專利名稱：一種微生物飼料添加劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物飼料添加劑，具體地說(shuō)是涉及一種由多種有益微生物和其代謝產(chǎn)物(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等)組成的微生物飼料添加劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中一些促生長(zhǎng)保健劑的使用推動(dòng)了畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，但同時(shí)又給人類健康和飼料業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了許多潛在的威脅。目前飼料和畜禽養(yǎng)殖中濫用抗生素、化學(xué)合成藥物、激素、β-興奮劑、重金屬、鎮(zhèn)靜劑等促生長(zhǎng)保健劑，導(dǎo)致一系列問(wèn)題和后果(1)導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品中藥物殘留嚴(yán)重，直接危害人體健康，甚至產(chǎn)生“三致”，并使我國(guó)的畜禽產(chǎn)品和水產(chǎn)品在進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)時(shí)，面臨重重障礙，每年遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。(2)導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品品質(zhì)下降，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和信任感。目前在飼料中廣泛使用的對(duì)氨基苯胂(砷)酸等砷制劑，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC，1980)列為致癌因子。另外，在養(yǎng)豬業(yè)中長(zhǎng)期使用鎮(zhèn)靜劑等，引起藥物殘留。我國(guó)衛(wèi)生部報(bào)道(1998)，中國(guó)每年新增200萬(wàn)癌癥患者，其中100萬(wàn)人死去。這使消費(fèi)者對(duì)畜禽產(chǎn)品產(chǎn)生“恐食癥”。(3)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、耐藥菌株增多，結(jié)果用藥無(wú)效，威脅人類安全，科學(xué)界稱之為“細(xì)菌復(fù)仇”。世界衛(wèi)生組織專家認(rèn)為，通過(guò)牲畜產(chǎn)生的各種抗藥性病菌，可以通過(guò)食品傳給人，并產(chǎn)生很難治愈的疾病，危害人類健康。同時(shí)，金霉素、土霉素、氯霉素、喹乙醇、磺胺藥物、馬杜霉素等易殘留和毒性較大的抗生素及合成抗菌藥物的大量使用，導(dǎo)致藥物殘留增加，耐藥菌株擴(kuò)散，動(dòng)物菌群失調(diào)，動(dòng)物的免疫力受到抑制，繼發(fā)二次感染。(4)引起生態(tài)環(huán)境破壞。環(huán)境保護(hù)正日益成為世界各國(guó)人民越來(lái)越關(guān)心的問(wèn)題。集約化畜禽生產(chǎn)造成的污染已成為制約畜禽生產(chǎn)的重要因素。據(jù)EEC報(bào)告，歐洲一氧化二氮(N2O)和甲烷排放量中分別有33％和34％來(lái)自畜禽飼養(yǎng)場(chǎng)。一氧化二氮在光化學(xué)作用下，可形成二氧化氮，又可與臭氧作用，可引起皮膚癌。集約化養(yǎng)殖中，畜禽排出大量的氨態(tài)氮和磷等，氨是一種污染性很強(qiáng)的物質(zhì)，通過(guò)改變水和土壤酸堿性而影響植物的生長(zhǎng)。此外，單胃動(dòng)物由于無(wú)法利用植酸磷而將攝入體內(nèi)的70％磷排泄掉，飼料中使用高銅制劑或砷制劑，也會(huì)經(jīng)動(dòng)物排泄物而污染水源和耕地，最終經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體。目前一些并不安全的促生長(zhǎng)保健劑在我國(guó)有1000多家獸藥企業(yè)生產(chǎn)銷售，達(dá)300億元，這不僅導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品殘留增加，也污染了環(huán)境。
鑒于上述飼料和畜禽養(yǎng)殖中存在的諸多問(wèn)題，抗生素等藥物添加劑的使用已受到消費(fèi)者的普遍反對(duì)，近些年，消費(fèi)者特別注重食品的安全、衛(wèi)生和健康，形成了“健康的動(dòng)物→安全的食品→健康的人類”之共識(shí)，因而對(duì)食品質(zhì)量的要求十分苛刻。為此，世界各國(guó)對(duì)抗生素各自采取了禁用或限制使用的堅(jiān)決措施，如歐盟從2006年全部禁用抗生素，世界衛(wèi)生組織(WHO)提出了“在食用動(dòng)物中減少抗生素使用的全球原則”，中國(guó)已啟動(dòng)“飼料安全工程”，并禁用了一批毒性和殘留較大的藥物。面對(duì)世界各國(guó)的消費(fèi)者對(duì)食品“安全、健康、營(yíng)養(yǎng)”和回歸自然的強(qiáng)烈要求，各個(gè)國(guó)家正在積極開(kāi)發(fā)綠色飼料添加劑或綠色促生長(zhǎng)保健劑。微生物飼料添加劑或稱微生態(tài)活菌制劑、益生素，以其天然、無(wú)毒、無(wú)副作用、無(wú)耐藥性、無(wú)環(huán)境污染，并可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和增重、增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能、降低動(dòng)物死亡率、提高飼料轉(zhuǎn)化率和動(dòng)物飼養(yǎng)效益等優(yōu)點(diǎn)，受到世界各國(guó)科學(xué)家和動(dòng)物飼養(yǎng)者的廣泛認(rèn)同和親睞。在飼料或動(dòng)物飼養(yǎng)中應(yīng)用微生物飼料添加劑，可替代抗生素或大幅度消減抗生素等藥物的用量，提高畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味以及增強(qiáng)畜禽產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，有利于畜牧業(yè)的持續(xù)和健康發(fā)展，有利于動(dòng)物和人類的健康，有利于環(huán)境保護(hù)。因此，開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)微生物綠色飼料添加劑，具有重要的現(xiàn)實(shí)、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義。
微生物飼料添加劑，在國(guó)際上統(tǒng)稱為益生素(Probiotics)，其通用的定義是指含活菌和(或)死菌，包括其組分和產(chǎn)物的細(xì)菌制品，經(jīng)口或經(jīng)由其它粘膜途徑投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機(jī)制(1994，德國(guó)國(guó)際會(huì)議上40多個(gè)國(guó)家參加的最新定義)。
乳酸桿菌、酵母菌和芽孢桿菌是具有各自的生物學(xué)特點(diǎn)和功能的益生菌類。其中，乳酸桿菌是一種喜歡在厭氧或少氧環(huán)境中生存的微生物，是動(dòng)物消化道內(nèi)正常微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，與動(dòng)物“終生為伴，終生為益”，發(fā)揮著拮抗病原微生物(如大腸桿菌和沙門氏菌等)、啟動(dòng)特異和非特異性免疫系統(tǒng)(增強(qiáng)免疫力和抗病力)、降低膽固醇、中和腸毒素、合成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生消化酶類并調(diào)節(jié)畜禽營(yíng)養(yǎng)代謝等功能。酵母菌是耗氧微生物，它不僅能幫助動(dòng)物消化，還能促進(jìn)消化道內(nèi)源有益微生物的活力，補(bǔ)充B族維生素，其細(xì)胞壁多糖還具有刺激動(dòng)物免疫力，提高抗病力的功效。益生型芽孢桿菌，屬于耗氧型微生物，它們進(jìn)入消化道后能迅速發(fā)育、生長(zhǎng)，產(chǎn)生很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等活性物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，還能產(chǎn)生維生素B和維生素K，通過(guò)降低消化道內(nèi)氧化還原電位，以及產(chǎn)生少量抗菌物質(zhì)，來(lái)對(duì)有害微生物起到抑制和殺滅作用，同時(shí)，其孢子對(duì)熱、壓、酸、堿、酶及某些藥物、X射線等不良環(huán)境具有很強(qiáng)的耐受性，在飼料加工、貯存及消化道中穩(wěn)定性好，無(wú)需特殊保護(hù)性處理，就能存活很長(zhǎng)時(shí)間，因此，可廣泛適用于豬、牛、雞等家畜、禽以及水產(chǎn)動(dòng)物。
目前，一些飼料企業(yè)都在積極尋找和研究新的綠色環(huán)保的微生物飼料添加劑。但市場(chǎng)上的此類微生物飼料添加劑一般多為使用乳酸桿菌、酵母菌和芽孢桿菌中的一種制得的單菌制劑，功能單一，產(chǎn)品中活菌含量低，生產(chǎn)工藝和設(shè)備較落后，活菌細(xì)胞存活時(shí)間短，品質(zhì)較差，且雜菌污染嚴(yán)重，使用效果不理想、不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用包括乳酸桿菌、酵母菌和芽孢桿菌在內(nèi)的三類4株有益功能微生物合理復(fù)合配伍、采用液體深層發(fā)酵技術(shù)和一系列后加工工藝技術(shù)，來(lái)克服現(xiàn)有的微生物飼料添加劑功能單一、產(chǎn)品中活菌含量低、活菌細(xì)胞存活時(shí)間短、產(chǎn)品雜菌污染嚴(yán)重、使用效果不理想、功效不穩(wěn)定的缺陷，從而提供一種活菌含量高、產(chǎn)品保存時(shí)間長(zhǎng)、雜菌污染少、能提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分和飼料利用率的微生物飼料添加劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述微生物飼料添加劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供所述微生物飼料添加劑的用途。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種微生物飼料添加劑，其液劑型為將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)和釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)分別進(jìn)行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，并將各單菌的發(fā)酵液混合而得，混合的發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌+蠟狀芽孢桿菌+乳酸桿菌+釀酒酵母菌的活菌數(shù)有三個(gè)規(guī)格，即≥1億/ml，≥10億/ml和≥100億/ml。
