷攪拌下干燥。一旦干燥，沉淀物立刻再懸浮在100%乙醇中，作為把微粒放置在載體板上的方法。
在把微粒施加到載體板中，作為這種工藝的成功的操作，最好是在載體板上形成均勻且可再現(xiàn)的載體微粒層。為此，微粒不能簡單地撒在載體板上，因為它們會聚集，從而以不可再現(xiàn)的方式不均勻地分布在板上。具體地說，板上水份或者水含量將破壞微粒應(yīng)用到板上并導(dǎo)致不希望的聚集。所以，首先必需用親水涂料預(yù)涂復(fù)聚酯薄膜板，以防在施加載體微粒時弄上水。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，羥基乙基纖維素可為該目的很好地工作，雖然其它類似的處理，例如酸性經(jīng)水解纖維素，也是可行的。抹去涂復(fù)浸鋁聚酯薄膜塑料上的1%羥基乙基纖維素的溶液，然后用離子化水沖洗，在空氣中干燥。用包含懸浮在100%乙醇中的DNA鏈的沉淀涂料把載體微粒施加到載體板上。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，以合適的均勻和可再現(xiàn)的方式成功地用移液管把50或100微升經(jīng)充分?jǐn)嚢璧囊掖寂c載體微粒懸浮液吸移在聚酯薄膜板上。然后，使這種懸浮液的吸移部分安置在封閉的陪替氏培養(yǎng)皿中至少30秒鐘。陪替氏培養(yǎng)皿必須密閉，以防室內(nèi)空氣流和從快速汽化引起的渦流形成，這種渦流可能會引起微粒的偏移，故而使微粒在板上呈不均勻分布。在放置期之后，彎液面方被破壞，排除多余的乙醇。在局部打開的陪替氏培養(yǎng)皿中蒸發(fā)去除殘存的乙醇。
這種方法旨在把用含有DNA鏈的沉淀涂復(fù)的載體微粒置于聚酯薄膜承載板上。本發(fā)明中成功地發(fā)現(xiàn)的正好中間的速度為大約0.1毫米帶沉淀的載體微粒，DNA施加到9×11毫米面積的承載板。承載板上用這種密度的載體微?？墒沟没ǚ酆芎玫卮婊睿€可使加速微粒具有高的花粉粒的穿透力。微粒的實際的加速和對花粉粒的穿透力將隨花粉粒大小和直徑二者而變化，按需要給靶細(xì)胞的每個橫截面積多少微粒，載體微粒的數(shù)目也顯然是不同的。
在本發(fā)明中所用的DNA必須被建造到一個合適表達(dá)玉米或者本發(fā)明中用的其它的植物的細(xì)胞中外源基因的載體之中。DNA順序可以是嵌合的，但也可以采用來自其它植物種或相同種的系的完全完整的非嵌合基因。適合于植物中表達(dá)的載體，除所要求的外源基因的編碼順序之外，一般來說必須包括合適的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序，例如能夠促進(jìn)在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的合適的啟動子和能夠使轉(zhuǎn)錄末端發(fā)信號或者能夠以信使的合適翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)合成的方式適當(dāng)?shù)奶幚鞤NA的翻譯終止區(qū)。上面業(yè)已說明，在雙子葉植物中能夠引起編碼順轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的植物基因啟動子在細(xì)胞水平上在諸如玉米的單子葉植物中也是有效的，盡管在某些情況下效果較差。Fromm等人.，Proc、Natl.Acad.Sci.USA，825824-5828，1985年9月。這種啟動子包括來自植物病原體，根癌病土壤桿菌的藍(lán)曙紅合酶啟動子和由花椰菜花葉病病毒順序衍生的Ca Mv35s啟動子。植物中起作用的合適的終止順序是來自根癌病土壤桿菌藍(lán)曙紅合酶基因的聚腺苷酸順序。
植物表達(dá)載體也可含有在植物細(xì)胞中起作用的用于選擇轉(zhuǎn)化突變型植物的可選擇標(biāo)記物?？蛇x擇的標(biāo)記物可以決定可作生化上測定的特征或者可在后代植物中觀察到的表型特征。顯然，如果本發(fā)明采用來自相同或者別的植物且具有側(cè)翼調(diào)節(jié)順序的非嵌合整體基因，則嵌合啟動子或者控制順序并非必要而可用具有其天然順序的基因。
