專利名稱：：可重構的干燥血液制品的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明專利是涉及可重構的干燥血液制品(reconstitutabledriedbloodproducts)，其制備及重構方法，及其醫(yī)學和非醫(yī)學(如研究)用途。醫(yī)院配有血液制品庫(如紅細胞濃縮物，血小板，血漿等)，用于外科手術等。包含無核血細胞(即沒有細胞核的細胞，例如紅細胞和血小板)的血液制品能迅速變質失效。血小板儲存在常溫下會迅速降解；如果沒有冷藏和儲存到大約1-4℃的冰箱中，紅血球會迅速降解。即使冷藏了，一段時間以后，這些血液制品也會變質失效并且必須丟棄，例如，對紅血球(紅細胞)為3-6周，對血小板為4小時-7天，因為無核細胞已經(jīng)死亡、變質、或基本上消失，或者由于細菌感染已達到了不可接受的程度。衛(wèi)生當局及醫(yī)院通常依賴于不斷地收集、分離和儲存血液來滿足他們的正常的需要，而且為了保持供給的最高水平，外科所需要的血液制品通常使用保存期內的儲存時間最長的產(chǎn)品，即處于次優(yōu)狀態(tài)的產(chǎn)品。當所供給不能充分滿足需要，例如遇到有大量傷亡的意外事件或者具有罕見血型的個體需要大量相容的血液制品，必須從遠的地區(qū)運輸新鮮的血液制品，因此如果供給及運輸受到限制，患者的生命將受到威脅。因此，在發(fā)生較大事故或大量傷亡事件的情況下，醫(yī)院和衛(wèi)生當局承擔著可供輸血用的血液制品不足的風險。在這種情況下，醫(yī)院和衛(wèi)生當局不能依賴能征集獻血者并在需要時間內得到足夠的血液，因為很重要的是，獻血者的血液在使用前要經(jīng)過檢測，以確定沒有各種疾病(如艾滋病感染等)。雖然低溫長期儲存一些細胞是可行的，例如在-196℃的液氮中，但對于無核細胞，這是不可能的，除非采用了外源性的防冷凍措施及復雜昂貴的冷凍和重構(reconstitution)的處理方法。這些方法不僅復雜，而且在災區(qū)或者武裝沖突地區(qū)并不適用，在這些地區(qū)通常沒有必要的連續(xù)可靠電力和液氮供應。常規(guī)的冷凍技術很簡單，不適用于包含無核細胞的血液制品。例如W.Tousel在他與H.Hindorf合作的文章“Principesetapplicationsdelalyophilisationdesproduitsbiologigues，pharmaceutiquesetalimentaires”(ScienceetTechniqueduFrod，Tokyo，Japan，1985，pages287-292)文后所附的討論，當問到是否有凍干這些產(chǎn)品的經(jīng)歷時，答復是“凍干這些如血小板和紅細胞等敏感的血細胞是不可能的。這些細胞可以通過液體貯存的方法保存，例如損失一些細胞的液氮的方法”。該討論還建議紅細胞可以通過冷凍在-28℃在含有25％甘油的液體中保存，或者通過其他冷凍技術保存在-196℃至-80℃。甘油或其他防凍劑的使用明顯是不受歡迎的，因為這些制劑在血液制品進行輸血液體前必須除去，而且如上所述，低溫技術需要復雜及昂貴的設備、材料和方法，而這些在災區(qū)(如地震、火山噴發(fā)或重大意外事故地區(qū))或者武裝沖突地區(qū)通常是不可得或不可行的。這就需要一些保存期長于現(xiàn)有水平的血液制品，而且在需求增加時能夠迅速重構輸入患者體內，例如當正確配型的血液制品耗盡時。此外，對于血液制品有特別要求，就是作為現(xiàn)有輸血液體制劑的安全可靠的替代品。