專利名稱：活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人工誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育是由遺傳失活的精子啟動發(fā)育程序，并采用物理或化學(xué)方法在體外使雌核染色體加倍成二倍體卵子，最終產(chǎn)生全雌性的子代。它屬于魚類細(xì)胞工程育種的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活體化學(xué)誘變育種的方法。
背景技術(shù)：
人工誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育技術(shù)包括精子遺傳失活和雌核二倍體的誘導(dǎo)。采用x射線、r射線或紫外線輻照處理可使魚類精子失活，一些化學(xué)劑如甲基胺藍(lán)(toluidineblue)、二甲基硫酸鹽(dimethylsufate)以及乙烯脲(ethylneurea)等也可以使精子遺傳失活。用遺傳失活的精子在體外激活卵子發(fā)育，然后再使用物理的或化學(xué)方法抑制卵子的第二次減數(shù)分裂或者抑制第一次有絲分裂，可以產(chǎn)生雌核二倍體。這些物理、化學(xué)方法包括低溫休克、熱休克、靜水壓力、秋水仙堿、細(xì)胞松馳素-B等。自從前蘇聯(lián)科學(xué)家(Neyfakh，1956，Golovinskaya and Romashov，1958；Romashov et al 1960)應(yīng)用r射線處理泥鰍和鯉魚精子，然后用遺傳失活精子激動泥鰍和鯉魚卵子，獲得了雌核發(fā)育二倍體泥鰍和鯉魚以來，已有幾十種魚人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育獲得成功的報道。但是用物理或化學(xué)的方法使染色體加倍的雌核發(fā)育魚達(dá)到性成熟年齡時的成活率很低(10-20％)，而且大約有80％的性腺不能正常發(fā)育。日本Y.Fujioka報道冷休克處理誘導(dǎo)一種頷須鯽魚類(Gnathopogon caerulescens)在魚苗孵化后130天雌核發(fā)育幼魚存活率大約為33％，其中有69％性腺發(fā)育良好，這是迄今見到的最好的結(jié)果。這主要是由于物理或化學(xué)的方法人工加倍時使染色體斷裂或小片段的丟失導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生。因此人工雌核發(fā)育技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能的減輕雌核二倍化的損傷，從而提高雌核發(fā)育魚的成活率與性腺正常發(fā)育的百分率。
幾十年來，國內(nèi)外關(guān)于人工誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的報道，均是致力于提高雌核二倍化的百分率，一般二倍體出現(xiàn)率在20％左右，個別的高達(dá)80％以上，但雌核發(fā)育魚的成活率與性腺發(fā)育成熟的百分率不高，其原因是復(fù)雜的，除了與各種魚的遺傳背景、卵子成熟度有關(guān)外，在體外采用物理或化學(xué)處理阻斷第二極體的排出，對受精卵子的染色體與細(xì)胞質(zhì)的損傷是十分劇烈的，甚至是致命的不可修復(fù)的損傷，盡管雌核二倍體出現(xiàn)率甚至可以高達(dá)100％，但能夠正常發(fā)育的雌核發(fā)育二倍體仍然不多。吳清江等(于1981年)用r射線照射過的精液激活鯉魚卵子發(fā)育至2細(xì)胞期時以25ppm的秋水仙堿溶液浸泡30分鐘，二倍體雌核發(fā)育可以從原來的1.35％提高到31.6％，至于雌核發(fā)育魚的成活率與性腺發(fā)育是否正常沒有進(jìn)一步觀察比較。吳清江采用的秋水仙堿濃度是本發(fā)明活體誘導(dǎo)使用的最低濃度的250倍，最高濃度的5倍，可以想像經(jīng)過25ppm秋水仙堿浸泡30分鐘對卵子染色體與細(xì)胞質(zhì)的損害是顯而易見的。綜上所述可以看出，在體外用各種物理或化學(xué)方法使卵子染色體加倍是有效的，但是雌核二倍體的成活率與性腺發(fā)育成熟的百分率仍然不夠理想，尚待進(jìn)一步研究解決。