顯然關(guān)于花粉介異的玉米轉(zhuǎn)化，本發(fā)明的方法已作了詳細(xì)地敘述，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，這并非本方法只限用于玉米，本方法同樣適用于其它谷類作物以及雙子葉作物，例如大豆和棉花，還有多數(shù)其它植物的花粉轉(zhuǎn)化。處理其它種的花粉的手續(xù)需要加以改變，對載體微粒速度起決定作用的本裝置的部件的間隙可根據(jù)種作改變，但基本的裝置和步驟可用于其它植物種。
此外，雖然本發(fā)明的方法旨在針對花粉介導(dǎo)的植物的轉(zhuǎn)化，但本文所揭示的裝置同樣適用于其它植物組織的轉(zhuǎn)化，例如胚胎發(fā)生的胼胝體或者體細(xì)胞胚，或培養(yǎng)中的任何其他植物或其它組織。
因為并非所有的花粉均有插入它們中的載體微粒，還因為并非所有的花粉細(xì)胞或者后代合子吸收DNA進(jìn)入它們的染色體組中，故而必需在某些階段篩選后代植物，以選擇轉(zhuǎn)化突變型。如果要求把給定的外源基因轉(zhuǎn)入一種植物中，則可把該基因插入嵌合的表達(dá)載體中，然后，應(yīng)把嵌合的表達(dá)載體與可選擇的標(biāo)記物質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中，例如下文所述的PCMC1022。兩種載體(外源基因和可選擇的標(biāo)記物)給合在一起制成一個質(zhì)粒，或者可以分別克隆兩種載體，然后一起施加到相同的載體微粒上。在上述任何一種情況下，產(chǎn)生的后代均要按標(biāo)記物篩選，以選擇已轉(zhuǎn)化的后代。雖然在某些情況下應(yīng)用這種可選擇的標(biāo)記物是需要的，但如果有一種可用于合適的形態(tài)或生化試驗，篩選已轉(zhuǎn)化的后代，則可以省略。形態(tài)篩選試驗應(yīng)用于后代中一種顯性表型特性。合適的生化篩選試驗應(yīng)是一種所謂“南方”斑點雜交探針，用于探測后代植物的染體組中轉(zhuǎn)化DNA本身的存在。
實施例1.載體的結(jié)構(gòu)A.抗生素抗性圖2和圖3示意地說明合適的植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。圖2所示為一種植物表達(dá)載體PCMC1208的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒PCMC1208的結(jié)構(gòu)開始于用核酸內(nèi)切限制性酶Taq Ⅰ消化質(zhì)粒PBR325(Bolivar，F(xiàn)、Gene∶4∶121-136，1987)。質(zhì)粒PBR325含有一種由Taq Ⅰ消化質(zhì)粒的殘留物中存在的抗菌素抗性基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的編碼順序。在PBR325消化之后，用電泳把片斷溶解在瓊脂糖凝膠中，含有CAT基因的片斷切下來后，將CAT片斷結(jié)合到預(yù)先業(yè)已由限制性酶ACC Ⅰ消化的質(zhì)粒Puc9上(Viera & Messing，Gene，19259-268，1982)。由Taq Ⅰ和ACC Ⅰ所產(chǎn)生的片斷末端在這種情況下是互補的，由此所得的鏈可直接結(jié)合。所得質(zhì)粒在圖2中稱為PUC-CAT含有側(cè)面與PUC9的多銜接物幾部分相接的CAT編碼順序，由Pst Ⅰ和BamH Ⅰ消化這種質(zhì)粒，并用凝膠電泳分離兩種片斷中的較小者。然后，將這種片斷結(jié)合到中間植物表達(dá)載體PCMC66上，它預(yù)先由Pst Ⅰ和BamH Ⅰ消化，以形成CAT表達(dá)質(zhì)粒PCMC1205。這種質(zhì)粒PCMC66含有來自根癌病土壤桿菌的藍(lán)曙紅合酶啟動子(NOSPr)和來自相同有機體的包圍6個質(zhì)粒獨特的限制位的籃曙紅合酶多聚腺苷酸順序(Poiy A)。質(zhì)粒PCMC66還帶有可表達(dá)抗細(xì)菌中抗菌素氨芐青霉素的β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)的譯本，以致可把氨芐青霉素抗性用作隨后在大腸桿菌中實施的重組中的選擇標(biāo)記物。