所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的發(fā)酵液的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌菌種分別采用劃線接種的方法在芽孢桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于25～35℃培養(yǎng)12～24小時(shí)，分別使枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的芽孢桿菌平板培養(yǎng)基為按下述重量體積比(W/V)配制的混合物蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氫鉀0.3～0.6％、瓊脂3～4％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；2)制作搖瓶種子從步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌菌落中分別挑單菌落，接種到芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，于28～37℃培養(yǎng)20～30小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌搖瓶種子液；所述的芽孢桿菌液體培養(yǎng)基為按下述重量體積比(W/V)配制的混合液蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氫鉀0.3～0.6％、3.08％硫酸錳溶液0.5～1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液將步驟2)得到的枯草芽孢桿菌搖瓶種子液和臘狀芽孢桿菌搖瓶種子液以2～5v％的接種量，分別接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，于32～37℃培養(yǎng)18～24h，攪拌速度150～200rpm，通氣量為1～2vols/vol/min(簡(jiǎn)寫為vvm)，分別得到枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基配方為按下述重量體積比(W/V)配制的混合液120目豆粕粉0.5～2.0％、120目魚粉0.2～1.5％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1.0～4.5％、NaCl 0.1～0.3％、NaOH 0.05～0.10％、Na2HPO40.1～0.5％、增效劑0.05～0.2％，消泡劑0.05～0.1％，pH＝7.5～7.6，經(jīng)121℃滅菌30～45分鐘，冷卻到32～37℃；所述的增效劑在在先申請(qǐng)200410008993.3中公開(kāi)，為由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～0.8g/L，CuSO40.0 1～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌一級(jí)種子，分別以5～10％的體積比接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同于步驟3)的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，發(fā)酵16～24小時(shí)后，通過(guò)顯微鏡觀察，有大量芽孢形成時(shí)停止發(fā)酵。
在工業(yè)上生產(chǎn)時(shí)，當(dāng)需要更大規(guī)模(20噸以上發(fā)酵罐)的生產(chǎn)量時(shí)，還包括步驟5)進(jìn)行三級(jí)發(fā)酵5)三級(jí)發(fā)酵將步驟4)得到的枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌二級(jí)種子，以5～10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵16～24小時(shí)后，通過(guò)顯微鏡觀察，有大量芽孢形成時(shí)，停機(jī)。
所述的乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)的發(fā)酵液的培養(yǎng)方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將乳酸桿菌斜面種子采用劃線接種的方法在乳酸桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于33～38℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，使乳酸桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的乳酸桿菌平板培養(yǎng)基為按下述重量體積比(W/V)配制的混合物大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氫鉀0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、檸檬酸三銨1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸鈉0.2～0.6％、瓊脂粉2～2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃滅菌15分鐘，備用；
2)制作搖瓶種子將步驟1)培養(yǎng)的乳酸桿菌菌落中挑單菌落，接種到乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)方法在三角瓶液體培養(yǎng)基上于35～40℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，得到乳酸桿菌搖瓶種子；所述的培養(yǎng)基為按下述重量體積比(W/V)配制的混合液大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氫鉀0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、檸檬酸三銨1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸鈉0.2～0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液將步驟2)得到的乳酸桿菌搖瓶種子以6～12v％的接種量，接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，于35～38℃培養(yǎng)17～60h，攪拌速度150～200rpm，間隔1小時(shí)通氣5～10分鐘，通氣量為1～2.5vols/vol/min(vvm)，直至乳酸桿菌數(shù)達(dá)到10億，得到乳酸桿菌的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基配方為按下述重量體積比(W/V)配制的混合液120目豆粕粉0.5～2.0％、120目魚粉0.5～1.0％、魚蛋白胨0.5～2％，乳糖0.2～1.5％，120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1～2.5％、NaCl 0.1～0.3％、Na2HPO40.15～0.3％、增效劑0.05～0.3％，消泡劑0.03～0.1％，pH＝5.5～5.8，經(jīng)121℃滅菌30～45分鐘，冷卻到32～37℃；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008992.9中公開(kāi)，為由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的乳酸桿菌一級(jí)種子，以5～10％體積比接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同于步驟3)的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，發(fā)酵17～60小時(shí)后，檢測(cè)pH值下降到5.0左右時(shí)(此時(shí)，多次試驗(yàn)的結(jié)果表明，乳酸桿菌量已達(dá)到大于109CFU/ml發(fā)酵液)停止發(fā)酵。
在工業(yè)上生產(chǎn)時(shí)，當(dāng)需要更大規(guī)模(20噸以上發(fā)酵罐)的生產(chǎn)量時(shí)，還包括步驟5)進(jìn)行三級(jí)發(fā)酵5)三級(jí)發(fā)酵將步驟4)得到的乳酸桿菌二級(jí)種子，以5～10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵17～60小時(shí)后，檢測(cè)直至乳酸桿菌數(shù)達(dá)到10億/ml，停機(jī)。
所述的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的發(fā)酵液的培養(yǎng)方法，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將釀酒酵母斜面種子采用劃線接種的方法在釀酒酵母平板培養(yǎng)基上劃線接種，于24～30℃培養(yǎng)20～24小時(shí)，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；所述的釀酒酵母平板培養(yǎng)基為按下述重量體積比(W/V)配制的混合物大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麥芽膏0.2～1％、瓊脂粉2～3％，pH＝5.8～6.0，121℃滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子從步驟1)培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)平板中挑單菌落，接種到三角瓶液體培養(yǎng)液中，于28～32℃培養(yǎng)24～37小時(shí)，得到釀酒酵母搖瓶種子液；所述的培養(yǎng)液為按下述重量體積比(W/V)配制的混合液大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麥芽膏0.2～1％，pH＝5.8～6.0，121℃滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液將步驟2)得到的釀酒酵母搖瓶種子按2～12v％的接種量，接種于一級(jí)種子罐的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，于28～32℃培養(yǎng)24～37小時(shí)，攪拌速度160～220rpm，通氣量為1.0～3.0vols/vol/min(vvm)，得到釀酒酵母的一級(jí)種子液；所述的釀酒酵母一級(jí)種子培養(yǎng)液為按下述重量體積比(W/V)配制的混合液120目豆粕粉0.5～1.5％、120目魚粉0.2～0.8％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖0.3～1.0％、NaCl 0.1～0.3％、Na2HPO40.2～0.5％、增效劑0.05～0.2％，消泡劑0.03～0.1％，pH＝5.8～6.0，經(jīng)121℃滅菌30～45分鐘，冷卻到32～37℃；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008994.8中公開(kāi)，為由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.8g/L，CuSO40.02～0.08g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的釀酒酵母一級(jí)種子，以4～10％體積比接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同于步驟3)的一級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵24～60小時(shí)后，檢測(cè)釀酒酵母菌數(shù)達(dá)到10億/ml時(shí)停止發(fā)酵。
