專利名稱：白桂木的離體繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的離體繁殖方法，具體是涉及白桂木的離體繁殖方法。
背景技術(shù)：
1994年，我國先后公布了《中國生物多樣性行動計(jì)劃》和《中國21世紀(jì)議程》，其中指出“中國動植物種類中已有15％-20％受到威脅，高于世界10％-15％的水平”。我國的植物資源十分豐富，約有3萬多種，以此推算我國約有4500-6000種植物處于瀕?；蚴艿酵{。據(jù)報(bào)道，其中一些種群僅存一株或幾株。我國從80年代起開始建立“全國珍稀瀕危植物種質(zhì)基因資源庫及數(shù)據(jù)庫”，91年公布了《中國植物紅皮書》(第一冊)。對瀕危珍稀植物保護(hù)與保存主要有遷地保存(植物園)、就地保存(自然保護(hù)區(qū))和離體保存等幾種，其中，離體保存中的組織培養(yǎng)(in vitro culture)方法是近年發(fā)展起來的保護(hù)方法之一，特別對熱帶地區(qū)植物種質(zhì)保存具有重要意義，是物種保存的重要手段之一。如國際遺傳委員會(IBPGR)在英國皇家植物園已開始了對東南亞重要材樹種龍腦香科植物的離體保存研究，該園還利用微繁殖對蘭類(orchids)及蕨類(ferns)植物開展了離體保存實(shí)踐。
白桂木，又名糖桂木、狗囊。學(xué)名Artocarpus hypargyreus Hance，?？?Moraceae)，桂木屬(Artocarpus)常綠喬木，高可達(dá)十余米。葉革質(zhì)，互生，橢圓形或倒卵狀長圓形，長7-22cm，寬3-8.5cm，頂端漸尖或短漸尖，基部楔形，全緣，但嫩葉常為羽狀淺裂，腹面無毛而有光澤，背面密被灰白色短絨毛，側(cè)脈7-9對和網(wǎng)脈均在背面凸起；葉柄長1-2.2cm，有短毛?；ㄐ騿蝹€腋生，雌雄同株雄花序倒卵形或棒狀，長1.5-2cm，橙黃色，外被褐色短柔毛。雌花序園頭狀。聚花果近球形，直徑3-4cm，黃色，干時褐色，有短毛，表面有不明顯宿存的乳狀凸起，萼片近軸部分分離，結(jié)果時約12片；果柄長3.5-6.5cm，有短毛?；ㄆ谙募荆还?-7月。主要分布于廣東、香港、海南、廣西、云南、湖南、江西、福建等省區(qū)。白桂木為喜光、喜濕樹種，散生于我國南方各省受帶季風(fēng)影響的低海拔至中海拔丘陵或山谷疏林中。
果味酸甜可食或用于調(diào)味的配料或糖漬，種子民間作為果仁食用；木材堅(jiān)硬，紋理通直，可供建筑家具等用材。(《廣東植物志》，1987年版，第一卷)。
?？浦参锓N子為頑拗型種子，通常認(rèn)為該類種子與正常種子比，含水量高，不能進(jìn)行干燥處理，在日常濕、溫條件下干燥也會很快喪失生命力，其種子含水量低于一定的含水量(安全臨界含水量)時，種子將失去發(fā)芽力，這種種子需要在潮濕的環(huán)境保存。我們的實(shí)驗(yàn)表明，白桂木的種子發(fā)芽率低，經(jīng)日曬干燥后基本不發(fā)芽，這與頑拗型種子的特性是相符的。白桂木為喜光、喜濕樹種，在幼苗階段還需一定的蔭蔽條件。根據(jù)對生長于東莞市白桂木孤立木(本實(shí)驗(yàn)采種母株，該樹為村邊風(fēng)水樹)和對散生于次生林中的或在風(fēng)水林中的白桂木(成株)的考察，孤立木四周不見有白桂木小苗，而次生林中的成年白桂木周邊則有少量的不同年齡的白桂木分布。白桂木的這一種分布特點(diǎn)與其生理特性是一致的。據(jù)調(diào)查，多年來當(dāng)?shù)厝罕妼Τ赡甑陌坠鹉静煞N后進(jìn)行多種方法的播種嘗試，都沒有獲得成活的植株。白桂木種子苗分化嚴(yán)重，在自然條件下播種，種子極易被動物吃掉，這可能與白桂木種子苗中含有豐富的營養(yǎng)成分有關(guān)。如此種種，無疑大大減少了白桂木種群的自然繁殖率，使其生存受到威脅。
此外，白桂木主要生長于低海拔至中海拔地區(qū)，而人們又有將其用于藥用、食用的習(xí)慣，因此，白桂木受人為干擾較大，這又加速了白桂木的瀕危。
近年來的研究結(jié)果認(rèn)為稀有、瀕危和滅絕的生物就是它們在進(jìn)化過程中存在某種脆弱的環(huán)節(jié)，如主要是繁殖系統(tǒng)的缺陷或基因漂變和某些物種的生物-生態(tài)學(xué)特性的特化而依賴于單一或特殊的環(huán)境、生境。這樣，近代急劇變化的環(huán)境和特殊生境的消失，使它們來不及產(chǎn)生新的變異去適應(yīng)。
白桂木的離體繁殖方法在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種白桂木的離體繁殖方法，對受威脅的瀕危植物白桂木進(jìn)行離體組培快繁殖技術(shù)的研究，以搶救該物種，使其種群得以繁衍擴(kuò)大，無論是對生態(tài)環(huán)境的保護(hù)還是對白桂木的進(jìn)一步開發(fā)利用均具有重大的生態(tài)、社會、經(jīng)濟(jì)效益。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了以下的技術(shù)方案白桂木的離體繁殖方法，依次由以下步驟組成(1)、無菌外植體的獲得；以完整植株的莖尖、莖段、葉片為外植體；將莖尖、莖段用自來水沖洗干凈后，用70％酒精處理20min，無菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～10min，無菌水洗3～5次，莖尖切成長約1.5cm切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；葉片用自來水沖洗干凈后，用70％酒精處理30s，無菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～8min，無菌水洗3～5次。