專利名稱：一種猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術領域，是一種以孢子為外植體的猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方與快速繁殖的方法。
背景技術：
猴腿蹄蓋蕨(Athyrium multidentatum)別名猴腿兒，猴腿菜，紫莖菜，屬蕨類，蹄蓋蕨科，蹄蓋蕨屬低等植物。生于海拔300～400m的針闊混交林中較潮濕的林下、林緣及草地上。我國東北、華北等地廣有分布。拳狀嫩葉可食，5～6月間采集沒有展開的葉和幼莖，其營養(yǎng)成分十分豐富，且具有保健功能，產(chǎn)品可加工成鹽漬、干制品等，是深受人們喜愛的綠色保健食品，同時也是出口創(chuàng)匯的主要野生蔬菜之一。近年來由于過度采集，資源遭到破壞，產(chǎn)量銳減，因此，探索人工培養(yǎng)蕨苗的方法及快速繁育技術，以解決人工栽培中蕨苗供應困難的問題，無論對滿足人們需要及保護蕨菜資源和生態(tài)環(huán)境都具有重要意義。
人工繁殖一般采用無性繁殖的方法，即在早春或晚秋在野生蕨菜地挖取地下根莖，在春季或秋季進行移栽，不但繁殖系數(shù)低，運輸不便，且挖掘根莖既費工費時又對地表植被產(chǎn)生破壞，造成水土流失，使蕨菜資源和生態(tài)環(huán)境受到破壞，因此采用有性繁殖即孢子繁殖是擴大蕨類植物繁殖有效途徑，已引起人們的重視。
孢子直播具有取材方便，成苗量大，成本低等優(yōu)點，但是由于孢子萌發(fā)的溫、濕度與真菌孢子萌發(fā)的適宜條件類似，導致播種失敗。人工蕨菜孢子培養(yǎng)成苗目前只有少量報道，張金文等(1999)將孢子播種在森林土等基質上，得到孢子體幼苗，但仍存在孢子萌發(fā)成苗率低等諸多問題，不能適應大量用苗的需要。近年來，通過孢子組織培養(yǎng)繁殖蕨苗越來越受到重視，但目前關于蕨類植物組織培養(yǎng)的報道并不多，而且大部分集中在觀賞蕨類和瀕危種類上。趙彥芳等(2000)以幼嫩根狀莖險段為外植體，報道了山蕨菜組織培養(yǎng)的研究，但存在外植體材料質量的審定困難，移栽成活率低等問題，已在成活率僅在40％左右。華中農(nóng)大陳龍清等(2000)對莢果蕨孢子進行無菌培養(yǎng)，但需要時間較長，一般從孢子萌發(fā)到誘導出孢子體需要約1年的時間。而猴腿蹄蓋蕨的組織培養(yǎng)尚未見報道。采用組織培養(yǎng)的方法繁殖猴腿蹄蓋蕨，既不破壞資源，又利于其大量繁殖，為保護種質資源和大規(guī)模栽培利用提供了一條可行途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了猴腿蹄蓋蕨孢子組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方和快速繁殖方法，可在短時間內得到大量的組培苗。
本發(fā)明的技術關鍵是從調整培養(yǎng)基中鹽的含量及植物生長調節(jié)劑的種類和含量入手，經(jīng)2年多反復多次試驗，篩選出了用于猴腿蹄蓋蕨孢子組織培養(yǎng)的系列培養(yǎng)基配方(包括播種培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基)。使猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)獲得成功，可以得到大量組培苗。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基的大量元素為傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基用量的1/2，微量元素與MS培養(yǎng)基用量相同；植物生長調節(jié)劑有GA3(赤霉素)，6-BA(6-芐基氨基嘌呤)，NAA(奈乙酸)等，植物生長調節(jié)劑的含量如下GA35～30mg/L，6-BA0.5～2mg/L，NAA0.1～0.5mg/L。其他成分包括食用白糖，瓊脂，活性炭。
具體培養(yǎng)基配方如下a.播種培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1mg·L-1(單位下同)+NAA0.1+0～3g·L-1活性炭；b.原葉體增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；c.孢子體誘導培養(yǎng)基1/2MS+GA35～20+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；d.孢子體繼代培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～1+0～3g·L-1活性炭；e.生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～0.5。
以上培養(yǎng)基均附加3％白糖，0.65％瓊脂，PH5.5～5.8。
活性炭并非必須物質，但實驗證明播種在附加活性炭的1/2 MS培養(yǎng)基上的孢子比MS培養(yǎng)基提前3～4周萌發(fā)，在增殖和繼代培養(yǎng)基中添加活性炭，可使培養(yǎng)物生長更旺盛。利用本發(fā)明可以在6～8個月內，獲得具有完整根莖葉的猴腿蹄蓋蕨的組培苗，具有完整根莖葉的組培苗，移栽成活率可達到90％以上。
具體實施例方式
適宜培養(yǎng)溫度15～28℃，光照時間8～10h·d-1，光照度1500～2000lx。
1、無菌材料的獲得將成熟的孢子包在濾紙內，用70％酒精浸泡30s，無菌水沖洗3～5遍，再用0.1％升汞液消毒5～8min，無菌水沖洗3～5遍，備用。
2、孢子接種及原葉體生長將無菌的孢子分散于適量無菌水中，用滴管吸取孢子水溶液，將孢子溶液滴在a培養(yǎng)基上，每次吸孢子溶液時要先將溶液混合均勻，每瓶滴3～5滴。2～3周后，在培養(yǎng)基上可見綠色小點，表明孢子已經(jīng)萌發(fā)。三周左右可見心形原葉體。在加入活性炭的培養(yǎng)基中，孢子萌發(fā)及原葉體生長速度比不含碳的培養(yǎng)基上生長的快，且長勢好，顏色濃綠。
3、原葉體增殖與繼代培養(yǎng)孢子萌發(fā)后4～8周，可進行繼代培養(yǎng)。將原葉體移到b培養(yǎng)基上，即可得到大量的配子體，4～6周可增殖15～20倍。
4、孢子體誘導與增殖原葉體葉片長到3mm左右時，將其轉移到c培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3周左右可見有孢子體形成。為了得到更多的孢子體，可將其轉移到d培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)，每株孢子體均可大量增殖。未分化的原葉體可繼續(xù)在c培養(yǎng)基上培養(yǎng)，一段時間后仍可形成孢子體。在孢子體誘導過程中，要注意經(jīng)常向培養(yǎng)基中噴水，可以促進孢子體形成。
5、生根培養(yǎng)與移栽將分化出的孢子體轉移到e培養(yǎng)基上，3～4周左右即可見有根長出，生根率可達90％以上。待孢子體長到3cm左右，根長到2cm左右時，即可將其移到栽培基質中進行馴化。移栽時將試管苗根部培養(yǎng)基洗凈，移植到經(jīng)高溫消毒的松針土和細砂(1∶1)混合的基質上，覆上薄膜保濕，濕度保持在90％以上，放到蔭涼處，10天后可去掉薄膜，但仍要遮蔭保濕，不可放在強光下，移栽成活率可達90％左右。
本發(fā)明在中國科學院東北地里與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所組織培養(yǎng)室中進行組織培養(yǎng)，在溫室中進行組培苗的移栽和鍛煉。從孢子播種到誘導出孢子體約需6個月時間，此后，進入孢子體分化生長高峰期，每4～6周繼代培養(yǎng)一次，增殖率可達15～20倍，每個100ml三角瓶可分化出孢子體苗100～150株，經(jīng)過3～4周生根培養(yǎng)后，即可長出具有完整根莖葉的組培苗，年繁殖率可達1∶10000以上，具有較高的經(jīng)濟效益，有利于增加農(nóng)民收入，減輕農(nóng)民負擔，市場前景好。
另外，本發(fā)明的應用可有效地保護植被和野生資源，產(chǎn)生良好的生態(tài)效益。
權利要求
1.一種以孢子為外植體的猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)方法，其特征在于篩選出系列培養(yǎng)基配方，具體配方如下a.播種培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1mg·L-1(單位下同)+NAA0.1+0～3g·L-1活性炭；b.原葉體增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.5～1+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；c.孢子體誘導培養(yǎng)基1/2MS+GA35～20+NAA0.1～0.5+0～3g·L-1活性炭；d.孢子體繼代培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～1+0～3g·L-1活性炭；e.生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1～0.5；以上培養(yǎng)基均附加3％白糖，0.65％瓊脂；PH5.5～5.8。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，是一種以孢子為外植體的猴腿蹄蓋蕨組織培養(yǎng)與快速繁殖的方法。本發(fā)明包含猴腿蹄蓋蕨孢子組織培養(yǎng)的系列培養(yǎng)基(包括播種培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基)配方和植物生長調節(jié)劑的種類和含量，以及操作方法。本發(fā)明可在6～8個月內得到猴腿蹄蓋蕨的組培苗，生根率可達90％以上，組培苗移栽成活率在90％以上。是一種高效的猴腿蹄蓋蕨種苗生產(chǎn)技術，并可大規(guī)模生產(chǎn)，每個100ml三角瓶可生產(chǎn)100株左右的蕨苗。本發(fā)明的應用，可有效地保護野生資源，具有良好的生態(tài)效益。
文檔編號A01H4/00GK1720787SQ20041001100
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月23日 優(yōu)先權日2004年7月23日
發(fā)明者王新華, 趙恒田, 沈云霞 申請人:中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所