在工業(yè)上生產(chǎn)時(shí)，當(dāng)需要更大規(guī)模(20噸以上發(fā)酵罐)的生產(chǎn)量時(shí)，還包括步驟5)進(jìn)行三級(jí)發(fā)酵5)三級(jí)發(fā)酵將步驟4)得到的釀酒酵母二級(jí)種子，以5～10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵24～60小時(shí)后，檢測(cè)直至釀酒酵母菌數(shù)達(dá)到10億/ml，停機(jī)。
本發(fā)明提供的微生物添加劑液劑為將上述芽孢桿菌發(fā)酵液、乳酸桿菌發(fā)酵液、酵母發(fā)酵液按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后根據(jù)實(shí)際用途按照下述體積比配制而成液劑型微生物添加劑通用型的配比為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 10～30v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 10～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 30～50v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液10～30v％。
液劑型微生物添加劑幼齡動(dòng)物專用型的配比為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 10～20v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 10～20v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 40～60v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液15～25v％。
液劑型微生物添加劑中大齡動(dòng)物專用型的配比為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 20～40v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 15～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 20～40v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液10～25v％。
液劑型微生物添加劑反芻動(dòng)物(牛羊等)專用型的配比為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 15～30v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 10～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 30～40v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液15～35v％。
液劑型微生物添加劑制粒飼料專用型的配比為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 30～40v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 20～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 20～30v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液10～20v％。
本發(fā)明提供的微生物飼料添加劑，其粉劑型為將上述枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸桿菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵液經(jīng)不同的后加工工藝制成干粉，按如下比例配制的混合物，干粉中枯草芽孢桿菌+蠟狀芽孢桿菌+乳酸桿菌+釀酒酵母菌的活菌數(shù)有三個(gè)規(guī)格，即≥1億/ml，≥10億/ml和≥100億/ml。
所述的枯草芽孢桿菌干粉和蠟狀芽孢桿菌干粉的制備方法，包括如下的步驟將枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液，分別按照發(fā)酵液與載體的重量比為0.5～0.8∶1的比例混合均勻，呈濕粉狀，然后在流化干燥床上于80～100℃干燥后粉碎到80目以上，分別得到枯草芽孢桿菌干粉和蠟狀芽孢桿菌干粉；所述的載體(吸附劑)配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％；或是將枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液分別按體積與重量比加入發(fā)酵液體積0.3～0.8％的糊精和3～10％的輕質(zhì)碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機(jī)上按進(jìn)風(fēng)100～130℃，出風(fēng)60～90℃，噴壓2kg，流量1000～1500ml/min，進(jìn)行噴霧干燥，得到枯草芽孢桿菌噴霧干粉和蠟狀芽孢桿菌噴霧干粉。
所述的乳酸菌干粉的制備方法，包括如下的步驟1)將上述乳酸菌的發(fā)酵液經(jīng)熱低溫(＜45℃)負(fù)壓真空濃縮到原體積的40～60％；2)加入占濃縮液的重量/體積百分比15～20％的保護(hù)劑，混合均勻后于-25～-45℃冷凍干燥，得到乳酸菌凍干粉；所述的保護(hù)劑為脫脂奶粉、白砂糖(蔗糖)、麥芽糊精、明膠按1∶2∶1∶1比例混合而成；或是將乳酸菌的濃縮液加入預(yù)先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.4～0.9∶1，然后經(jīng)流化床45～60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉；所述載體包括輕質(zhì)CaCO330～40wt％、次粉15～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
所述的釀酒酵母菌干粉的制備方法，包括如下的步驟1)將上述釀酒酵母菌的發(fā)酵液經(jīng)熱低溫(＜45℃)負(fù)壓真空濃縮到原體積的40～60％，得到釀酒酵母菌的濃縮液；2)將釀酒酵母菌的濃縮液加入預(yù)先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.6～0.9∶1，然后流化床干燥，干燥溫度45～60℃，得到釀酒酵母菌干粉；所述載體包括輕質(zhì)CaCO330～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
本發(fā)明提供的微生物添加劑粉劑為將上述芽孢桿菌干粉、乳酸桿菌干粉按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后根據(jù)實(shí)際用途按照下述重量比配制而成粉劑型微生物添加劑通用型的配比枯草芽孢桿菌干粉 10～30wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 10～30wt％；乳酸桿菌干粉 30～50wt％；釀酒酵母菌干粉10～30wt％。
粉劑型微生物添加劑幼齡動(dòng)物專用型的配比為枯草芽孢桿菌干粉 10～20wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 10～20wt％；乳酸桿菌干粉 40～60wt％；釀酒酵母菌干粉15～25wt％。
粉劑型微生物添加劑中大齡動(dòng)物專用型的配比為枯草芽孢桿菌干粉 20～40wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 15～30wt％；乳酸桿菌干粉 20～40wt％；釀酒酵母菌干粉10～25wt％。
粉劑型微生物添加劑反芻動(dòng)物(牛羊等)專用型的配比為枯草芽孢桿菌干粉 15～30wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 10～30wt％；乳酸桿菌干粉 30～40wt％；釀酒酵母菌干粉15～35wt％。
粉劑型微生物添加劑制粒飼料專用型的配比為枯草芽孢桿菌干粉 30～40wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 20～30wt％；乳酸桿菌干粉 20～30wt％；釀酒酵母菌干粉10～20wt％。
本發(fā)明提供的上述微生物飼料添加劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下液劑4種微生物的活菌總和≥108/毫升(1億)，109/毫升(10億)和1010/毫升(100億)3種型號(hào)或規(guī)格，均棕黃色液體，較濃的酸香味；酸性液體，pH≤4.5。
粉劑4種微生物的活菌總和≥1億/克，10億/克和100億/克3種型號(hào)或規(guī)格，為淡黃白色粉沫，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，鉛≤1.0mg/kg。
本發(fā)明提供一種所述的微生物飼料添加劑的用途。該添加劑用作抗生素替代品或產(chǎn)酶益生素(加酶益生素)，消除藥物殘留，提高肉蛋奶等產(chǎn)品品質(zhì)，可用于防治各種動(dòng)物拉稀腹瀉，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能(增加肉、蛋、奶產(chǎn)量)、提高免疫力、抗病力和飼料轉(zhuǎn)化效率、降低動(dòng)物死淘率，還可用于制作青貯、黃貯飼料和生物飼料，棉粕(餅)和菜粕(餅)脫毒，凈化廄舍環(huán)境(除臭降氨)和凈化魚蝦池水質(zhì)等。
本發(fā)明提供的微生物飼料添加劑(益生康)主要由安全高效有益的芽孢菌、乳酸菌、酵母菌等以及微生物產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素分解酶及抑菌活性物質(zhì)組成，所選菌種屬于美國(guó)食品藥物管理局和美國(guó)飼料管理協(xié)會(huì)公布的微生物種類，符合GRAS標(biāo)準(zhǔn)，可廣泛用于畜禽和水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖中，是無(wú)公害的綠色飼料添加劑。本發(fā)明提供的微生物飼料添加劑利用酵母菌和芽孢桿菌能消耗胃腸道食物中溶解氧的特點(diǎn)，為內(nèi)源性厭氧有益微生物如乳酸菌類、雙歧桿菌等提供厭氧環(huán)境，同時(shí)厭氧環(huán)境可抑制喜氧有害微生物如大腸桿菌和沙門氏菌等的生長(zhǎng)繁殖，從而維護(hù)動(dòng)物腸道菌群的平衡和動(dòng)物的健康，同時(shí)發(fā)揮了三類有益菌和腸內(nèi)源性有益菌的功能，最終起到促生長(zhǎng)、提高生產(chǎn)效率和飼料利用率以及保健作用。