葉片切成1cm×2cm的切塊接種到誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基中；接種時間為35天；(2)、芽的誘導(dǎo)；用培養(yǎng)基對(1)步驟中獲得的無菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生叢芽，培養(yǎng)基為改良的MS；(3)、芽的增殖；將莖誘導(dǎo)出的直徑約0.1～0.2cm，高約0.3～0.5cm的再生芽切下，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，莖尖開始時基部膨大，顏色開始轉(zhuǎn)為淡黃色，并長出淡黃色到淡綠色的小芽，這些小芽培養(yǎng)約20～25天長出綠色葉片，長成直徑約0.1～0.3cm，高為0.5～1.5cm的從芽；(4)、根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)；將生長于繼代培養(yǎng)基中的高0.5～1.0cm、帶1～2片葉的從芽切成單芽接種到含MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30～50天，誘導(dǎo)出生根苗；
(5)、試管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培養(yǎng)室外或即將移栽的蔭棚內(nèi)練苗約10～15天，洗凈試管苗附著的培養(yǎng)基，種植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基質(zhì)或河沙中，苗床遮蔭70～80％，保持空氣濕度50～80％以上，溫度保持在22～35℃，移栽后每3天噴施1/2MS營養(yǎng)液，每7～10天噴施800～1000倍的百菌清等殺菌劑，移栽后約一個月植株長出新根；待苗長出3-4片葉片，高約5cm即可移植到營養(yǎng)杯中，基質(zhì)采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1；杯苗置遮蔭40～60％的室外，并逐漸移去遮蔭網(wǎng)，新根長出，苗高約≥25cm，即可定植；所述的外植體為母株種子苗優(yōu)株的莖尖、莖段、葉片。
所述的外植體也可以采用無菌播種所得的實(shí)生苗的莖尖、莖段、葉片。
上述無菌播種的方法如下種子采后馬上用自來水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理10～15秒，無菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無菌水沖洗五次后接種到MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時間為30天，30天后長出具有根、莖、葉的完整植株。
同已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明對受威脅的瀕危植物白桂木進(jìn)行離體組培快繁殖技術(shù)的研究，以搶救該物種，使其種群得以繁衍擴(kuò)大；并利用離體組培的方法大量提供了珍稀植物白桂木的優(yōu)良組培苗，對保存和保護(hù)瀕危植物白桂木并對其加以開發(fā)利用具有重要的生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)效益。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明附圖1為本發(fā)明的主要技術(shù)路線示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1白桂木的離體繁殖方法，依次由以下步驟組成(1)、無菌外植體的獲得；以母株種子苗優(yōu)株的莖尖、莖段、葉片為外植體；將莖尖、莖段用自來水沖洗干凈后，用70％酒精處理20min，無菌水沖洗5次，0.1％升汞處理10min，無菌水洗4次，莖尖切成長1.5cm切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。母株莖的成功率3％，一年生的莖成功率在5％。材料接種的7天內(nèi)，有的切口有淡褐色的物質(zhì)分泌出來并有水浸狀，這樣的材料慢慢會死去，有的則轉(zhuǎn)為綠色，切口處膨大，但無愈傷組織，在接種約25天后開出小芽。葉片用自來水沖洗干凈后，用70％酒精處理30s，無菌水沖洗4次，0.1％升汞處理8min，無菌水洗4次。葉片切成1cm×2cm的切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；接種時間為35天，成功率在30％。從葉誘導(dǎo)的芽的生長與莖的相似，但小芽從葉柄和葉片的切口長出。
(2)、芽的誘導(dǎo)；用培養(yǎng)基對(1)步驟中獲得的無菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生叢芽，培養(yǎng)基為改良的MS；(3)、芽的增殖；