由Stu Ⅰ消化質(zhì)粒P Ca MV 10(Gardner等人.Nucl Acids Res 92871-2888，1981)，并將含有花椰菜花葉病毒35啟動子(Ca Mv 35s)的片斷連接到合成的Hind Ⅲ寡核苷酸銜接物上。然后，由HPh Ⅰ消化片斷，用DNA多聚酯處理以產(chǎn)生飩圓的末端，再把它連接到合成的Hind Ⅲ寡核苷酸銜接物上。用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ兩者消化這種片斷生成了一種含有Ca Mv 35s啟動子的片斷，在其末端上通過添加限制部位順序改變轉(zhuǎn)錄起始部位。通過由Xho Ⅰ和Hind Ⅲ消化質(zhì)粒從PCMC1205切下籃曙紅合酶啟動子。由此產(chǎn)生的兩種片斷中的較大者與Ca Mv 35s啟動子片斷結(jié)合依次產(chǎn)生PCMC1208具有Ca Mv 35s啟動子的植物表達(dá)載體，CAT編碼順序以及籃曙紅合酶聚腺苷酸順序。Ca Mv 35s啟動子和Poly A順序可用作CAT編碼順序的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序。
通過electroporation進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi)試驗質(zhì)粒PCMC1205和PCMC1208兩者在玉米中的活性，隨后，試驗CAT活性。兩種結(jié)構(gòu)證明在玉米細(xì)胞中是有活性的，但PCMC1208的活性水平相當(dāng)高，因此可被選作植物轉(zhuǎn)化實驗。
把質(zhì)粒PCMC1208用于在本發(fā)明的裝置和方法中對玉米進(jìn)行花粉介異遺傳轉(zhuǎn)化。然而，已發(fā)現(xiàn)，CAT活性試驗表明玉米組織具有高的背景水平，故而CAT基因并不是玉米的最佳標(biāo)記物。因此，如圖3所示，對該質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步操縱，把別的在玉米中有更多選擇性的抗菌素抗性基因播入載體中，以代替CAT基因。
質(zhì)粒PCMC1021含有籃曙紅合酶啟動子和籃曙紅合酶聚腺苷酸順序，后者與決定了氨基糖苷抗菌素(對諸如卡那霉素)的抗性的氨基糖苷-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(APH3′Ⅱ)的一個編碼區(qū)側(cè)面相接。因為electroporation實驗揭示了Ca Mv 35s啟動子在玉米比Nos Pr有效得多，故而決定把Ca Mv 35s啟動子轉(zhuǎn)換到PCMC1021。如圖3所示，PCMC1208中的Ca Mv 35s片斷通過由Xho Ⅰ和Hin Ⅰ消化以及通過電泳分離。質(zhì)粒PCMC1021還由Xhod Ⅲ和Hind Ⅲ消化，分離較大片斷并與Ca Mv 35s片斷結(jié)合以生成PCMC1022。在質(zhì)粒PCMC1022中，APH3′Ⅱ中的編碼順序是與調(diào)節(jié)的Ca Mv 35s和Nos PA順序側(cè)面相接。
質(zhì)粒PCMC1208和PCMC1022經(jīng)轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)分析均被表明用作煙草、棉花、大豆和玉米的單個細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)是有效的。業(yè)已征明，用APH3′Ⅱ轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中的植物細(xì)胞(對棉花、大豆和玉米細(xì)胞)已證明對卡那霉素是有抗性的。
B.胚乳染色標(biāo)記物已獲得一種稱之PMBZRI的質(zhì)粒，它含有玉米基因組DNA的大約9.9千堿基(Kilobase)Eco R Ⅰ片斷，它包括以為酶UDP葡萄糖-加味的葡糖基轉(zhuǎn)移酶編碼的整個基因，這種酶是合成玉米中花色素苷色素所需的酶?；蚪M片斷含有延伸的5′和3′側(cè)翼DNA，因此可以預(yù)期它包括可在玉米中有效地表達(dá)基因的合適的調(diào)節(jié)順序。因為克隆的基因是一種正常的、玉米功能基因的整長度的拷貝，故而期望克隆的基因應(yīng)當(dāng)在玉米細(xì)胞是完全活性的和合適的功能。