與現(xiàn)有微生物添加劑的技術(shù)相比，在發(fā)酵工藝、后處理工藝、活菌含量和功效穩(wěn)定性等方面，本發(fā)明提供的微生物飼料添加劑的優(yōu)益之處在于1)該產(chǎn)品無(wú)毒副作用、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留、成本低、效果顯著；2)采用液體深層高密度發(fā)酵法代替固體發(fā)酵法，活菌含量高，生產(chǎn)效率高，液劑3種規(guī)格產(chǎn)品中的活菌分別可達(dá)108/毫升、109/毫升或1010/毫升，粉劑3種規(guī)格產(chǎn)品中的活菌也可達(dá)108/g、109/g或1010/g，不同規(guī)格、不同的劑型可適用于不同的用戶群，具有更強(qiáng)的實(shí)用性或市場(chǎng)適應(yīng)性；3)本發(fā)明產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程中，一是采用液體深層高密度發(fā)酵技術(shù)(滅菌徹底、條件可控性強(qiáng))，避免了粗放的固體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的雜菌污染，或滅菌不徹底而在發(fā)酵過(guò)程中雜菌繁殖，致使有害菌和目標(biāo)菌(有益菌)一起混合生長(zhǎng)，產(chǎn)品不純等問(wèn)題；二是本發(fā)明在后處理工藝中，對(duì)載體或吸附劑先經(jīng)流化干燥床在105℃，1～2分鐘的干燥滅菌處理，殺滅載體原料中的一些有害菌，使得產(chǎn)品的目標(biāo)菌成分純度高，功效明確、穩(wěn)定，不會(huì)因雜菌的存在影響產(chǎn)品的功效；4)本發(fā)明的微生物飼料添加劑為4種有益菌，科學(xué)組合，比例搭配得當(dāng)合理，功能齊全、明確，功效強(qiáng)；5)在發(fā)酵過(guò)程中加入了增效劑，使益生菌總數(shù)比現(xiàn)有產(chǎn)品提高幾倍到幾十倍，且延長(zhǎng)了產(chǎn)品的儲(chǔ)存期，提高了產(chǎn)品的功效穩(wěn)定性；6)本方法生產(chǎn)的產(chǎn)品成本低廉，適合于在飼料生產(chǎn)和畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液(A)1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將枯草芽孢桿菌的保藏菌種采用劃線接種的方法在芽孢桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于30℃培養(yǎng)18小時(shí)，使枯草芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物蛋白胨0.5％(W/V，下同)、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氫鉀0.3％、瓊脂3％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；2)制作搖瓶(三角瓶)種子從步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌落中挑選典型的單菌落，接種到芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，于32℃培養(yǎng)30小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌搖瓶種子液；所述的芽孢桿菌液體培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液蛋白胨0.5％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、磷酸二氫鉀0.6％、3.08％硫酸錳溶液1.0％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液先按照后述的配方配制一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，pH＝7.5～7.6，經(jīng)121℃，滅菌45分鐘，冷卻到37℃，然后將步驟2)得到的枯草芽孢桿菌搖瓶種子液以2v％的接種量，分別接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐中，于37℃培養(yǎng)24h，攪拌速度200rpm，通氣量為2vvm，得到枯草芽孢桿菌的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基配方為按下述比例配制的混合液(W/V)，120目豆粕粉1.0％、120目魚粉1.0％、120目玉米面0.5％、葡萄糖2.0％、NaCl 0.2％、NaOH 0.08％、Na2HPO40.3％、增效劑0.1％，消泡劑0.08％；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008993.3中公開(kāi)，為由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的枯草芽孢桿菌一級(jí)種子，以10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵20小時(shí)后，通過(guò)顯微鏡觀察，有大量芽孢形成時(shí)，停機(jī)，得到枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液。最后按照枯草芽孢桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的備用液(A)，待后處理。
實(shí)施例2、培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液(A)1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將枯草芽孢桿菌的保藏菌種采用劃線接種的方法在芽孢桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于30℃培養(yǎng)18小時(shí)，使枯草芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物蛋白胨0.5％(％指重量體積百分比，下同)、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氫鉀0.3％、瓊脂3％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；2)制作搖瓶(三角瓶)種子從步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌落中挑選典型的單菌落，接種到芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，于32℃培養(yǎng)30小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌搖瓶種子液；所述的芽孢桿菌液體培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液蛋白胨0.5％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、磷酸二氫鉀0.6％、3.08％硫酸錳溶液1.0％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液先按照后述的配方配制一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，pH＝7.5～7.6，經(jīng)121℃，滅菌45分鐘，冷卻到37℃，然后將步驟2)得到的枯草芽孢桿菌搖瓶種子液以2v％的接種量，分別接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐中，于37℃培養(yǎng)24h，攪拌速度200rpm，通氣量為2vvm，得到枯草芽孢桿菌的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基配方為按下述比例配制的混合液(W/V)，120目豆粕粉1.0％、120目魚粉1.0％、120目玉米面0.5％、葡萄糖2.0％、NaCl 0.2％、NaOH 0.08％、Na2HPO40.3％、增效劑0.1％，消泡劑0.08％；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008993.3中公開(kāi)，為由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的枯草芽孢桿菌一級(jí)種子，以10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵16小時(shí)后，停機(jī)，得到枯草芽孢桿菌的二級(jí)種子。
5)三級(jí)發(fā)酵將步驟4)得到的枯草芽孢桿菌二級(jí)種子，以5％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的三級(jí)發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵20小時(shí)后，通過(guò)顯微鏡觀察，有大量芽孢形成時(shí)，停機(jī)，得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。最后按照枯草芽孢桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的備用液(A)，待后處理。
實(shí)施例3、培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液(B)微生物種類為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，培養(yǎng)基、條件、制備方法同實(shí)施例1，得到蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液，最后按照臘樣芽孢桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)臘樣芽孢桿菌發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液的備用液(B)，待后處理。
實(shí)施例4、培養(yǎng)蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液(B)1)微生物種類為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，培養(yǎng)基、條件、制備方法同實(shí)施例2，得到蠟狀芽孢桿菌二級(jí)種子液。
2)三級(jí)發(fā)酵將步驟1)得到的蠟狀芽孢桿菌二級(jí)種子，以8％體積的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)液的三級(jí)發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟2)，發(fā)酵22小時(shí)后，通過(guò)顯微鏡觀察，有大量芽孢形成時(shí)，停機(jī)，得到蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液，最后按照臘樣芽孢桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)臘樣芽孢桿菌發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液的備用液(B)，待后處理。