另外，由于現(xiàn)有產(chǎn)品的體積和冷藏設備的原因，在邊遠的地區(qū)和較大的城區(qū)，血液制品的后勤保障都很復雜?，F(xiàn)在我們令人驚訝地發(fā)現(xiàn)以下是可能的生產(chǎn)含有無核細胞的干燥的血液制品，在常溫下保存或相對溫和的冷藏保存，即使在明顯超過同等的冷凍血液產(chǎn)品的最長保存期后，能夠使產(chǎn)品重構成含有活細胞的輸血液體。因此，從一個方面看出，本發(fā)明提供了干燥的顆粒狀的血液制品，這些顆粒包含存在于大分子保護物質中的無核血細胞。干燥的產(chǎn)品通過溶解在生理耐受性水溶液中，達到相應物種的血液的正常范圍內的等滲狀態(tài)，并在相應物種的正常日間體溫1℃內，包含完整的活細胞。更進一步看出，本發(fā)明提供了一種制備干燥的顆粒狀的血液制品的方法，這些顆粒包含存在于保護物質中的無核血細胞，所述的方法包括從哺乳動物供體(如人)獲取血樣；在所述樣品中加入抗凝劑；濃縮所述樣品中的細胞；從所述樣品中回收包含無核血細胞的濃縮液；用所述濃縮液浸漬包含大分子保護物質的顆粒；在-20℃到120℃的溫度范圍內(優(yōu)選地-10℃到40℃，對于高溫干燥機高達120℃是可行的)，干燥已浸漬的顆粒；并且任選地，用密閉容器包裝干燥的顆粒，尤其是在任何頂部空間都基本上無氧的容器，例如真空包裝。本發(fā)明中所使用的大分子保護物質優(yōu)選地是一種包含水溶性大分子的物質，分子量超過1000D，優(yōu)選地超過2000D，更優(yōu)選地為上述物質的混合物。優(yōu)選地包含對所采血液的物種為內源性的大分子，特別地為選自多聚糖、蛋白(包括糖蛋白)及脂類(如磷脂)。尤其優(yōu)選地包括天然存在于所采血液的物種中的大分子，如血漿蛋白、細胞內蛋白及細胞膜分子(如蛋白質和脂質等)。更具體地，所述物質優(yōu)選包含源自無核血細胞尤其是紅細胞的細胞膜分子。尤其優(yōu)選地，物質包括血影蛋白(spectrin)。在特別優(yōu)選的實施方案中，保護物質基本不含血紅蛋白，例如相對于紅細胞的血紅蛋白(干燥的固體成分)，血紅蛋白的濃度要低于50％wt，優(yōu)選地低于25％wt，更優(yōu)選地低于10％wt，尤其低于1％wt。已浸漬的顆粒干燥優(yōu)選在-5℃到37℃的溫度范圍內進行，尤其是-1℃到25℃，具體而言是0℃-15℃，更具體而言是1℃到10℃，例如3℃到5℃。干燥處理的持續(xù)時間將依賴于所使用的干燥技術，但優(yōu)選的不能超過10小時。干燥時間的上限為8小時是優(yōu)選的。優(yōu)選地進行干燥以便使干燥后產(chǎn)品的水分占1～20％wt，更優(yōu)選的為2-17％wt，特別是5-12％wt，更特別為7-10％wt。干燥可以使用任何合適的方法，例如真空干燥、噴霧干燥、流化床干燥、旋轉干燥、攪拌床干燥(agitatedbeddrying)、傳動皮帶(continuousbelt)干燥等。然而，對細胞產(chǎn)生最小的物理性應力的技術是優(yōu)選的，因此流化床干燥是特別優(yōu)選的。在干燥的過程中，可使用常規(guī)的干燥介質(如空氣和氮氣等)；而且優(yōu)選地使用氮氣、氧含量降低的空氣或者惰性氣體。干燥過程中的氣壓優(yōu)選地為環(huán)境大氣壓的10％以內。替代傳統(tǒng)的使用氣體使粒子層流化的流化床干燥機，本發(fā)明改以機械手段流化粒子層的方法，例如通過反向旋轉平行臂帶動螺旋槳或槳葉。上述機械流化床被用于例如聚合工業(yè)，以便將茂合金屬催化劑(metallocenecatalysts)加入到顆粒載體中(見Borealis的專利申請的實施例)。