為了進(jìn)一步檢證本技術(shù)方案的新穎性，發(fā)明人曾進(jìn)一步進(jìn)行了專利文獻(xiàn)檢索，其結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有類同的技術(shù)項目向中國專利局提出申請或予以公開。也沒有相近的技術(shù)設(shè)計方案和達(dá)到相同技術(shù)指標(biāo)的信息公布于眾，這些有助于對本發(fā)明設(shè)計思路的理解。

發(fā)明內(nèi)容
為了減少物理或化學(xué)處理對染色體的損傷，發(fā)明人提出一個活體內(nèi)化學(xué)藥物抑制第二次減數(shù)分裂，然后在體外再經(jīng)遺傳失活精子啟動二倍體卵子發(fā)育的技術(shù)方案。并在模型魚大鱗副泥鰍的實驗中，證明此項技術(shù)是可行的，有利于提高人工誘導(dǎo)的雌核發(fā)育魚達(dá)到性成熟年齡時的成活率與性腺正常發(fā)育成熟的百分率，這就是本發(fā)明所要解決的問題。為此，采用了以下的技術(shù)方案第一，——產(chǎn)卵親魚的選擇選擇生殖腺處于IV期中成熟期，絕大多數(shù)卵母細(xì)胞核已偏心，停留在減數(shù)分裂前期的腹部膨大、體表無損的健康雌魚，作為實驗魚。
——體內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)染色體加倍，對所選擇的產(chǎn)卵親魚注射催產(chǎn)劑，促使雌魚卵母細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期，在采卵前4～8小時，對實驗魚注射紡錘絲阻斷劑，誘導(dǎo)染色體加倍。
——精子遺傳物質(zhì)滅活，選擇性成熟的異種或同種體表無損，輕壓腹部可擠出少量精液的健康雄魚，采精前注射催產(chǎn)劑；取精液，用漢克(Hank)精子保存液稀釋；后將其置于培養(yǎng)皿中，在紫外滅菌燈下照射進(jìn)行輻射處理，并不停地對培養(yǎng)皿進(jìn)行搖動，精子遺傳物質(zhì)滅活時間是以精子遇水激活時大部分精子仍可緩慢游動為準(zhǔn)，即可停止輻射處理過程。
——雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)，將遺傳物質(zhì)滅活的精子與經(jīng)化學(xué)藥物體內(nèi)誘導(dǎo)染色體加倍成熟魚卵進(jìn)行干法授精，當(dāng)卵子授予滅活精子后，可誘發(fā)大部分卵子進(jìn)行雌核發(fā)育，并將受精卵置于培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，即可孵化出雌核發(fā)育的二倍體魚苗。
——進(jìn)行倍性鑒定。
第二，所注射的催產(chǎn)劑為絨毛膜促性腺激素(HCG)，或促黃體釋放激素(LRH-A)，或鯉魚腦垂體勻漿，當(dāng)雌魚卵細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期，在采卵前4～8小時對實驗雌魚所注射紡綞絲阻斷劑為秋水仙堿或細(xì)胞松馳素-B，秋水仙堿劑量為0.1～5μg/g(體重)。催產(chǎn)誘導(dǎo)在22～26℃水溫的水箱中進(jìn)行。
第三，對雄魚注射催產(chǎn)劑后取出0.5～1.0ml的精液，按1∶4的比例與漢克(Hank)精子保存液稀釋，儲存在直徑為80毫米的培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿置入30瓦紫外滅菌燈下照射1小時左右，兩者之距離為17厘米，照射過程中不停地?fù)u動培養(yǎng)皿。
第四，取經(jīng)化學(xué)紡錘絲阻斷劑誘導(dǎo)染色體加倍的成熟魚卵與遺傳物質(zhì)經(jīng)紫外線滅活的精子授精，受精卵置于24～26℃培養(yǎng)箱中孵育60小時左右。
第五，根據(jù)不同的發(fā)育階段采用以下的倍性鑒定方法胚胎時期用單個胚胎或混合胚胎染色體滴片法；魚苗用尾鰭細(xì)胞滴片法；成魚用紅細(xì)胞核體積測量法或細(xì)胞核DNA含量細(xì)胞分光光度儀測量法。
對照現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明具有以下的有益效果(1)首次采用了體內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)方法抑制卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂，使染色體不減數(shù)而加倍，并在體外用滅活精子誘發(fā)卵子雌核發(fā)育成為雌核二倍體魚苗。