酶UDP葡萄糖-加味的葡糖基轉(zhuǎn)移酶本身可用作玉米的遺傳轉(zhuǎn)化中的可選擇的標(biāo)記物，因為玉米系是可得到的，它帶有使內(nèi)源基因失活的隱性突變。因為這種酶對植物生長和發(fā)育并非不可缺少的，所以突變體系的植物是正常的，除了缺少在野生型或者非突變型玉米植物的各種組織所產(chǎn)生的紅的花色素苷色素。將野生型基因引入到純合的突變體系，從而導(dǎo)致了酶的產(chǎn)生和由此最后產(chǎn)生花色素苷，以致使轉(zhuǎn)化突變型表達(dá)載體植物由于它們的特征顏色而可易于識別。故而，質(zhì)粒PMBZRI適合用作玉米中的典型載體，無需加以改變，當(dāng)與別的所考慮的基因結(jié)合時，適合用作通常篩選轉(zhuǎn)化作用標(biāo)記物，這是一種有用的非嵌合基因的實例。
2.玉米用PCMC1022轉(zhuǎn)化大量用作載體微粒的1-3微米金小球通過在0.02%聚賴氨酸中沖洗預(yù)先涂上聚賴氨酸，再空干。把33毫克經(jīng)涂復(fù)的小球加入到有100微克PCMC1022的水溶液中，然后依次加入5微升10m M Na2HPO4和10m M Ca Cl2，當(dāng)所說溶液在N2氣流中干燥時，則生成細(xì)的沉淀物，然后，使干燥的沉淀物涂復(fù)小球在100%乙醇中重新懸浮，并使其沉積在2.0毫米涂復(fù)浸鋁的聚酯薄膜板的塑料上面積大約為1厘米×1厘米。經(jīng)涂復(fù)的小球以0.1毫克/厘米2的最終密度施加到聚酯薄膜承載板上。
帶有經(jīng)涂復(fù)的小球的承載板設(shè)置在圖1所示的裝置中的間隔圈16頂上，用手從早熟的桑格魯甜玉米(Early Sun-Glo Sweet Corn)中收集花粉。將礦物油輕輕地涂到60毫米陪替氏培養(yǎng)皿的底部，并把花粉撒在上面，倒置培養(yǎng)皿去除多余的花粉，留下一層花粉。陪替氏培養(yǎng)皿在圖1所示的裝置中用作靶表面22。
對圖1中經(jīng)組合的裝置抽真空，真空度為55-60mmHg。由1微法電容器供給的15KV放電電壓經(jīng)電極14放電，使經(jīng)涂復(fù)的微粒迅速沖到靶表面22上的花粉。
制備小球和花粉以及圖1裝置的點火過程重復(fù)幾次直到積聚了適當(dāng)?shù)慕?jīng)處理花粉的供應(yīng)量。用刷子刷去陪替氏培養(yǎng)皿底部的經(jīng)處理的花粉，用手把經(jīng)處理的花粉授粉在Kaltenberg 390和CFS5504雜種的雌植物的穗絲上。以物理的方式使穗絲與其它的花粉分開。
以這種方式使谷穗授粉，生產(chǎn)出52顆谷粒。在授粉后14天，從谷穗切下未成熟的胚，并把它置于含有每一百萬之五十卡那霉素的玉米胚組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)。直接試驗在培養(yǎng)基上成長的幼苗以了解APH3′Ⅱ活性，其中三顆幼苗試驗為陽性，這就表明APH3′Ⅱ酶在幼苗的組織中得到表達(dá)，故而認(rèn)為這些植物的轉(zhuǎn)化是成功的。
把這些植物中的一株置于非選擇的培養(yǎng)基上，然后將其移入溫室繼續(xù)生長。分析葉組織以了解連續(xù)APH3′Ⅱ的活性表明為陽性。
從這種植物分離的DNA中PCM1022順序的存在和一株植物不呈陽性是通過南方雜交技術(shù)證明的。Southern，J.Mol.Bio，98503-577(1975)。從對照和試驗玉米葉試樣分離DNA是用Taglor和Powell(Focus，44-6，1982)的十六烷基三甲基溴化銨方法略加改進(jìn)的方法進(jìn)行。用限制性酶Ava Ⅰ和Hind Ⅲ消化10微克每種DNA試樣，通過在瓊脂糖凝膠電泳分解，再轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，以及與相應(yīng)于APHⅡ編碼區(qū)的非編碼鏈的32P-標(biāo)記的探針雜交。在洗滌過濾之后，由放射自顯影術(shù)觀察雜交的DNA片斷。