將莖誘導(dǎo)出的直徑0.15cm，高0.4cm的再生芽切下，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，莖尖開始時基部膨大，顏色開始轉(zhuǎn)為淡黃色，并長出淡黃色到淡綠色的小芽，這些小芽培養(yǎng)25天長出綠色葉片，長成直徑0.2cm，高為1.0cm的從芽；(4)、根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)；將生長于繼代培養(yǎng)基中的高0.8cm、帶2片葉的從芽切成單芽接種到含基本培養(yǎng)基為1/2MS，含不同的濃度的NAA、IBA、IAA、或活性炭的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果如下(表1)。實(shí)驗(yàn)均誘導(dǎo)出生根苗，但生根率有較大的差別，其中接種在NAA為0.05和加入活性炭組為最好，30天后植株基部長出粗壯新根，植株長高，根長為0.5-2cm，生根率分別為90、92％(表2)。但NAA過高則抑制了根的生長。我們在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，接種在NAA為0.5或活性炭培養(yǎng)基中進(jìn)生根的單芽若高≥0.5cm都能生根，且平均生根率都可達(dá)90％，較小的苗在生根階段仍繼續(xù)生長，但其出瓶的苗若根數(shù)≥1條，高約≥1.5cm，則成活率高達(dá)85.6％，但若單芽太小〔高約＜1.0cm＝，即使已生根，移栽的成活率則只有57.4％(表3)。因此，如果進(jìn)入根的芽較高(≥0.8cm)，則生根階段約30天即可出瓶，若接種的芽較小(高約0.5cm)，則生根階段要60天，待苗高≥1.5cm才可出瓶。根據(jù)白桂木的這一生根特點(diǎn)來進(jìn)行生產(chǎn)的安排。
表1生根實(shí)驗(yàn)培育基表

說明基本培養(yǎng)基為1/2MB，生長調(diào)節(jié)劑及活性炭用量單位為mg/L。
表2白桂木根的誘導(dǎo)生根率統(tǒng)計(jì)表

(5)、試管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培養(yǎng)室外或即將移栽的蔭棚內(nèi)練苗約14天，洗凈試管苗附著的培養(yǎng)基，種植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基質(zhì)或河沙中，苗床遮蔭75％，保持空氣濕度80％，溫度保持在32℃，移栽后每3天噴施1/2MS營養(yǎng)液，每8天噴施900倍的百菌清等殺菌劑。移栽后約一個月植株長出新根，移栽成活率為77.7-95.1％，平均為85.6％(表3)，從我們2003年3月7日出瓶的成活率來看，以6月的成活率最高，且苗高≥1.5cm的成活率顯著大于苗高＜1.5cm的瓶苗。待苗長出4片葉片，高5cm即可移植到營養(yǎng)杯中，基質(zhì)采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1。杯苗置遮蔭60％的室外，并逐漸移去遮蔭網(wǎng)，新根長出，苗高≥25cm，即可定植。至2003年8月，我們已出瓶苗3000多株，其中室外篩苗1608株，可供定植的500多株。
表3白桂木成苗率統(tǒng)計(jì)表

實(shí)施例2方法與實(shí)施例1相同，但其步驟(1)中的外植體是采用無菌播種所得的實(shí)生苗的莖尖、莖段、葉片。這種方法較之實(shí)施例1而言速度較快。
上述無菌播種的方法如下種子采后馬上用自來水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理10～15秒，無菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無菌水沖洗五次后接種到MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時間為30天，30天后長出具有根、莖、葉的完整植株。
2002年8月采集種子26粒，種子采后馬上用自來水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理12秒，無菌水沖洗4次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無菌水沖洗五次后接種到1/2MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時間為30天，30天后有23粒種子出芽，并長出具有根、莖、葉的完整植株。
結(jié)論關(guān)于離體培養(yǎng)1、白桂木的莖、種子的表面平滑，在實(shí)驗(yàn)中用一般的消毒方法，無論用上述的哪一種材料均較易得到無菌外植體，但從保持母本的遺傳性狀來考慮，應(yīng)以優(yōu)良母株的莖來誘導(dǎo)芽。
2、在芽的誘導(dǎo)中，用常用的MS培養(yǎng)基，曾試用與6-BA、KT、NAA、IBA、ADE、ZT等生長調(diào)節(jié)劑搭配及其多種梯度的組合實(shí)驗(yàn)，材料有的不萌動、有的變褐，均無法誘導(dǎo)出芽，后來我們用改良的MS(及上述的MB)培養(yǎng)基，則誘導(dǎo)出大量的從芽，推測白桂木的從芽的生長需要特定的營養(yǎng)。
3、實(shí)驗(yàn)表明，在生根培養(yǎng)基中，小芽(高約0.5cm、直徑約0.1cm)與大芽(高約1.5cm、直徑約0.3cm)生根率并無多大的差別，均可達(dá)90％以上。但對于較大(高大于1.5cm)生根苗，即使只有一條根，仍可成活，而對于較小的瓶苗(高約0.5cm、直徑約0.1cm)，即使有3-4條根，最后仍干枯而死。這表明白桂木的小苗生長要有充分的養(yǎng)分積累。
權(quán)利要求
1.白桂木的離體繁殖方法，其特征在于該方法依次由以下步驟組成(1)、無菌外植體的獲得；以完整植株的莖尖、莖段、葉片為外植體；將莖尖、莖段用自來水沖洗干凈后，用70％酒精處理20min，無菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～10min，無菌水洗3～5次，莖尖切成長1.5cm切塊接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；葉片用自來水沖洗干凈后，用70％酒精處理30s，無菌水沖洗3～5次，0.1％升汞處理5～8min，無菌水洗3～5次。葉片切成1cm×2cm的切塊接種到誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基中；接種時間為35天；(2)、芽的誘導(dǎo)；用培養(yǎng)基對(2)步驟中獲得的無菌外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生叢芽，培養(yǎng)基為改良的MS；(3)、芽的增殖；將莖誘導(dǎo)出的直徑0.1～0.2cm，高0.3～0.5cm的再生芽切下，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，莖尖開始時基部膨大，顏色開始轉(zhuǎn)為淡黃色，并長出淡黃色到淡綠色的小芽，這些小芽培養(yǎng)20～25天長出綠色葉片，長成直徑0.1～0.3cm，高為0.5～1.5cm的從芽；(4)、根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)；將生長于繼代培養(yǎng)基中的高0.5～1.0cm、帶1～2片葉的從芽切成單芽接種到含MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30～50天，誘導(dǎo)出生根苗；(5)、試管苗的移栽；把苗高≥1.5cm的生根苗置于培養(yǎng)室外或即將移栽的蔭棚內(nèi)練苗10～15天，洗凈試管苗附著的培養(yǎng)基，種植到河沙∶泥炭土＝1∶8的基質(zhì)，或河沙中，苗床遮蔭70～80％，保持空氣濕度50～80％以上，溫度保持在22～35℃，移栽后每3天噴施1/2MS營養(yǎng)液，每7～10天噴施800～1000倍的百菌清等殺菌劑，移栽后一個月植株長出新根；待苗長出3-4片葉片，高5cm即可移植到營養(yǎng)杯中，基質(zhì)采用塘泥∶泥炭土∶粗沙＝3∶6∶1；杯苗置遮蔭40～60％的室外，并逐漸移去遮蔭網(wǎng)，新根長出，苗高≥25cm，即可定植；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白桂木的離體繁殖方法，其特征在于所述的外植體為母株種子苗優(yōu)株的莖尖、莖段、葉片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白桂木的離體繁殖方法，其特征在于所述的外植體采用無菌播種所得的實(shí)生苗的莖尖、莖段、葉片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的白桂木的離體繁殖方法，其特征在于上述無菌播種的方法如下種子采后馬上用自來水沖洗，晾干，第二天用70％酒精處理10～15秒，無菌水沖洗3～5次，再用0.1％升汞消毒3分鐘；無菌水沖洗五次后接種到MS培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度保持在28℃，培養(yǎng)時間為30天，30天后長出具有根、莖、葉的完整植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了白桂木的離體繁殖方法。該方法由以下步驟組成(1)無菌外植體的獲得、(2)芽的誘導(dǎo)、(3)芽的增殖、(4)根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)、(5)試管苗的移栽。本發(fā)明對受威脅的瀕危植物白桂木進(jìn)行離體組培快繁殖技術(shù)的研究，以搶救該物種，使其種群得以繁衍擴(kuò)大；并利用離體組培的方法大量提供了珍稀植物白桂木的優(yōu)良組培苗，對保存和保護(hù)瀕危植物白桂木并對其加以開發(fā)利用具有重要的生態(tài)效益、社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A01H4/00GK1557142SQ20041001509
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者劉頌頌, 葉永昌, 招曉東 申請人:東莞市林業(yè)科學(xué)研究所