(2)在催產(chǎn)劑的作用下，IV期中成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行第一次、第二次減數(shù)分裂并停留在第二次減數(shù)分裂中期的進(jìn)程基本上是同步進(jìn)行的。因此，體內(nèi)注射適當(dāng)劑量的紡錘絲抑制劑比體外用量低得多，對染色體或魚卵的損害較輕，可提高雌核二倍體誘導(dǎo)率。
(3)采用滅活精子直接激發(fā)染色體已加倍的卵子雌核發(fā)育，不需授精后施用物理或化學(xué)方法人工誘導(dǎo)染色體加倍，降低對染色體與卵質(zhì)的損害，提高了雌核二倍體的存活率與性腺正常發(fā)育的百分率。
(4)本發(fā)明適用于兩性生殖的卵生魚類的人工雌核發(fā)育，在魚類自交系的創(chuàng)建、單性魚的研制、性別決定機(jī)制和染色體基因作圖等技術(shù)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
(5)以大鱗副泥鰍作為模型魚的實施例，采用本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行試驗，取得較理想的結(jié)果，雌核發(fā)育魚達(dá)到性成熟年齡的存活率由10～30％提高到50％左右，而且性腺正常發(fā)育成熟的百分率由20-60％提高到90％以上，這些均超過了現(xiàn)已公開的技術(shù)指標(biāo)。


為了進(jìn)一步的了解本發(fā)明技術(shù)方案，根據(jù)上述內(nèi)容繪制出活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法工藝流程圖。現(xiàn)對該圖補(bǔ)充說明如下1、產(chǎn)卵親魚選擇，選擇性成熟腹部膨大、體表無損的健康雌魚，其生殖腺處于IV期中成熟期，即絕大多數(shù)卵母細(xì)胞核已經(jīng)偏心(可用透明液檢出)，停留在減數(shù)分裂的前期。
2、體內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)染色體加倍，按常規(guī)方法先對實驗魚注射催產(chǎn)劑(如絨毛膜促性腺激素等)，促使雌魚卵母細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期，并按每種魚的催產(chǎn)效應(yīng)時間測算，在采卵前4～8小時，再注射紡錘絲阻斷劑(如秋水仙堿等)誘導(dǎo)染色體加倍，秋水仙堿劑量為0.1～5μg/g(體重)，實驗應(yīng)在22～26℃水溫的水箱中進(jìn)行催產(chǎn)與誘導(dǎo)。
3、精子遺傳物質(zhì)滅活，選擇性成熟的異種或同種體表無損、輕壓腹部可擠出少量精液的健康雄魚，亦按常規(guī)方法注射催產(chǎn)劑(方法同上)，然后取精液0.5～1.0ml，用漢克(Hank)精子保存液稀釋，精液與稀釋液的比例為1∶4，稀釋后的精液置于直徑80mm培養(yǎng)皿中，在30W紫外滅菌燈下照射1小時左右，兩者之距為17cm，照射過程中應(yīng)不停地?fù)u動，精子遺傳物質(zhì)滅活的輻射時間以精子遇水激活時大部分精子仍可緩慢游動為宜，此時即可停止輻射處理。
4、雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)，取經(jīng)化學(xué)藥物體內(nèi)誘導(dǎo)染色體加倍的成熟魚卵與遺傳物質(zhì)滅活的精子進(jìn)行干法授精，當(dāng)卵子授予滅活精子后，可誘發(fā)大部分卵子進(jìn)行雌核發(fā)育，并孵化出雌核發(fā)育的二倍體魚苗；此時，受精卵應(yīng)置于24～26℃培養(yǎng)箱中孵育60小時左右。
5、倍性鑒定，按常規(guī)方法進(jìn)行二倍體鑒定。胚胎時期用單個胚胎或混合胚胎染色體滴片法；魚苗用尾鰭細(xì)胞滴片法；成魚用紅細(xì)胞核體積測量法或細(xì)胞核DNA含量細(xì)胞分光光度儀測量法等。
具體實施例方式