在任何一組植物中均未發(fā)現(xiàn)所期望的1Kb片斷。然后，每種植物均呈現(xiàn)大約4Kb片斷，該片斷用與APH3′Ⅱ探針雜交，且在玉米DNA的任何控制非轉(zhuǎn)化的對照試樣中均未發(fā)現(xiàn)。兩種植物(一種為APHⅡ陽性)之一還呈現(xiàn)3.7Kb特殊雜交的片斷。所觀察到的片斷并非是所期望的尺寸的這一事實沒有使人感到很驚奇，因為通常觀察到復(fù)雜的限制模式以了解進(jìn)入植物和動物細(xì)胞的DNA式。Perucho等人，Cell，22309-317(1980)，Kiens等人;PlantMol，Biol.，5223-224(1985);Paszkowski等人，EMBOJ.;32717-2722(1984);Riggs and Bates ProcNatl Acad，Sci.USA，835602-5606(1986)。此外，真核細(xì)胞中的DNA可通過甲基化作用加以改變，以這些方法，可以改變它的所預(yù)期限制性消化模式。Chandler和Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，831767-1771(1986)。眾所周知，在本實施例所用的核酸酶內(nèi)切限制酶Ava Ⅰ和Hind Ⅲ兩者在它們的識別順序中由專門的甲基化作用所限制。Mc Cle 11和Nelson，Nucleie Acids Res，13r 201-r 207(1985)。4Kb片斷長度相當(dāng)于PCMC1022質(zhì)粒的質(zhì)粒單位長度，并表明這些植物含有該質(zhì)粒的重復(fù)拷貝。然后，僅用其中一種酶消化將產(chǎn)生所觀察到的質(zhì)粒長度片斷。3.7Kb片斷看來似乎是由質(zhì)粒的重排所引起的結(jié)果，也許在其與自然的玉米DNA的接合點上。
用在CFS5504植物的穗絲上的花粉，以上述相同的方法作兩種附加再復(fù)制，以隨機的方式從所生成的植物中選擇由該方法所產(chǎn)生的兩株植物，檢驗APH3′Ⅱ并用Southern斑點法進(jìn)行分析。兩株植物均未顯示APH3′Ⅱ活性，但證明在它們的染色體組中有4.0Kb雜交片斷。用A188的花粉以相同的方法進(jìn)行另一復(fù)制，硬質(zhì)母體再形成后代，從中可隨機選擇一株植物供分析應(yīng)用。這種植物的葉子經(jīng)試驗為APH3′Ⅱ陽性，還證明用Southern斑點分析中有4.0Kb片斷。
3.具有其它基因的PCMC1022的應(yīng)用為了把所研究的其它基因轉(zhuǎn)入玉米或者其他植物中，質(zhì)粒PCMC1022可以以幾種方法中的任何一種方法被應(yīng)用。通過由Hind Ⅲ和BamH Ⅰ消化PCMC1022，可以刪除APH3′Ⅱ編碼順序，用合適的末端制備的別的所研究的基因可以適當(dāng)?shù)剡x擇順序可被結(jié)合在其位置上。如果所研究的基因可以適當(dāng)?shù)剡x擇，該質(zhì)粒可直接地用于轉(zhuǎn)化。如果用合適的調(diào)節(jié)順序分別地制備所研究的基因以及需要一種可選擇的標(biāo)記物，則可以把具有它的調(diào)節(jié)順序的所研究的基因可以插入PCMC1022中的CAMV35s順序的多銜接物上流中任何位置。利用PCMC1022可選擇標(biāo)記物的另一替代方法是制備在PCMC1022中或者任何其它植物表達(dá)載體中的所研究的基因以及把PCMC1022和基因表達(dá)載體一起涂復(fù)在如本文所揭示載體微粒上用于轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。
質(zhì)粒PCMC1022已于1986年11月14日保藏在ATCC12301 Parklawn Drive，Rockville MD，USA;ATCC保藏號No_。
以上保藏處是按照ATCC和本發(fā)明的受讓人中的合伙人Cetus公司之間訂立的合同作出的。與ATCC訂立的合同規(guī)定，在敘述和鑒別保藏物的美國專利頒發(fā)或出版或者對任何美國公眾公開或?qū)ν鈬鴮＠暾埌腹_時，而不管哪一種在先，均為公眾提供永久可靠的細(xì)胞系后代，而且為根據(jù)35 US73 122節(jié)和專利局長的規(guī)定(包括37CFR1.14節(jié)具體參考886 O.G638)授權(quán)給美國專利和商標(biāo)局長確定的人提供這些細(xì)胞系的后代的有效性。本申請人的受讓人已同意，如果保藏中的細(xì)胞系在合適的條件下培養(yǎng)時死了，失活或被破壞，則將按通知立即用相同細(xì)胞系的存活培養(yǎng)物來更換。
本發(fā)明并不限于保藏微生物的范圍，因為保藏的實施旨在對本發(fā)明的一個方面作簡單的說明，功能上相當(dāng)?shù)娜魏挝⑸锸菍儆诒景l(fā)明的范圍。當(dāng)然，除了本文所說明和敘述的之外，本發(fā)明的各種改進(jìn)對本技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的技術(shù)人員來說將是顯而易見的，并包括在以下權(quán)利要求