實(shí)施例5、二級(jí)培養(yǎng)乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)發(fā)酵液(C)1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將保藏的乳酸桿菌斜面種子采用劃線接種的方法在乳酸桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于33℃培養(yǎng)24小時(shí)，使乳酸桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的乳酸桿菌培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物大豆蛋白胨1％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氫鉀0.3％、牛肉膏0.5％、檸檬酸三銨2.3％、Tween-80 1.4％、乙酸鈉0.2％、瓊脂粉2％，pH＝5.5～5.8，121℃，滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子將步驟1)培養(yǎng)的乳酸桿菌菌落中挑選典型的單菌落，接種到乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)方法在三角瓶液體培養(yǎng)基上于35℃培養(yǎng)30小時(shí)，得到乳酸桿菌搖瓶種子；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液大豆蛋白胨1％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氫鉀0.5％、牛肉膏0.5％、檸檬酸三銨1.5％、Tween-80 0.5％、乙酸鈉0.6％，pH＝5.5～5.8，115℃，滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液先按照后述的配方配制一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，經(jīng)121℃，滅菌45分鐘，pH＝5.5～5.8，冷卻到37℃，然后將步驟2)得到的乳酸桿菌搖瓶種子以8v％的接種量，接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐中，于35℃培養(yǎng)30h，攪速150rpm，間隔1小時(shí)通氣5分鐘，通氣量為1.0vvm，直至乳酸桿菌數(shù)達(dá)到10億，得到乳酸桿菌生產(chǎn)所用的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液(W/V)120目豆粕粉0.5、120目魚粉0.5％、魚蛋白胨0.5％，乳糖0.2％，120目玉米面0.5％、葡萄糖1％、NaCl 0.1％、Na2HPO40.15％、增效劑0.05％，消泡劑0.03％，pH＝5.5～5.8；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008992.9中公開(kāi)，為由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L組成的水溶液；所述的培養(yǎng)基同于步驟2)中的培養(yǎng)基；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的乳酸桿菌一級(jí)種子，以10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵24小時(shí)，得到乳酸桿菌發(fā)酵液，最后按照乳酸桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)乳酸桿菌發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到乳酸桿菌發(fā)酵液的備用液(C)，待后處理。
實(shí)施例6、三級(jí)發(fā)酵乳酸桿菌液(C)1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將保藏的乳酸桿菌斜面種子采用劃線接種的方法在乳酸桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于33℃培養(yǎng)24小時(shí)，使乳酸桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的乳酸桿菌培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物大豆蛋白胨1％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氫鉀0.3％、牛肉膏0.5％、檸檬酸三銨2.3％、Tween-80 1.4％、乙酸鈉0.2％、瓊脂粉2％，pH＝5.5～5.8，121℃，滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子將步驟1)培養(yǎng)的乳酸桿菌菌落中挑選典型的單菌落，接種到乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)方法在三角瓶液體培養(yǎng)基上于35℃培養(yǎng)30小時(shí)，得到乳酸桿菌搖瓶種子；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合液大豆蛋白胨1％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氫鉀0.5％、牛肉膏0.5％、檸檬酸三銨1.5％、Tween-80 0.5％、乙酸鈉0.6％，pH＝5.5～5.8，115℃，滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液先按照后述的配方配制一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，經(jīng)121℃，滅菌45分鐘，pH＝5.5～5.8，冷卻到37℃，然后將步驟2)得到的乳酸桿菌搖瓶種子以8v％的接種量，接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐中，于35℃培養(yǎng)30h，攪速150rpm，間隔1小時(shí)通氣5分鐘，通氣量為1.0vvm，直至乳酸桿菌數(shù)達(dá)到10億，得到乳酸桿菌生產(chǎn)所用的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子發(fā)酵培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液(W/V)120目豆粕粉0.5、120目魚粉0.5％、魚蛋白胨0.5％，乳糖0.2％，120目玉米面0.5％、葡萄糖1％、NaCl 0.1％、Na2HPO40.1 5％、增效劑0.05％，消泡劑0.03％，pH＝5.5～5.8；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008992.9中公開(kāi)，為由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L組成的水溶液；所述的培養(yǎng)基同于步驟2)中的培養(yǎng)基；4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的乳酸桿菌一級(jí)種子，以10％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵30小時(shí)后，檢測(cè)pH值下降到5.0左右時(shí)(此時(shí)，多次試驗(yàn)的結(jié)果表明，乳酸桿菌量已達(dá)到大于109CFU/ml發(fā)酵液)，停機(jī)，得到乳酸桿菌的發(fā)酵液，最后按照乳酸桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)乳酸桿菌發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到乳酸桿菌發(fā)酵液的備用液(C)，待后處理。
實(shí)施例7、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵液(D)1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將保藏的釀酒酵母斜面種子采用劃線接種的方法在釀酒酵母平板培養(yǎng)基上劃線接種，于24～30℃培養(yǎng)20～24小時(shí)，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.3％、麥芽膏0.7％、瓊脂粉3％，pH＝5.8～6.0，121℃，滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子從步驟1)培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)平板中挑選典型的單菌落，接種到三角瓶液體培養(yǎng)液中，于28～32℃培養(yǎng)24～37小時(shí)，得到釀酒酵母搖瓶種子液；所述的搖瓶種子培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.4％、麥芽膏0.8％，pH＝5.8～6.0，121℃，滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液先按照后述的釀酒酵母培養(yǎng)基配方配制一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，經(jīng)121℃，滅菌45分鐘，pH＝5.8～6.0，冷卻到35℃，然后將步驟2)得到的釀酒酵母搖瓶種子按10v％的比例接種于一級(jí)種子罐中，于35℃培養(yǎng)35小時(shí)，攪拌速度180rpm，通氣量為1.5VVM，得到釀酒酵母生產(chǎn)所用的一級(jí)種子液；所述的釀酒酵母一級(jí)種培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液120目豆粕粉0.9％、120目魚粉0.8％、120目玉米面0.9％、葡萄糖0.8％、NaCl 0.2％、Na2HPO40.5％、增效劑0.1％，消泡劑0.1％；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008994.8中公開(kāi)，為由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.8g/L，CuSO40.02～0.08g/L組成的水溶液。
4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的釀酒酵母一級(jí)種子，以5％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵36小時(shí)后，檢測(cè)直至釀酒酵母菌數(shù)達(dá)到10億/ml，停機(jī)，得到釀酒酵母菌的發(fā)酵液，最后按照酵母平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)酵母發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到酵母發(fā)酵液的備用液(D)，待后處理。
實(shí)施例8、三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵液(D)1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將保藏的釀酒酵母斜面種子采用劃線接種的方法在釀酒酵母平板培養(yǎng)基上劃線接種，于24～30℃培養(yǎng)20～24小時(shí)，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；所述的培養(yǎng)基為按下述比例配制的混合物大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.3％、麥芽膏0.7％、瓊脂粉3％，pH＝5.8～6.0，121℃，滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子從步驟1)培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)平板中挑選典型的單菌落，接種到三角瓶液體培養(yǎng)液中，于28～32℃培養(yǎng)24～37小時(shí)，得到釀酒酵母搖瓶種子液；所述的搖瓶種子培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.4％、麥芽膏0.8％，pH＝5.8～6.0，121℃，滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液先按照后述的釀酒酵母培養(yǎng)基配方配制一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，經(jīng)121℃，滅菌45分鐘，pH＝5.8～6.0，冷卻到32～37℃，然后將步驟2)得到的釀酒酵母搖瓶種子按8v％的接種量，接種于一級(jí)種子罐中，于32℃培養(yǎng)35小時(shí)，攪速220rpm，通氣量為2.5VVM，得到釀酒酵母一級(jí)種子液；所述的釀酒酵母一級(jí)種培養(yǎng)液為按下述比例配制的混合液120目豆粕粉0.9％、120目魚粉0.8％、120目玉米面0.9％、葡萄糖0.8％、NaCl 0.2％、Na2HPO40.5％、增效劑0.1％，消泡劑0.03％；所述的增效劑在先申請(qǐng)200410008994.8中公開(kāi)，為由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.8g/L，CuSO40.02～0.08g/L組成的水溶液。
4)二級(jí)發(fā)酵(生產(chǎn)發(fā)酵)將步驟3)得到的釀酒酵母一級(jí)種子，以7％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵30小時(shí)后得到釀酒酵母菌的二級(jí)種子。
5)三級(jí)發(fā)酵將步驟4)得到的釀酒酵母二級(jí)種子，以5％體積的比例接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的三級(jí)發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同步驟3)，發(fā)酵36小時(shí)后，檢測(cè)直至釀酒酵母菌數(shù)達(dá)到10億/ml，停機(jī)，得到釀酒酵母發(fā)酵液，最后按照酵母平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)酵母發(fā)酵液的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌自來(lái)水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到酵母發(fā)酵液的備用液(D)。
實(shí)施例9～30、制備本發(fā)明的微生物飼料添加劑的液劑益-1～益-22將實(shí)施例1～2的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液(A)、實(shí)施例3～4的蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液(B)、實(shí)施例5～6的乳酸桿菌的發(fā)酵液(C)和實(shí)施例7～8的釀酒酵母菌的發(fā)酵液(D)按表1所列的比例配制混合液，得到本發(fā)明的微生物飼料添加劑的液劑(益生康)，即益-1～益-22。
表1、本發(fā)明的微生物飼料添加劑的液劑

注“益”是指本發(fā)明的微生物添加劑產(chǎn)品名稱“益生康”的代號(hào)。
實(shí)施例31、制備枯草芽孢桿菌干粉(E)將實(shí)施例1或2得到的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液加到預(yù)先混合好的載體中混合均勻，所述載體為輕質(zhì)CaCO350wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉18％組成，發(fā)酵液與載體的重量比為0.5∶1，然后在45℃干燥；然后粉碎到80目以上，分別得到枯草芽孢桿菌干粉，最后按照芽孢桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用本實(shí)施例的載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到枯草芽孢桿菌干粉(E)。
實(shí)施例32、制備枯草芽孢桿菌干粉(F)將實(shí)施例1或2得到的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液加入0.5％(W/V)糊精和7％(W/V)輕質(zhì)碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機(jī)上按進(jìn)風(fēng)115℃，出風(fēng)80℃，噴壓2kg，流量1000ml/min，噴霧干燥，然后按照實(shí)施例3 1的載體和質(zhì)控方法，將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到枯草芽孢桿菌干粉(F)。
實(shí)施例33、制備蠟狀芽孢桿菌干粉(G)將實(shí)施例3或4得到的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液加到預(yù)先混合好的載體中，所述載體為輕質(zhì)CaCO345wt％、次粉30wt％、玉米蛋白粉20％組成，發(fā)酵液與載體的重量比為0.8∶1，然后在45℃干燥；然后粉碎到80目以上，分別得到蠟狀芽孢桿菌干粉，最后按照芽孢桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用本實(shí)施例的載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到的蠟狀芽孢桿菌干粉(G)。
實(shí)施例34、制備蠟狀芽孢桿菌干粉(H)將實(shí)施例3或4得到的蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液按重量體積比加入0.5％糊精和3％輕質(zhì)碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機(jī)上按進(jìn)風(fēng)100℃，出風(fēng)60℃，噴壓2kg，流量1100ml/min，進(jìn)行噴霧干燥，然后按照實(shí)施例33的載體和質(zhì)控方法，將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到蠟狀芽孢桿菌干粉(H)。
實(shí)施例35、制備乳酸菌干粉(I)將實(shí)施例5或6得到的乳酸桿菌發(fā)酵液經(jīng)熱低溫(＜45℃)負(fù)壓真空濃縮到原體積的40％，得到濃縮液。
然后加入由脫脂奶粉、白砂糖(蔗糖)、麥芽糊精、明膠按1∶2∶1∶1比例混合的保護(hù)劑15％(占濃縮液的重量/體積百分比)，與乳酸菌濃縮液混合均勻；將加入保護(hù)劑的乳酸菌濃縮液于-45℃冷凍干燥，最后，按照乳酸桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到乳酸菌凍干粉(I)；所述載體包括輕質(zhì)CaCO330wt％、次粉15wt％、玉米蛋白粉18wt％。
實(shí)施例36、制備乳酸菌干粉(J)將實(shí)施例5或6得到的乳酸桿菌發(fā)酵液經(jīng)熱低溫(＜45℃)負(fù)壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液加入預(yù)先混合好的載體中，所述載體包括為輕質(zhì)CaCO335wt％、次粉15wt％、玉米蛋白粉20％，濃縮液與載體的重量比為0.5∶1，然后流化床干燥，干燥溫度45℃，得到乳酸菌干粉，粉碎到80目以上，最后，按照乳酸桿菌平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到乳酸菌干粉(J)。
實(shí)施例37、制備釀酒酵母菌干粉(K)將實(shí)施例7或8得到的釀酒酵母菌發(fā)酵液經(jīng)熱低溫(＜45℃)負(fù)壓真空濃縮到原體積的40％，得到濃縮液。
將此濃縮液加入預(yù)先混合好的載體中，所述載體為輕質(zhì)CaCO340wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉20％，濃縮液與載體的重量比為0.7∶1，然后流化床干燥，干燥溫度50℃，得到釀酒酵母菌干粉(K)。
實(shí)施例38～47、制備本發(fā)明的微生物飼料添加劑的粉劑益-23～益-33將實(shí)施例31的枯草芽孢桿菌干粉(E)、實(shí)施例32的枯草芽孢桿菌干粉(F)、實(shí)施例33的蠟狀芽孢桿菌干粉(G)、實(shí)施例34的蠟狀芽孢桿菌干粉(H)、實(shí)施例35的乳酸菌干粉(I)、實(shí)施例36的乳酸菌干粉(J)和實(shí)施例37的釀酒酵母菌干粉(K)按表2所列的比例配制混合物，得到本發(fā)明的微生物飼料添加劑的粉劑(益生康)，即益-23～益-44。
表2、本發(fā)明的微生物飼料添加劑的粉劑

注表中“流干粉”是指流化床干燥粉；“噴干粉”是指噴霧干燥粉?！耙妗笔侵副景l(fā)明的微生物添加劑產(chǎn)品名稱“益生康”的代號(hào)。
實(shí)施例51、本發(fā)明的微生物飼料添加劑(益生康，活菌含量109/ml或g)對(duì)產(chǎn)奶量和乳房炎發(fā)生率的影響將體重650公斤左右的180頭3胎奶牛，分成5組，每組30頭，每組分為3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭，分組情況如下A組，空白對(duì)照組，僅飼奶?；A(chǔ)日糧；B組，添加益生康組，除飼喂奶?；A(chǔ)日糧外，每噸飼料添加1kg益-1微生物飼料添加劑；C組，添加益生康組，除飼喂奶?；A(chǔ)日糧外，每噸飼料添加1kg益-5微生物飼料添加劑；D組，添加益生康組，除飼喂奶?；A(chǔ)日糧外，每噸飼料添加1kg益-7微生物飼料添加劑；E組，添加益生康組，除飼喂奶牛基礎(chǔ)日糧外，每噸飼料添加1kg益-18微生物飼料添加劑；F組，添加益生康組，除飼喂奶?；A(chǔ)日糧外，每噸飼料添加1kg益-40微生物飼料添加劑；連續(xù)30天，并按上述分組重復(fù)試驗(yàn)4次，記錄各組每次檢測(cè)其產(chǎn)奶量和乳房炎發(fā)生率，然后進(jìn)行對(duì)比分析，列于表3。
奶?；A(chǔ)日糧，配方(重量百分比)玉米45％，麥麩10％，菜籽餅9％，棉粕10.0％，干啤酒糟5.0％，大豆粕18.0％，石粉1.0％，食鹽1.0％，預(yù)混料1％。
表3、試驗(yàn)前后奶牛產(chǎn)奶量和乳房炎發(fā)生率

從表3可看出，益生康可顯著提高奶牛的日平均產(chǎn)奶量，并明顯降低奶牛的乳房炎發(fā)生率，且在加日產(chǎn)奶量上后期多與前期，在乳房率發(fā)育率上，后期小于前期，這說(shuō)明隨著益生康使用時(shí)間的延長(zhǎng)，具有累積效應(yīng)。綜上試驗(yàn)表明，益生康可顯著提高奶牛的日平均產(chǎn)奶量，并可降低奶牛的乳房炎發(fā)生率，主要原因是由于益生康微生物添加劑能提高奶牛的免疫力所致。
實(shí)施例52、本發(fā)明的微生物飼料添加劑(益生康，活菌含量108/ml或g)對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、禽舍環(huán)境的影響共用日齡相同的產(chǎn)蛋后期海賽褐殼蛋雞15000只，分5組，每幢一組3000只，分3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1000只。分組情況如下A組，空白對(duì)照組，飼喂蛋雞基礎(chǔ)日糧；B組，添加益生康組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中加入1kg益-6微生物飼料添加劑；C組，添加益生康組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中加入1kg益-23微生物飼料添加劑；D組，添加益生康組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中加入1kg益-27微生物飼料添加劑；E組，添加益生康組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中加入1kg益-38微生物飼料添加劑；使用的蛋雞基礎(chǔ)日糧配方(重量百分比)為玉米58.72％，豆粕26.0％，麥麩2.0％，石粉8.44％，氫鈣1.5％，食鹽0.34％，植物油2.0％，1％預(yù)混料1.0％。
前7天為預(yù)試期，后23天為試驗(yàn)期，并按上述分組重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定了舍內(nèi)NH3、H2S濃度、雞蛋破損率、蛋白質(zhì)量(哈夫單位)、產(chǎn)蛋率、蛋重、死淘率、糞便狀態(tài)、蛋殼色澤等指標(biāo)。結(jié)果如表4所示。
表4、
從表4可以看出，飼喂本發(fā)明提供的益生康添加劑，雞蛋的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯好于對(duì)照組，說(shuō)明這種活性肽添加劑在提高蛋雞的生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)中起了良好的促進(jìn)作用。因益生康可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)微生物酶的分泌量，提高消化酶活性，進(jìn)而提高飼料氮營(yíng)養(yǎng)素吸收轉(zhuǎn)化和利用效率，間接的降低禽舍中氨氣和硫化氫的含量，有良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。
實(shí)施例53～56、本發(fā)明的微生物飼料添加劑(益生康)對(duì)仔豬、育肥豬、肉雞和草魚的影響表5、


從表5可以看出，飼喂本發(fā)明提供的益生康添加劑，仔豬、育成豬、肉仔雞的不同飼養(yǎng)階段以及草魚的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯好于對(duì)照組(添加抗生素)，說(shuō)明這種綠色飼料添加劑能有效防治畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物疾病、顯著提高生產(chǎn)性能(增重、飼料轉(zhuǎn)化效率等)、改善畜舍環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物的水質(zhì)、提高動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)等功效，有良好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。
權(quán)利要求
1.一種微生物飼料添加劑，其包括將枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸桿菌和釀酒酵母菌分別發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液或干粉。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液是由液體深層發(fā)酵得到，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌菌種分別采用劃線接種的方法在芽孢桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于25～35℃培養(yǎng)12～24小時(shí)，分別使枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的芽孢桿菌平板培養(yǎng)基為按下述重量體積比配制的混合物蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氫鉀0.3～0.6％、瓊脂3～4％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；2)制作搖瓶種子從步驟1)培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌菌落中分別挑單菌落，接種到芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，于28～37℃培養(yǎng)20～30小時(shí)，得到枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌搖瓶種子液；所述的芽孢桿菌液體培養(yǎng)基為按下述重量體積比配制的混合液蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氫鉀0.3～0.6％、3.08％硫酸錳溶液0.5～1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃滅菌30分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液將步驟2)得到的枯草芽孢桿菌搖瓶種子液和臘狀芽孢桿菌搖瓶種子液以2～5v％的接種量，分別接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，于32～37℃培養(yǎng)18～24h，攪拌速度150～200rpm，通氣量為1～2vols/vol/min，分別得到枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基配方為按下述重量體積比配制的混合液120目豆粕粉0.5～2.0％、120目魚粉0.2～1.5％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1.0～4.5％、NaCl 0.1～0.3％、NaOH 0.05～0.10％、Na2HPO40.1～0.5％、增效劑0.05～0.2％，消泡劑0.05～0.1％，pH＝7.5～7.6，經(jīng)121℃滅菌30～45分鐘，冷卻到32～37℃；所述的增效劑為由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵將步驟3)得到的枯草芽孢桿菌和臘狀芽孢桿菌一級(jí)種子，分別以5～10％的體積比接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同于步驟3)的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，發(fā)酵16～24小時(shí)后，通過(guò)顯微鏡觀察，有大量芽孢形成時(shí)停止發(fā)酵。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的干粉制備方法，包括如下的步驟將枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液，分別按照發(fā)酵液與載體的重量比為0.5～0.8∶1混合均勻，然后在流化干燥床上于80～100℃干燥后粉碎到80目以上，分別得到枯草芽孢桿菌干粉和蠟狀芽孢桿菌干粉；所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％；或是將枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液和蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液分別按體積與重量比加入發(fā)酵液體積0.3～0.8％的糊精和3～10％的輕質(zhì)碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機(jī)上按進(jìn)風(fēng)100～130℃，出風(fēng)60～90℃，噴壓2kg，流量1000～1500ml/min，進(jìn)行噴霧干燥，得到枯草芽孢桿菌噴霧干粉和蠟狀芽孢桿菌噴霧干粉。
4.如權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑，其特征在于，所述的乳酸桿菌的發(fā)酵液是由液體深層發(fā)酵得到，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將乳酸桿菌斜面種子采用劃線接種的方法在乳酸桿菌平板培養(yǎng)基上劃線接種，于33～38℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，使乳酸桿菌復(fù)壯，并形成單菌落；所述的乳酸桿菌平板培養(yǎng)基為按下述重量體積比配制的混合物大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氫鉀0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、檸檬酸三銨1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸鈉0.2～0.6％、瓊脂粉2～2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子將步驟1)培養(yǎng)的乳酸桿菌菌落中挑單菌落，接種到乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中，采用常規(guī)方法在三角瓶液體培養(yǎng)基上于35～40℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，得到乳酸桿菌搖瓶種子；所述的培養(yǎng)基為按下述重量體積比配制的混合液大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氫鉀0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、檸檬酸三銨1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸鈉0.2～0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液將步驟2)得到的乳酸桿菌搖瓶種子以6～12v％的接種量，接種于生產(chǎn)所用的一級(jí)種子罐的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，于35～38℃培養(yǎng)17～60h，攪拌速度150～200rpm，間隔1小時(shí)通氣5～10分鐘，通氣量為1～2.5vols/vol/min，直至乳酸桿菌數(shù)達(dá)到10億，得到乳酸桿菌的一級(jí)種子液；所述的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基配方為按下述重量體積比配制的混合液120目豆粕粉0.5～2.0％、120目魚粉0.5～1.0％、魚蛋白胨0.5～2％，乳糖0.2～1.5％，120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1～2.5％、NaCl 0.1～0.3％、Na2HPO40.15～0.3％、增效劑0.05～0.3％，消泡劑0.03～0.1％，pH＝5.5～5.8，經(jīng)121℃滅菌30～45分鐘，冷卻到32～37℃；所述的增效劑為由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵將步驟3)得到的乳酸桿菌一級(jí)種子，以5～10％體積比接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同于步驟3)的一級(jí)種子液體培養(yǎng)基，發(fā)酵17～60小時(shí)后，檢測(cè)pH值下降到5.0時(shí)停止發(fā)酵。
5.如權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑，其特征在于，所述的乳酸菌干粉的制備方法，包括如下的步驟1)將乳酸菌的發(fā)酵液在低于45℃、負(fù)壓真空條件下濃縮到原體積的40～60％；2)加入占濃縮液的重量/體積百分比15～20％的保護(hù)劑，混合均勻后于-25～-45℃冷凍干燥，得到乳酸菌凍干粉；所述的保護(hù)劑為脫脂奶粉、白砂糖、麥芽糊精、明膠按1∶2∶1∶1比例混合而成；或是將乳酸菌的濃縮液加入預(yù)先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.4～0.9∶1，然后經(jīng)流化床45～60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉；所述載體包括輕質(zhì)CaCO330～40wt％、次粉15～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
6.如權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑，其特征在于，所述的釀酒酵母的發(fā)酵液是由液體深層發(fā)酵得到，包括如下的步驟1)平板培養(yǎng)復(fù)壯將釀酒酵母斜面種子采用劃線接種的方法在釀酒酵母平板培養(yǎng)基上劃線接種，于24～30℃培養(yǎng)20～24小時(shí)，使釀酒酵母復(fù)壯，并形成單菌落；所述的釀酒酵母平板培養(yǎng)基為按下述重量體積比配制的混合物大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麥芽膏0.2～1％、瓊脂粉2～3％，pH＝5.8～6.0，121℃滅菌15分鐘，備用；2)制作搖瓶種子從步驟1)培養(yǎng)的釀酒酵母培養(yǎng)平板中挑單菌落，接種到三角瓶液體培養(yǎng)液中，于28～32℃培養(yǎng)24～37小時(shí)，得到釀酒酵母搖瓶種子液；所述的培養(yǎng)液為按下述重量體積比配制的混合液大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麥芽膏0.2～1％，pH＝5.8～6.0，121℃滅菌15分鐘，備用；3)生產(chǎn)一級(jí)種子液將步驟2)得到的釀酒酵母搖瓶種子按2～12v％的接種量，接種于一級(jí)種子罐的一級(jí)種子培養(yǎng)液中，于28～32℃培養(yǎng)24～37小時(shí)，攪拌速度160～220rpm，通氣量為1.0～3.0vols/vol/min，得到釀酒酵母的一級(jí)種子液；所述的釀酒酵母一級(jí)種子培養(yǎng)液為按下述重量體積比配制的混合液120目豆粕粉0.5～1.5％、120目魚粉0.2～0.8％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖0.3～1.0％、NaCl 0.1～0.3％、Na2HPO40.2～0.5％、增效劑0.05～0.2％，消泡劑0.03～0.1％，pH＝5.8～6.0，經(jīng)121℃滅菌30～45分鐘，冷卻到32～37℃；所述的增效劑為由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，F(xiàn)eSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.8g/L，CuSO40.02～0.08g/L組成的水溶液；4)二級(jí)發(fā)酵將步驟3)得到的釀酒酵母一級(jí)種子，以4～10％體積比接種到裝有生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)液的配方和控制條件同于步驟3)的一級(jí)種子培養(yǎng)液，發(fā)酵24～60小時(shí)后，檢測(cè)釀酒酵母菌數(shù)達(dá)到10億/ml時(shí)停止發(fā)酵。
7.如權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑，其特征在于，所述的釀酒酵母菌干粉的制備方法，包括如下的步驟1)將釀酒酵母菌的發(fā)酵液在低于45℃、負(fù)壓真空的條件下濃縮到原體積的40～60％，得到釀酒酵母菌的濃縮液；2)將釀酒酵母菌的濃縮液加入預(yù)先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.6～0.9∶1，然后流化床干燥，干燥溫度45～60℃，得到釀酒酵母菌干粉；所述載體包括輕質(zhì)CaCO330～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
8.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其通用型液劑為將芽孢桿菌發(fā)酵液、乳酸桿菌發(fā)酵液、酵母發(fā)酵液按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述體積比配制而成枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 10～30v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 10～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 30～50v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液 10～30v％。
9.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其幼齡動(dòng)物專用型液劑為將芽孢桿菌發(fā)酵液、乳酸桿菌發(fā)酵液、酵母發(fā)酵液按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述體積比配制而成枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 10～20v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液10～20v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 40～60v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液 15～25v％。
10.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其中大動(dòng)物專用型液劑為將芽孢桿菌發(fā)酵液、乳酸桿菌發(fā)酵液、酵母發(fā)酵液按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述體積比配制而成枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 20～40v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 15～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 20～40v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液 10～25v％。
11.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其反芻動(dòng)物專用型液劑為將芽孢桿菌發(fā)酵液、乳酸桿菌發(fā)酵液、酵母發(fā)酵液按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述體積比配制而成枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 15～30v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 10～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 30～40v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液 15～35v％。
12.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其制粒飼料專用型液劑為將芽孢桿菌發(fā)酵液、乳酸桿菌發(fā)酵液、酵母發(fā)酵液按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用滅菌水將活菌含量分別稀釋到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述體積比配制而成枯草芽孢桿菌發(fā)酵液 30～40v％；蠟狀芽孢桿菌發(fā)酵液 20～30v％；乳酸桿菌發(fā)酵液 20～30v％；釀酒酵母菌發(fā)酵液 10～20v％。
13.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其通用型粉劑為將芽孢桿菌干粉、乳酸桿菌干粉按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成枯草芽孢桿菌干粉 10～30wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 10～30wt％；乳酸桿菌干粉 30～50wt％；釀酒酵母菌干粉 10～30wt％。
14.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其幼齡動(dòng)物專用型粉劑為將芽孢桿菌干粉、乳酸桿菌干粉按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成枯草芽孢桿菌干粉10～20wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉10～20wt％；乳酸桿菌干粉40～60wt％；釀酒酵母菌干粉 15～25wt％。
15.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其中大齡動(dòng)物專用型粉劑為將芽孢桿菌干粉、乳酸桿菌干粉按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成枯草芽孢桿菌干粉20～40wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉 15～30wt％；乳酸桿菌干粉20～40wt％；釀酒酵母菌干粉10～25wt％。
16.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其反芻動(dòng)物專用型粉劑為將芽孢桿菌干粉、乳酸桿菌干粉按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成枯草芽孢桿菌干粉15～30wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉10～30wt％；乳酸桿菌干粉30～40wt％；釀酒酵母菌干粉 15～35wt％。
17.如權(quán)利要求1所述的微生物添加劑，其制粒飼料專用型粉劑為將芽孢桿菌干粉、乳酸桿菌干粉按照各自的平板培養(yǎng)復(fù)壯所用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)干粉的活菌含量進(jìn)行常規(guī)平板計(jì)數(shù)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，利用載體將活菌含量分別稀釋到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的載體配比為輕質(zhì)CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成枯草芽孢桿菌干粉30～40wt％；蠟狀芽孢桿菌干粉20～30wt％；乳酸桿菌干粉20～30wt％；釀酒酵母菌干粉 10～20wt％。
18.一種權(quán)利要求1所述的微生物飼料添加劑用作抗生素替代品或產(chǎn)酶益生素的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物飼料添加劑，具體地說(shuō)是涉及一種由多種有益微生物和其代謝產(chǎn)物(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等)組成的微生物飼料添加劑，及其制備方法和用途。該微生物飼料添加劑為將枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸桿菌和釀酒酵母菌分別進(jìn)行液體深層高密度發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液或干粉的混合物，并根據(jù)實(shí)際用途將其混合而成通用型、幼齡動(dòng)物專用型、中大齡動(dòng)物專用型、反芻動(dòng)物(牛羊等)專用型、制粒飼料專用型的液劑或粉劑。該微生物飼料添加劑的活菌含量高、產(chǎn)品保存時(shí)間長(zhǎng)、雜菌污染少、能提高飼料利用效率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增加肉蛋奶等產(chǎn)量，改善腸道菌群或酶的平衡，提高免疫力和抗病力，替代抗生素等，改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)。
文檔編號(hào)A23K1/16GK1682599SQ20041003119
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者張日俊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)