實驗對象是大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus sauvage)是鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitfidae)、花鰍亞科(Cobitinae)的一種小型食用魚類。一周年達(dá)到性成熟，每年4～6月份水溫在18℃以上時為其產(chǎn)卵季節(jié)。雌雄魚性別可以依據(jù)胸鰭的外形加以區(qū)別，雌魚鰭圓鈍，雄魚尖細(xì)，并均以性腺第IV成熟期越冬。由于其體型小，便于室內(nèi)飼養(yǎng)與操作管理，而且只要有適宜的水溫與營養(yǎng)條件，每年11月至翌年6月均可人工催情產(chǎn)卵。因此，它也是一種常用的模型魚，可供生理、毒理、轉(zhuǎn)基因遺傳育種各種試驗之用。發(fā)明人直接從水產(chǎn)市場選購2齡以上野生的大鱗副泥鰍，作為實驗對象，按照本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行活體化學(xué)誘導(dǎo)雌核發(fā)育的試驗，具體方式如下；(1)產(chǎn)卵親魚選擇選擇生殖腺處于IV期中成熟期，絕大多數(shù)卵母細(xì)胞核已偏心，停留在減數(shù)分裂前期的腹部膨大、體表無損的、體重在20～30g之間，二齡以上的健康雌魚4尾。
(2)體內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)染色體加倍在開始采卵前10小時，按常規(guī)方法對每條雌魚注射絨毛膜促性腺激素(HCG)100IU，并在采卵前4小時，對其中兩尾雌魚注射紡綞絲阻斷劑秋水仙堿0.5～2.5μg/g(體重)，另兩尾作為對照，實驗魚在22℃±1℃塑料水箱中進(jìn)行催產(chǎn)與誘導(dǎo)。
(3)精子遺傳物質(zhì)滅活選擇性成熟的同種體表無損、輕壓腹部可擠出少量精液的健康雄魚4尾，體重在20g左右。按常規(guī)方法于開始實驗采卵前6小時注射絨毛膜促性腺激素(HCG)50IU，6小時后剖腹取出精巢，將其用眼科剪剪碎，尼龍紗絹過濾、棄去殘渣，合并4尾魚精液。然后取精液2ml，用8ml漢克(Hank)精子保存液稀釋，稀釋后的精液置于直徑為80mm培養(yǎng)皿中，在30W紫外滅菌燈(入＝200-320nm)下照射1小時左右，燈管與培養(yǎng)皿的距離為17cm(520uJmm-2)。照射過程應(yīng)不停搖動，并隨時取微量精液在雙筒解剖鏡下檢查。當(dāng)精子遇水激活，80％以上仍可緩慢游動時，即可停止輻射處理，滅活后精子應(yīng)用濕毛巾復(fù)蓋避光。未經(jīng)紫外線處理的精液留作正常對照之用。
(4)雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)取經(jīng)秋水仙堿活體誘導(dǎo)染色體加倍的成熟魚卵與遺傳物質(zhì)滅活的精子進(jìn)行干法授精，滅活精子可誘發(fā)大部份卵子正常分裂、發(fā)育并孵化出雌核二倍魚苗，此時，受精卵應(yīng)在24-26℃培養(yǎng)箱中孵育60小時左右。在原腸期用混合胚胎滴片法檢查染色體倍性，統(tǒng)計受精率、孵化率和成活率，并在性成熟前先從胸鰭外形特征鑒別雌雄，然后隨機(jī)取樣30尾剖腹檢查性腺發(fā)育程度。
(5)活體誘導(dǎo)大鱗副泥鰍雌核發(fā)育的實驗結(jié)果如下表所示

注a正常精子與正常卵子授精，比照卵子成熟度。
b滅活精子與正常單倍體卵子授精。
c發(fā)育至原腸中期統(tǒng)計數(shù)字。
d孵化魚苗與授精卵之比。
e檢查原腸中期混合胚胎滴片200個分裂相的二倍染色體百分率。
f達(dá)到性成熟前的百分率。
g只隨機(jī)選留500尾養(yǎng)至性成熟前的成活率。
從上述試驗數(shù)據(jù)可知使用該方法誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的魚達(dá)到性成熟年齡時的成活率與性腺發(fā)育成熟率分別為61.9％和100％，與方案設(shè)計指標(biāo)相符合。
權(quán)利要求