的范圍內(nèi)。
還應(yīng)當(dāng)指出，核苷酸所給出的全部堿基對的尺寸都是近似的，并供敘述用。
權(quán)利要求
1.一種培育經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物系的方法，其特征在于所說的方法包括以下步驟制備包含編碼區(qū)和側(cè)翼調(diào)節(jié)順序有效地在植物細(xì)胞中表達(dá)編碼區(qū)；的外源基因的拷貝；將外源基因的拷貝連接在生物學(xué)上隋性的載體微粒上；用物理方法以下列方式使帶有嵌合基因拷貝的微粒向植物的花粉加速，以這種方式使某些微粒射入某些花粉的內(nèi)部；用經(jīng)上述處理的花粉使植物的雌性器管授粉；以及在這種授粉所產(chǎn)生的后代中篩選出已轉(zhuǎn)化的后代。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說的生物學(xué)上隋性的微粒是金屬微粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說的金屬微粒是金小球。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說的方法在將嵌合基因拷貝連接在金屬微粒上之前還包括用包復(fù)劑涂復(fù)金屬微粒的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于所說的包復(fù)劑為聚賴氨酸(Polylysine)。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于所說的將外源基因拷貝連接到金屬微粒上的步驟包括干燥微粒上基因拷貝的溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于所說的基因拷貝溶液包括與基因拷貝一起沉淀在金屬微粒上的CaHPO4。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于以物理方法加速微粒的步驟包括使微粒在平面承載板上成層，通過沖擊波沖擊承載板使其加速以及制止承載板，以致載體微粒的動量使其離開所說的板。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的方法，其特征在于產(chǎn)生沖擊承載板的沖擊波是由高壓經(jīng)水滴搭橋的火花間隙放電產(chǎn)生。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說的使微粒向植物花粉加速的步驟包括把單層花粉鋪設(shè)在靶表面上和把靶表面設(shè)置在載體微粒的加速通道中。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的方法，其特征在于把花粉鋪設(shè)在靶表面上是由把一層礦物油施加在靶表面上，把花粉撒在其上以及由此去除多余的花粉來實現(xiàn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于使植物雌性器官授粉的步驟是由用刷子從靶表面刷下微粒已被加速進(jìn)入花粉之中的花粉和把那種花粉撒在經(jīng)選擇的母本植物的雌性器官上來實現(xiàn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于在后代中的篩選是基于生化試驗作出的。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的方法，其特征在于所說的試驗是抗菌素抗性試驗。
15.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于在后代中的篩選是基于形態(tài)學(xué)的植物特征作出的。
16.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說的植物是玉米。
17.用權(quán)利要求
1的方法遺傳轉(zhuǎn)化的一些植物。
18.用權(quán)利要求
1的方法遺傳轉(zhuǎn)化的玉米植物。