如果使用機械流化，優(yōu)選地，干燥機的氣壓低于環(huán)境的大氣壓。在發(fā)明方法中，所浸漬的顆粒優(yōu)選地為固體或膠體的形態(tài)，尤其是固體形態(tài)。顆粒的尺寸(即樣品顆粒的直徑)優(yōu)選地為0.05-5mm，更優(yōu)選地為0.5-3mm。因此，如果需要，在使用前對顆粒分級(即過篩)，以選擇合適尺寸的顆粒。顆粒尺寸的基本均勻導致了浸漬顆?；揪鶆蚋稍?，因此使無核細胞在干燥時受的壓力最小化。顆粒的浸漬可以使用任何合適的方法實現(xiàn)，例如將濃縮液噴霧或滴注到顆粒上、將顆粒浸入到濃縮液中，或者讓濃縮液的流幕(curtainoffalling)在顆粒上方通過(即移動濃縮液、顆?；蛘邇烧叨家苿?。優(yōu)選地，使用使無核細胞承受最小機械應力的技術，如液滴或使用流幕。如果需要，在浸漬過程中可以攪拌顆粒，如機械或氣流攪拌(例如攪拌床或流化床)。所用顆粒理想地是多孔的(例如超過10μm的孔徑或縫隙)和/或水溶脹性的。顆粒的浸漬可以選擇性地，但次于優(yōu)選地，通過混合濃縮物和保護物質的溶液并凝膠所形成混合物的滴液來達到，例如滴注或者噴霧混合物到一種體系中，在此體系中混合物能形成凝膠，例如所含試劑能和混合物的成分相互作用形成凝膠的溶液。因此，例如，混合物可含有藻酸鹽，并通過滴入或噴霧到鈣鹽溶液中形成凝膠小滴。在本發(fā)明可以替換的方面，顆粒的保護物質可用液體(通常是水溶液)、含細胞核的真核細胞(優(yōu)選地是哺乳動物，具體而言是人的細胞)的分散體或懸浮液來浸漬，然后進行干燥生產(chǎn)出可重構的生物制品。從另一方面看，本發(fā)明提供了一種干燥的、可重構的生物制品，包含存在于在大分子保護物質中的有細胞核的真核細胞。從另一方面看，本發(fā)明提供了一種制備干燥的、可重構的生物制品的方法，此方法包括用包含含有細胞核的真核細胞的溶液來浸漬顆粒狀的大分子保護物質，及干燥已浸漬的顆粒。尤其優(yōu)選地，可重構的生物制品(即可以再水化保持所需的生物活性的產(chǎn)品)是一種干燥的干細胞產(chǎn)品。在本發(fā)明方法中使用抗凝劑優(yōu)選地是一種可以抑制細胞聚集和/或作用于抑制纖維蛋白的形成的試劑。合適的抗凝劑的一個實例檸檬酸鹽。在采集血樣后加入抗凝劑來制備可輸血用的血液制品是一種常規(guī)做法。實施中使用的典型的抗凝劑包括CPD、CP2D、CPDA-1、AS-1、AS-3及AS-5。本發(fā)明方法中的細胞濃縮步驟可為任何合適的濃縮方法，例如過濾。而優(yōu)選使用離心。通常在采集供血者的血液后進行離心來制備在儲存前分離出來的血細胞的濃縮液和無細胞的血漿。離心，任選地幾個循環(huán)的離心，通常用于制備血液中不同類型的細胞濃縮物，例如紅細胞、血小板、粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、B細胞、T細胞和NK細胞，因為在某些外科手術中(例如器官移植手術)，不總是需要各種細胞保持在正常比例的細胞輸血液體。用于本發(fā)明方法中的含有細胞的濃縮液可包含血小板和/或紅細胞及任選地其他的血細胞和血蛋白等。但是優(yōu)選地，其含有的有核細胞相對無核細胞的豐富程度要低于血液。為達此目的細胞濃縮步驟可包括離心、分離、稀釋、離心等的幾次循環(huán)，以增加最終濃縮液中所需細胞類型的相對量。通常，具體而言在制備紅細胞制品時，需要在離心前減少白細胞和細胞因子的濃度，例如使用管線白細胞濾除裝置(in-lineleucocytereductionfilter)(購自BaxtorHealthcare)。細胞濃縮后，在進一步處理前，濃縮液冷凍(例如1-4℃)下保存高達35天。但是濃縮液的進一步處理優(yōu)選地是在最小的延遲時間內，優(yōu)選地不超過7天，更優(yōu)選地不超過24小時。為了使本發(fā)明的血液制品中的細胞活力最優(yōu)化，應盡可能減少在血液采集和產(chǎn)品干燥之間的時間延遲，處理步驟中任何階段的中間產(chǎn)品冷藏保存(例如1-4℃)。盡管本發(fā)明適用于具有血液循環(huán)系統(tǒng)的所用動物，尤其適用于哺乳動物的血液，具體而言是人的血液。在樣品的收集階段，優(yōu)選地從健康供血者采集血液，例如利用來自相關的衛(wèi)生當局的國際認可的推薦，或者在挪威，從挪威的衛(wèi)生部。典型地，對于人的血液，每個供血者的樣品體積在100到800ml的范圍內，更優(yōu)選地為200到600ml，例如400到500ml，尤其是440到480ml。優(yōu)選地，供血者的血液要進行感染的篩查，尤其是病毒傳染，具體而言是乙型肝炎、丙型肝炎和HIV。如果篩查結果顯示血液被感染了，樣品應不被采用，除非此干燥產(chǎn)品只用于供血者。通常不論如何所有被感染的樣品將不被采用。但是本發(fā)明的干燥產(chǎn)品比全血或血液成分的樣品對凈化技術的范圍更為易感，例如放射性照射、氣體暴露中等，因此，也許沒有必要丟棄發(fā)現(xiàn)有疾病標志的血液樣品。血液應在無菌的條件下并使用無菌設備進行血液采集、儲存和處理。采集樣品應該如上所述加入抗凝劑。典型地，對于450ml的血樣，應該收集到包含63ml的檸檬酸/磷酸鹽/葡萄糖溶液的無菌水溶液(例如CPD、CP2D或者CPDA-1)。如果樣品不能迅速的進一步處理，需要冷藏保存，例如在1-4℃。血液的采集例見2000年Mosby出版，Blaney等編寫的“BasicandAppliedConceptsofImmunohaematology”的第11章。然后將樣品進行細胞濃縮，例如使用常規(guī)的離心方法。然后將得到的細胞懸液立即進一步處理或者在進一步處理前冷藏保存(例如1-4℃)至多5周。如果需要，細胞濃縮的步驟可用來收集所有類型的血液細胞；然而，如需要，如果最終的產(chǎn)品需要包含特定的細胞而不是整個血細胞譜，僅需要收集特定類型的細胞，例如紅細胞、血小板、干細胞、粒性白細胞或淋巴細胞。如果需要也可以采集血漿，并進一步處理得到血蛋白(例如血漿蛋白，具體而言指γ-球蛋白、白蛋白和凝集因子)和細胞組織物質等。這些物質的收集和濃縮采用標準技術，例如親和色譜及其他已知的分離技術。具體而言，細胞濃縮的步驟是用于從無核細胞中分離有核細胞，然后用對有核細胞致命的技術進行濃縮液滅菌，例如放射性照射等。這可以對濃縮物進行或者對在制備、包裝和儲存的任何后續(xù)階段的產(chǎn)品進行。干燥的顆粒血液制品很方便地包裝于容器中然后密封。優(yōu)選地密閉容器中的氣體為無氧的氣體，例如氮氣或氦氣。密閉容器可在環(huán)境溫度下儲存，但理想地是冷凍或冷藏保存，例如-20℃至+10℃，優(yōu)選地為-10℃至+4℃。干燥的產(chǎn)品可通過與無菌含水溶液混合進行重構，優(yōu)選的是和干燥的產(chǎn)品混和后形成一種與血液在10％以內等滲的溶液，例如相當于0.8-1.0％的鹽溶液。具體而言，理想地，得到的重構溶液包含血漿中主要的金屬離子，即鈉、鈣、鉀及鎂。也希望重構溶液里包含葡萄糖、三磷酸腺苷和2，3-二磷酸甘油酯。為了優(yōu)化儲存和重構，本發(fā)明方法中浸漬的保護物質顆粒的平均尺寸(例如以D(v，0.5)表示)的優(yōu)選范圍為0.05到5mm，尤其是0.5到3mm。如果必要，保護物質可依大小區(qū)分，如篩分，以篩選具有所需顆粒尺寸的顆粒部分。用于制備干燥血液制品的保護物質在所用量的范圍內不能生理耐受，重構將涉及完全或部分去除保護物質。為此，產(chǎn)品可溶于重構溶液中，然后離心一次或更多次，回收細胞沉淀并進一步用重構溶液稀釋?？商鎿Q地，溶解產(chǎn)品可以過濾，殘留物，即細胞被回收并在必要時進一步用重構液稀釋。另一個可替換的步驟中，溶解的產(chǎn)物可使用允許保護物質通過的膜進行透析。因此從另一方面看，本發(fā)明提供了一種輸血液體的生產(chǎn)方法，所述方法包括，將根據(jù)本發(fā)明干燥的顆粒血液制品分散到生理耐受的無菌的水溶液中，并且如果必要，處理得到的分散體以減少其中的保護物質的含量。從另一方面看，本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括含有根據(jù)本發(fā)明的干燥血液制品的第一種容器，以及含有無菌的可生理耐受的重構溶液的第二種容器。當要求輸血液體中含有超過一種類型的血液組成時，例如紅細胞、血小板和血漿蛋白，可以聯(lián)合使用單獨分離生產(chǎn)的干燥的血液制品。可以在重構之前和之后進行聯(lián)合使用。當所用的保護物質不一定要除去時，或者除去時不會分離不同的血液產(chǎn)品時，在重構前混合是可行的。因此例如，當保護物質具有低的分子量，例如低于500D，可以使用離心或透析。為此可使用常規(guī)的血細胞的處理機(bloodcellprocessor)。本發(fā)明的方法尤其適用于這種聯(lián)用輸血液體的生產(chǎn)。因此原始血液樣品的離心可以以系列的階段進行，每一個相連的階段使用更高的離心力分離出分子量逐次降低的血液成分。例如要收集血漿蛋白，可以用能導致紅細胞破裂的離心力，因為此階段的樣品將不含有細胞。因此盡管本發(fā)明主要針對于干燥的、包含無核細胞的顆粒制品的生產(chǎn)，如上所述，本發(fā)明也可用于制備包含其他血液成份的干燥顆粒，尤其是細胞碎片和其它細胞成分。本發(fā)明也可以用于制備包含除了血細胞外的其他哺乳動物細胞的干燥顆粒成分，例如骨髓細胞、胎兒細胞及胚細胞(特別是干細胞)等等。尤其優(yōu)選地，產(chǎn)品包含間充質干細胞(MSC)，例如來源于成人骨髓，或來源于外周血的造血干細胞。MSC尤其有用，因為它們更少地受到受體的排斥。這些產(chǎn)品和其生產(chǎn)過程及用途也形成了本發(fā)明的幾個方面。使用本發(fā)明的方法有可能制備出干燥的含細胞的產(chǎn)品，其從體內采集后超過4個月甚至最多10年后仍然保持細胞活力。除了延長保存期以外，本發(fā)明的干燥制品的其他的優(yōu)勢是所需儲存空間小于全血。因此，能夠比全血更易大量儲存或輸送到血量需求增加的地區(qū)?，F(xiàn)在參考以下非限制性實施例進一步地說明。實施例1大分子保護物質地制備將冷凍的紅細胞濃縮液在液氮中進一步冷卻，溫熱至-25℃，然后搓碎(grate)。將所得到的顆粒過篩，使顆粒大小為0.5到2mm。顆粒在-30℃真空冷凍干燥得到干粉。這些粉末溫熱到20℃并保存。進一步，類似地，使用流化床在-20℃干燥來制備粉末；并且通過使用兩種干燥技術，此時省略了液氮處理。實施例2干燥的含有紅細胞的產(chǎn)品的制備在2℃，將紅細胞的濃縮液(是通過離心加過檸檬酸鹽的血液制備的)滴入到實施例1的粉末上。然后，將所得到的已浸漬的粉末在流化床干燥機上在4℃干燥超過6小時，至濕度為大約8％wt。實施例3干燥的含有紅細胞的產(chǎn)品的重構將100μl的磷酸鹽緩沖液加入到大約4μl干燥的包含紅細胞的產(chǎn)品中，產(chǎn)品如實施例2中描述并且所含顆粒的大小為0.01到5mm。將產(chǎn)品真空包裝并可以在采血后在周圍環(huán)境中儲存超過120天。在大約5分鐘后，光鏡下觀察(Reichert，Austria)，重構的懸液中可見包含細胞。實施例4不含血紅蛋白的保護物質的制備濃縮的紅細胞用注射水稀釋以使細胞裂解。如果需要可以使用雙極電場(例如，電壓梯度超過1000V/cm)進行細胞電泳。將稀釋混合物離心或超離心，并將血紅蛋白以下的大結構/大分子部分分離出來。將分離出的級分再次用注射水稀釋并離心。重復此過程直到分離出的部分不再含有血紅蛋白的紅色，或者具有強度大大減弱的顏色。然后，如實施例1所述，將分離出的部分冷凍固化、研磨成粉、過篩并干燥。得到的粉末然后可以用于實施例2和3。權利要求1.一種制備干燥的顆粒狀血液制品的方法，所述的顆粒含有置于保護物質中的無核血細胞。所述方法包括從哺乳動物對象獲取血樣；在所述樣品中加入抗凝劑；濃縮所述樣品中的細胞；從所述樣品中回收含有無核血細胞的濃縮液；用所述濃縮液浸漬包含大分子保護物質的顆粒；在-20至+120℃溫度范圍內干燥已浸漬的顆粒；及任選地，用密閉容器包裝干燥顆粒。2.權利要求1的方法，其中所述血樣來源于人對象。3.前述權利要求中任一項的方法，其中所述大分子保護物質包含分子量大于2000D的水溶性大分子物質。4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述大分子保護物質包含的大分子是天然存在于提供血液的物種的血液中。5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述大分子保護物質的血紅蛋白含量小于紅細胞中血紅蛋白的1％wt。6.前述權利要求中任一項的方法，其中干燥步驟在1℃和10℃之間的溫度下進行。7.前述權利要求中任一項的方法，其中干燥步驟涉及流化床干燥。8.一種干燥的顆粒狀血液制品，其中所述的顆粒含有置于大分子保護物質中的無核血細胞。9.一種干燥的可重構的生物制品，包含置于大分子保護物質中的有核的真核細胞。10.一種干燥的可重構的生物制品的制備方法，所述的方法包括用包含細胞核的真核細胞的液體浸漬顆粒狀的大分子保護物質并干燥已浸漬的顆粒。11.一種生產(chǎn)輸血液體的方法，所述的方法包括，將根據(jù)權利要求8或9的干燥的顆粒狀血液制品分散在生理耐受的無菌水溶液中，并任選地處理所得到的分散體以降低其中保護物質的含量。12.一種試劑盒，包括包含權利要求8或9的干燥的顆粒狀血液制品的第一種容器，以及包含無菌的生理耐受的可重構含水溶液的第二種容器。13.權利要求12的試劑盒，其中所述的第一種容器放置在第二種容器中，并且第一種容器是能開的，從而能將其內容物釋放到所述溶液中。全文摘要本發(fā)明提供了一種制備干燥的顆粒狀血液制品的方法，此顆粒含有置于保護物質中的無核血細胞，所述方法包括從哺乳動物對象獲取血樣；在所述樣品中加入抗凝劑；濃縮所述樣品中的細胞；從所述樣品中回收含有無核血細胞的濃縮液；用所述濃縮液浸漬含大分子保護物質的顆粒；在－20℃至+120℃溫度范圍內干燥已浸漬的顆粒，并且，任選地，用密閉容器包裝干燥顆粒。文檔編號A01N1/02GK1753617SQ200380109948公開日2006年3月29日申請日期2003年12月24日優(yōu)先權日2002年12月24日發(fā)明者奧迪利奧·阿爾維斯－菲爾霍,奧拉·伯格斯利恩,彼得·比約克,特里格維·M·艾克維克,英格沃爾德·斯特羅門申請人:新文特公司