1.一種活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法，包括化學(xué)誘導(dǎo)育種，其特征按以下工序進(jìn)行(1)產(chǎn)卵親魚選擇，選擇生殖腺處于IV期中成熟期，絕大多數(shù)卵母細(xì)胞核已偏心，停留在減數(shù)分裂前期的腹部膨大，體表無損的健康雌魚，作為實驗魚；(2)體內(nèi)化學(xué)誘導(dǎo)染色體加倍，對所選擇的產(chǎn)卵親魚注射催產(chǎn)劑，當(dāng)雌魚卵母細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期，在采卵前4～8小時，對該魚注射紡錘絲阻斷劑，誘導(dǎo)染色體加倍；(3)精子遺傳物質(zhì)滅活，選擇性成熟的異種或同種體表無損，輕壓腹部可擠出少量精液的健康雄魚，采精前注射催產(chǎn)劑；取精液，用漢克(Hank)精子保存液稀釋；后將其置于培養(yǎng)皿中，在紫外滅菌燈下照射進(jìn)行輻射處理，并不停地對培養(yǎng)皿進(jìn)行搖動，精子遺傳物質(zhì)滅活時間是以精子遇水激活時大部分仍可緩慢游動為準(zhǔn)，即可停止輻射處理過程；(4)雌核發(fā)育人工誘導(dǎo)，將遺傳物質(zhì)滅活的精子與經(jīng)化學(xué)藥物誘導(dǎo)染色體加倍成熟魚卵進(jìn)行干法授精，當(dāng)卵子授予滅活精子后，將受精卵置于培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，即可孵化出雌核發(fā)育的二倍體魚苗；(5)倍性鑒定。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法，其特征是所注射的催產(chǎn)劑為絨毛膜促性腺激素(HCG)，或促黃體釋放激素(LRH-A)，或鯉魚腦垂體勻漿；當(dāng)雌魚卵細(xì)胞經(jīng)過第一次減數(shù)分裂進(jìn)入第二次減數(shù)分裂中期，再按每種魚的催產(chǎn)效應(yīng)時間測算，在采卵前4～8小時對實驗雌魚所注射紡錘絲阻斷劑為秋水仙堿或細(xì)胞松弛素-B，秋水仙堿劑量為0.1～5μg/g(體重)；催產(chǎn)誘導(dǎo)在22～26℃水溫的水箱中進(jìn)行。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法，其特征是對雄魚注射催產(chǎn)劑后取出0.5～1.0ml的精液，按1∶4的比例與漢克(Hank)精子保存液稀釋，儲存在直徑為80毫米的培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿置于30瓦紫外滅菌燈下照射1小時左右，兩者之距離為17厘米，照射過程中不停地?fù)u動培養(yǎng)皿。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法，其特征是取經(jīng)化學(xué)紡錘絲阻斷劑誘導(dǎo)染色體加倍的成熟魚卵與遺傳物質(zhì)經(jīng)紫外線滅活的精子授精，受精卵置于24～26℃培養(yǎng)箱中孵育60小時左右。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法，其特征是根據(jù)不同的發(fā)育階段倍性鑒定采用以下方法胚胎時期用單個胚胎或混合胚胎染色體滴片法；魚苗用尾鰭細(xì)胞滴片法；成魚用紅細(xì)胞核體積測量法或細(xì)胞核DNA含量細(xì)胞分光光度儀測量法進(jìn)行染色體倍性鑒定。
全文摘要
活體化學(xué)誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育方法屬于魚類細(xì)胞工程育種技術(shù)范疇，具體涉及到活體化學(xué)誘導(dǎo)育種的方法。它可以減少理化處理對染色體的損傷和提高人工誘導(dǎo)的雌核發(fā)育魚達(dá)到性成熟年齡時的成活率與性腺正常發(fā)育成熟的百分率。其要點(diǎn)是選擇IV期中成熟期、卵母細(xì)胞核已偏心的腹部膨大、體表無損的健康雌魚，對其依次注射催產(chǎn)劑和紡錘絲阻斷劑，誘導(dǎo)染色體加倍；選擇異種或同種體表無損、輕壓腹部可擠出少量精液的健康雄魚，對其注射催產(chǎn)劑，取精液與保存液稀釋并加輻射處理，使之滅活；再將其與經(jīng)誘導(dǎo)染色體已經(jīng)加倍的魚卵進(jìn)行干法授精，即可誘發(fā)雌核發(fā)育和孵化出雌核發(fā)育的二倍體魚苗；再進(jìn)行倍性鑒定。本發(fā)明適用于兩性生殖的卵生魚類的人工雌核發(fā)育。
文檔編號A01K67/027GK1559201SQ20041001273
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月19日
發(fā)明者陳宏溪, 崔書勤, 徐江, 劉漢勤 申請人:武漢康祥科技發(fā)展有限公司