19.一種培育遺傳轉(zhuǎn)化的玉米植物的方法，其特征在于所說的方法包括以下步驟以物理的方式把包含編碼區(qū)和合適的調(diào)節(jié)順序注入父本植物的玉米花粉;用手把花粉授于母本植物的成熟玉米穗絲和把穗絲同其它花粉源分開;載種從經(jīng)授粉的母體植物中產(chǎn)生的后代。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19所述的方法，其特征在于所說的物理注射步驟包括把外源基因的拷貝連接到載體微粒上和使微粒向玉米花粉加速。
21.根據(jù)權(quán)利要求
20所述的方法，其特征在于所說的載體微粒是用包復(fù)劑涂復(fù)過的金小球。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21所述的方法，其特征在于所說的包復(fù)劑是聚賴氨酸(Polylysine)。
23.根據(jù)權(quán)利要求
20所述的方法，其特征在于所說的使微粒向玉米花粉加速的步驟包括通過用礦物油涂復(fù)靶表面并把花粉撒在靶表面上，使花粉固定在靶表面上。
24.根據(jù)權(quán)利要求
20所述的方法，其特征在于通過干燥把外源基因涂復(fù)在載體微粒上。
25.用權(quán)利要求
19的方法培育玉米植物。
26.一種在其染色體組織中包含外源基因的玉米植物，其特征在于所說的外源基因通過物理方法注入到植物花粉親本的花粉中引入到植物中。
27.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的玉米植物，其特征在于所說的物理注射是由把外源基因涂復(fù)在加速進(jìn)入花粉的載體上來實現(xiàn)。
28.根據(jù)權(quán)利要求
26所述的玉米植物，其特征在于所說的外源基因包括編碼順序和合適的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序，使得編碼順序可在植物組織中表達(dá)。
29.一種具有根據(jù)權(quán)利要求
26所述的親本植物的玉米植物。
30.玉米花粉，其特征在于所說的花粉包括存在其中的外源嵌合基因和至少一粒以物理方式把基因帶入花粉的載體微粒。
31.根據(jù)權(quán)利要求
30所述的玉米花粉，其特征在于所說的外源基因包括編碼順序和合適的側(cè)翼調(diào)節(jié)順序，使得編碼順序可在花粉的后代中表達(dá)。
32.一種用于把帶有DNA的載體微粒注入活細(xì)胞的裝置，其特征在于所說的裝置包括電火花放電室;伸入所說的電火花放電室并由火花間隙隔開的兩根電極，所說的電極適用于連接在高壓放電的外電源上;以可垂直移動的方式在火電放電室上間隔設(shè)置的承載板，所說的承載板其上接受載體微粒;在承載板上應(yīng)有位置上固定的保持篩，以及在保持篩上間隔設(shè)置的靶表面，所說的靶表面帶有細(xì)胞，以便在放電室中產(chǎn)生沖擊波的電火花放電將使承載板加速進(jìn)入保持篩，以致使載體微粒加速進(jìn)入靶表面的細(xì)胞中。
33.根據(jù)權(quán)利要求
32所述的裝置，其特征在于所說的裝置還包括在電極之間搭架間隔的水滴。
34.根據(jù)權(quán)利要求
32所述的裝置，其特征在于所說的裝置還包括包圍所說裝置的真空室，以便使所說的裝置在低真空中工作。
35.根據(jù)權(quán)利要求
32所述的裝置，其特征在于電極之間的電火花間隙為大約1毫米到大約1.5毫米。
36.根據(jù)權(quán)利要求
32所述的裝置，其特征在于所說的裝置還包括設(shè)置在電火花放電室之上的間隔圈，但低于承載板且具有至少在其頂上局部開口。
專利摘要
本發(fā)明揭示了用于花粉介異的轉(zhuǎn)化的植物和植物系的遺傳轉(zhuǎn)化的方法和裝置。通過在以物理方式加速進(jìn)入植物花粉中的載體微粒上的涂復(fù)把外源基團(tuán)引入花粉中。然后用手使經(jīng)處理的植物花粉授粉，重獲后代，其中部分后代將在它們的染色體組織中含有外源基因。該工藝可以用于建立遺傳工程玉米植物和玉米植物系。
文檔編號A01H1/02GK87107264SQ87107264
公開日1988年8月24日 申請日期1987年12月4日
發(fā)明者丹尼斯·E·麥卡布, 威廉·F·斯溫, 布賴恩·J·馬丁奈爾 申請人:阿格拉塞特斯導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan