專利名稱：酶底物,合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的一族酶底物及其用途，特別是檢測(cè)微生物的用途。
細(xì)菌的檢測(cè)和鑒定在藥物或食品工業(yè)中是非常重要的，因?yàn)橐阎@種生物體不僅證明是病原體，而且也造成某些類型的污染。
最近為此目的開發(fā)的方法利用有色或熒光化合物的應(yīng)用，并且例如在M.Manafi等人的綜述“微生物學(xué)綜述”(Microbiological Reviews)55(3)，pp.335-348，1991或者更近一些時(shí)候M.Manafi的De Ware(n)Chemicus，28，pp.12-17，1998中已經(jīng)描述的這些化合物的應(yīng)用。
一般能夠分為四組化合物-熒光標(biāo)記物，例如吖啶橙，該標(biāo)記物吸附到微生物細(xì)胞的核酸上或者蛋白質(zhì)上時(shí)，其產(chǎn)生熒光的增強(qiáng)；-pH-依賴性指示劑，例如吖啶或者7-羥基香豆素，其強(qiáng)度或顏色范圍或熒光根據(jù)pH而不同，因此根據(jù)微生物的生物化學(xué)活性而不同；-對(duì)介質(zhì)的氧化還原性質(zhì)敏感的化合物，例如亞甲藍(lán)，其在還原介質(zhì)的作用下產(chǎn)生顏色；-酶的有色或熒光底物，在對(duì)一種微生物或一族微生物特異性的酶存在下在水解作用下，其分別產(chǎn)生顏色或熒光。
在后一種類中已經(jīng)描述過一些特別使得檢測(cè)β-D-葡糖苷酶或者β-D-半乳糖苷酶的底物，其是微生物特別是腸桿菌科的重要的taxinomic標(biāo)記物。這些底物中，可以提到水解后產(chǎn)生黃色鄰-硝基苯酚的鄰-硝基苯基衍生物，或者熒光底物，例如熒光素的衍生物或者4-甲基7-羥基香豆素的衍生物，它們產(chǎn)生熒光標(biāo)記。這些底物相當(dāng)大的限制性是擴(kuò)散到培養(yǎng)基中的現(xiàn)象，這使得更難以區(qū)別菌落和本底噪聲。
為了解決這一問題，曾使用過其它在水解之后產(chǎn)生不溶產(chǎn)物的底物。這些底物處于細(xì)菌菌落周圍而不擴(kuò)散到培養(yǎng)物載體上，這有利于實(shí)驗(yàn)的說明。
在這些底物中，已經(jīng)開發(fā)了3-吲哚氧基衍生物(參見例如Kodaka等，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin Microbiol.)33，p.199-201，1995或者專利US5358854和US5364767)或者6，7-二羥基香豆素衍生物(參見例如WO97/41138)。首先，困難的合成大大提高了費(fèi)用，限制大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的發(fā)展，另外，這些底物對(duì)培養(yǎng)基溫育條件敏感。第二，為了發(fā)生顏色反應(yīng)而向培養(yǎng)基中加入鐵-基復(fù)合物試劑的必要性對(duì)于某些微生物是一個(gè)問題，因?yàn)槠淇梢愿蓴_它們的代謝，特別是干擾所研究的微生物。
本發(fā)明描述了沒有上述缺陷的新的一族酶底物，因?yàn)檫@些化合物的合成操作簡(jiǎn)單，這些底物在水解之后不溶解，它們不擴(kuò)散到培養(yǎng)基中并且它們不需要加入復(fù)合物試劑例如鐵或者任何特殊的氧化還原條件。
本發(fā)明的一個(gè)目的是描述一類通式(I)的化合物 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或?qū)ξ蝗〈?，?dāng)X代表碳原子時(shí)，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解。
本發(fā)明中感興趣的酶是其存在提供了檢測(cè)和/或鑒定和/或定量一種或多種微生物或者分析物的信息的酶，例如蛋白質(zhì)，肽或核酸。特別地，所述酶來自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙?；?β-氨基葡糖苷酶或者N-乙酰基-β-氨基半乳糖苷酶，或者來自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。優(yōu)選地，所述酶來自osidases家族，例如β-D-葡糖苷酶，β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶，或者來自硫酸酯酶家族，磷酸酯酶家族或酯酶家族。
選擇R基團(tuán)作為要檢測(cè)的酶的官能團(tuán)。R是例如α-或β-糖型殘基，例如木糖，葡萄糖，半乳糖，葡糖醛酸或氨基葡糖的衍生物，或者磷酸根，硫酸根，或者其中R6是具有1-16個(gè)碳原子的烷基的羧酸根(R6COO-)，核苷酸或肽。優(yōu)選地，R基團(tuán)是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，β-D-葡糖醛酸根，磷酸根，硫酸根或乙酸根。
當(dāng)R1和R2一起代表稠合的苯環(huán)時(shí)，是下面的結(jié)構(gòu)(Ia)，其表明R1和R2拓展的結(jié)構(gòu)式 當(dāng)Y和Z一起代表醚鍵時(shí)，是指通式(Ib)中代表的鍵 當(dāng)Y和Z一起代表硫醚鍵時(shí)，是指通式(Ic)中代表的鍵 當(dāng)Y和Z一起代表任選被芳基或烷基取代的胺鍵時(shí)，是指通式(Id)中代表的鍵 其中A代表芳基或烷基。
下面指明的通式(II)，(III)，(IVa)，(IVb)和(IVc)中給出了通式(I)的特定底物 通式(II)，其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)。優(yōu)選地，R1和R2一起代表不被取代的稠合苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的。優(yōu)選地，R3和R4代表H，R5代表間位或?qū)ξ坏腍，NO2，CF3，CN，OCH3，F(xiàn)，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，優(yōu)選地，R5代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基，或者乙酸根或硫酸根。 通式(III)，其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)。優(yōu)選地，R1和R2一起代表不被取代的稠合苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的。優(yōu)選地，R3和R4代表H，R5代表間位或?qū)ξ坏腍，NO2，CF3，CN，OCH3，F(xiàn)，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，優(yōu)選地，R5代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
通式(IVa)，其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)。優(yōu)選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的。優(yōu)選地，R3和R4代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基或者乙酸根或硫酸根。 通式(IVb)，其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)。優(yōu)選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的。優(yōu)選地，R3和R4代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基或者乙酸根或硫酸根。 通式(IVc)，其中
A代表芳基或烷基，R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)。優(yōu)選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的。優(yōu)選地，R3和R4代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基，或者乙酸根或硫酸根。
本發(fā)明還涉及通式(I)的酶底物的合成方法，其中制備具有通式(V)的中間體 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或?qū)ξ蝗〈?dāng)X代表碳原子時(shí)，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，并且適當(dāng)?shù)乇槐Ｗo(hù)的R基團(tuán)接枝到羥基上。
特別地，通過糖基化作用，酯化作用或磷酸化作用反應(yīng)發(fā)生接枝。
在糖基化作用的情況下，有必要保護(hù)糖的羥基，例如用乙?；南鄳?yīng)的α-乙酰溴六糖衍生物獲得β-D-葡糖苷或β-D-半乳糖苷的四乙?；苌铩?br> 對(duì)于乙?；苌?，在接枝之后，在堿性試劑例如甲醇中的甲醇鈉的存在下，進(jìn)行糖的羥基的去保護(hù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員特別是通過丙酮中的氫氧化鉀的作用來選擇糖基化條件。
通過在吡啶中在冷卻條件下使通式(V)的衍生物與乙酸酐反應(yīng)來進(jìn)行有機(jī)酯例如乙酸酯的形成。通過在吡啶/二甲基甲酰胺型溶劑混合物中，任選地在催化劑例如4-二甲基氨基吡啶的存在下，反應(yīng)酰氯衍生物，進(jìn)行CH3(CH2)nCOOR型酯的形成。通過在POCl3的存在下在吡啶的存在下處理通式(V)的衍生物來進(jìn)行磷酸酯的形成。
通過在吡啶中冷卻條件下用氯磺酸處理通式(V)的衍生物來進(jìn)行硫酸酯的形成。本發(fā)明的底物，在磷酸酯和硫酸酯的情況下，是鹽的形式，例如鉀鹽或鈉鹽。
有利地，制備相應(yīng)于下面結(jié)構(gòu)式(Va)，(Vb)和(Vc)中任一個(gè)的中間體 本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)和/或鑒定和/或定量測(cè)定至少一種微生物的組合物，其含有至少一種通式(I)的酶底物和用于所述微生物的反應(yīng)介質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“反應(yīng)介質(zhì)”意指使得至少一種微生物的至少一種酶活性發(fā)生的介質(zhì)，例如培養(yǎng)基。
反應(yīng)介質(zhì)是固體，半固體或液體。術(shù)語“固體介質(zhì)”意指例如瓊脂培養(yǎng)基。瓊脂是微生物學(xué)中用于培養(yǎng)微生物的常規(guī)固體培養(yǎng)基，但是也可以使用明膠或瓊脂糖。很多制劑是可獲得的，例如哥倫比亞瓊脂，胰胨豆胨瓊脂，麥?zhǔn)檄傊?，沙氏瓊脂，本申?qǐng)人在“培養(yǎng)基技術(shù)手冊(cè)”(Livrettechnique MILIEU DE CULTURE)中描述的那些，更一般地，在微生物培養(yǎng)基手冊(cè)(Handbook of Microbiological Media)(CRC出版)中描述的那些。
有利地，所述反應(yīng)介質(zhì)是含有2至40克/升，優(yōu)選地9至25克/升瓊脂的瓊脂培養(yǎng)基。
本發(fā)明的底物可以在寬pH范圍中使用，特別地，在pH5.5和10.0之間，并且有利地在pH6.0和8.5之間。
所述反應(yīng)介質(zhì)混合物中還可以含有一種或多種成分，例如氨基酸，蛋白胨，碳水化合物，核苷酸，礦物質(zhì)，維生素，抗生素，表面活性劑，緩沖液或者磷酸的銨鹽，鈉鹽或金屬鹽。培養(yǎng)基的例子描述于本申請(qǐng)人的下面的專利，EP0656421或WO99/09207。
本發(fā)明的另一方面，所述反應(yīng)介質(zhì)含有至少兩種酶底物來自本發(fā)明一族的第一酶底物和至少一種來自本發(fā)明一族的另一種酶底物和/或來自其它底物家族的另一種酶底物。其他底物的酶解產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，其與第一底物產(chǎn)生的信號(hào)不同，例如不同的有色或熒光產(chǎn)品，以便能夠證明例如一種或多種微生物的檢測(cè)和/或鑒定和/或定量測(cè)定。
舉例來說，可以提到下面的組合-對(duì)于尿樣品的培養(yǎng)基的根據(jù)本發(fā)明的β-葡糖醛酸酶底物和X-β-D-葡糖苷(X是5-溴-4-氯-3-吲哚基)(CPS ID2型，bioMerieuz，Marcyl’Etoile，法國)；-對(duì)于尿樣品的培養(yǎng)基的根據(jù)本發(fā)明的β-半乳糖苷酶底物和X-β-D-葡糖苷(法國巴黎CHROMagar公司出售的CHROMagar型定向(商標(biāo))，或者英國Hamspshire OXOID公司出售的Oxoid UTI)；-對(duì)于大腸埃希氏桿菌和大腸桿菌類的培養(yǎng)基的根據(jù)本發(fā)明的β-葡糖醛酸酶底物和X-β-D-半乳糖苷(Coli ID型，bioMerieuz，Marcyl’Etoile，法國)；舉例來說，對(duì)于酵母和鑒定白色假絲酵母，可以使用根據(jù)本發(fā)明的氨基己糖苷酶底物。
根據(jù)本發(fā)明的底物可以加給bioMerieuz(Marcy l’Etoile，法國)出售的并且包括它們的酶底物的全部或部分的介質(zhì)CSP ID2，SM ID，Albicans ID2，Coli ID和0157H7 ID，還可以加給含有七葉苷例如膽汁七葉苷瓊脂并且有或沒有選擇性試劑的介質(zhì)。
反應(yīng)介質(zhì)中酶底物的濃度在0.02和1克/升之間，有利地在0.03和0.30克/升之間，優(yōu)選地在0.04和0.10克/升之間。
本發(fā)明還涉及包括如上定義的組合物和用于反應(yīng)介質(zhì)的容器的診斷試劑盒。術(shù)語“容器”意指任何固體載體，例如瓶，管，皿，微量滴定板或者用于自動(dòng)機(jī)器的消耗品，例如API濾槽或VITEK卡(商標(biāo)名，bioMerieuz，Marcy l’Etoile，法國)。
本發(fā)明的另一方面涉及在樣本中檢測(cè)和/或鑒定和/或定量測(cè)定至少一種微生物的方法，其中使來自樣本的微生物接觸含有通式(I)的酶底物的反應(yīng)介質(zhì)，并且檢測(cè)所述酶底物水解形成的有色或熒光產(chǎn)物。
通式(I)的底物具有這樣優(yōu)點(diǎn)，即它們可以獨(dú)立于大氣條件用于溫育。因此，通過溫育含有酶底物的反應(yīng)介質(zhì)，并且在控制的大氣中例如在需氧，厭氧或微需氧條件下或者在二氧化碳?xì)庀?，?yōu)選在需氧或微需氧條件下或者在二氧化碳?xì)庀?，接種至少一種微生物。
要分析的樣本是臨床樣本，例如唾液，血液，尿液或大便樣品或者任何其它樣本，其分析有助于醫(yī)生的診斷。所述樣本也可以是來自食品工業(yè)和/或制藥工業(yè)的產(chǎn)品樣本或者是食品工業(yè)和/或制藥工業(yè)的基本產(chǎn)品，需要保證不存在病原體微生物，或者需要計(jì)數(shù)污染菌叢或者檢測(cè)具體的微生物。所述樣本可以直接或者在預(yù)培養(yǎng)步驟之后，例如在食品樣品的情況下，在含有通式(I)的底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
本發(fā)明中可以鑒定，檢測(cè)或定量測(cè)定的微生物是細(xì)菌，酵母和真菌，特別是屬于下面的種或分類單位的那些腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，奈瑟氏球菌科(Nesseriaceae)，Vibrionaceae，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)；細(xì)球菌科(Micrococcaceae)，鏈球菌科(Streptococcaceae)，芽胞桿菌屬(Bacillus)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，李司忒氏菌屬(Listeria)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，加德納氏菌屬(Gardnerella)，諾卡氏菌屬(Nocardia)，念珠菌屬(Candida)，隱球菌屬(Cryptococcus)，曲霉屬(Aspergillus)，更特別地大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)，大腸埃希氏桿菌0157H7(E.coli 0157H7)，志賀氏菌屬(Shigella)，沙門氏菌屬(Salmonella)，Proteeae，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，腸球菌(Enterococcus)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeramonocytogenes)，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，酵母，例如白色假絲酵母(Candidaalbicans)，團(tuán)假絲酵母(Candida glabrata)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。這些微生物可以是需氧的，空氣厭氧的，微需氧的或厭氧的。
本發(fā)明的另一方面，酶底物用于檢測(cè)一種分析物的反應(yīng)中，其中利用了酶活性(特別是堿性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶)，例如利用ELISA型方法檢測(cè)抗體或抗原或核酸的反應(yīng)(參見例如“從理論到實(shí)踐的免疫劑量”(″les immunodosages de la théo rie àla pratique″)，并列由Barbier Y.，ACOMEN，Lyon，編著，p109-133，1988)；在證明β-半乳糖苷酶型基因的分子生物學(xué)技術(shù)中(參見例如“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”(″Molecular cloning a laboratory manual″)，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，16.56和1.85章節(jié)，1989)；用于檢測(cè)核酸(參見例如“DNA探針”"DNA probes"，第二版，Keller G.H.，Manak，M.M.，Stockton出版，5至9章節(jié)，1993)；或者在組織化學(xué)，細(xì)胞化學(xué)或者流式細(xì)胞儀技術(shù)。
下面的實(shí)施例使得有可能詳細(xì)解釋本發(fā)明的一些優(yōu)點(diǎn)但是不管怎樣不限制其范圍。
實(shí)施例1對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷，PNB-gal產(chǎn)物(1) 從Acros Organics(Geel，比利時(shí))獲得對(duì)-萘酚benzein。其它試劑從Sigma Aldrich Chimie(St Quentin Fallavier，法國)獲得。劇烈攪拌下將對(duì)-萘酚benzein(1.87毫克，5毫摩爾)溶解于20毫升丙酮。向該溶液加入1.4摩爾/升濃度的5毫升氫氧化鉀，接著加入10毫升丙酮。然后滴加5毫升水以產(chǎn)生深蘭色溶液。向該溶液加入10毫升丙酮中的10毫摩爾α-溴乙酰半乳糖(4.1克)。為了保持pH為大于11的值，在攪拌30分鐘之后第一次加入20摩爾/升的氫氧化鉀溶液2毫升并且在攪拌90分鐘之后第二次加入20摩爾/升的氫氧化鉀溶液2毫升。3.5小時(shí)之后第三次加入堿溶液，接著加入5毫升濃度和以前一樣的α-溴乙酰半乳糖丙酮溶液。4.5小時(shí)之后最后一次加入堿溶液并且將該溶液攪拌過夜。
減壓去除丙酮，0℃攪拌下將殘留溶液加給300毫升0.06摩爾/升的碳酸鈉溶液。抽真空過濾栗棕色沉淀，用水洗滌并且風(fēng)干。將該固體溶解于100毫升二氯甲烷并且用氫氧化鉀溶液在0℃下充分洗滌以去除過量對(duì)-萘酚benzein。在100毫升水中在pH11下在Dowex Marathon樹脂上，通過攪拌2-3小時(shí)，去除殘留的對(duì)-萘酚benzein。純化之后是薄層色譜，使用乙酸乙酯/甲苯(3∶1)為溶劑，用氨水展開。用無水硫酸鎂將暗黃色溶液干燥過夜，減壓蒸發(fā)，用甲醇再配制后再次蒸發(fā)以獲得一種泡沫體。將該泡沫體溶解于50毫升甲醇，并且在甲醇中使用20毫升0.4摩爾/升的甲醇鈉將產(chǎn)物去保護(hù)5小時(shí)。然后用IR120(H+)樹脂將溶液調(diào)至pH6.5并且通過靜置而分離，并且減壓去除溶劑。生成的糖苷對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(1.5克)是黃栗棕色粉末形式。
實(shí)施例2對(duì)-萘酚benzein的乙酸酯衍生物的合成將對(duì)-萘酚benzein溶解于無水吡啶之后冷卻到0℃，冷卻條件下向該溶液加入溶解于吡啶的乙酸酐(5倍摩爾過量)。室溫下24小時(shí)之后，為了分解過量的?；噭?，攪拌下滴加冷水處理溶液。抽真空過濾分離酯形式的沉淀，用乙酸洗滌并且在熱條件下在乙酸中重結(jié)晶。
實(shí)施例3對(duì)-萘酚benzein的鉀鹽形式的硫酸鹽衍生物的合成-15℃攪拌下，向冷的對(duì)-萘酚benzein的無水吡啶溶液加入1.2摩爾過量的氯磺酸。-15℃ 1小時(shí)并且室溫下30分鐘之后，減壓蒸發(fā)去除過量吡啶，通過溶解于乙醇并且用氫氧化鉀的乙醇溶液處理直到達(dá)到pH10來分解吡啶鎓鹽。真空過濾出鉀鹽并且用乙醇洗滌之后用二乙醚洗滌。
實(shí)施例48-氯-1，2-苯并-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-葡糖苷，(CBR-glu)產(chǎn)物(2)的合成 將6-亞硝基-4-氯間苯二酚(2.94克，20毫摩爾)和1，3-二羥基萘(3.20克，20毫摩爾)分別溶解于1-丁醇(30毫升)并且混合。用水浴在50℃和60℃之間加熱反應(yīng)混合物并且在攪拌下用30秒滴加硫酸(1.0克)。溶液變成深紅色并且快速形成結(jié)晶。50℃ 15分鐘和室溫下1小時(shí)之后，真空過濾產(chǎn)物并且從熱的1-丁醇中重結(jié)晶，得到2.8克8-氯-1，2-苯并-9-羥基-3-異吩噁唑酮亮深紅色結(jié)晶。
和前面對(duì)于對(duì)-萘酚benzein衍生物描述的一樣通過Koenigs-Knorr反應(yīng)制備葡糖苷衍生物(2)。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從二氯甲烷分離四乙?；Ｗo(hù)形式的葡糖苷并且使用催化量的甲醇鈉的無水甲醇溶液直接去保護(hù)。該糖苷是橘黃色粉末。
實(shí)施例58-氯-1，2-苯并-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷，(CBR-gal)產(chǎn)物(3)的合成制備該β-D-半乳糖苷衍生物(3)的方法和實(shí)施例中的描述相同，使用四乙酰化保護(hù)形式的β-D-半乳糖苷衍生物代替葡糖苷等價(jià)物。
實(shí)施例63-羥基-9-苯基-1，27，8-二苯并-6-熒光酮-β-D-半乳糖苷產(chǎn)物(4)的合成 通過在高沸點(diǎn)溶劑例如氯苯或二甲苯中，在路易斯酸例如SnCl4或ZnCl2存在下，通過在熱條件下使1，3-二羥基萘(Aldrich，14529-7)與α，α，α-三氟甲苯(Aldrich，T6370-3)縮合制備3-羥基-9-苯基-1，27，8-二苯并-6-熒光酮。路易斯酸水解并且純化中間體化合物之后，如實(shí)施例1所述制備半乳糖苷衍生物(4)。實(shí)施例6a:萘并藏花醇(9-羥基-7-苯酚-5-苯并[a]吩嗪酮)的合成 產(chǎn)物(5)保持0℃并且攪拌下，向苯酚(20克)，亞硝酸鈉(18克)和氫氧化鈉(9克)的500毫升水的溶液中緩慢加入50克硫酸和130毫升水的混合物。反應(yīng)2小時(shí)之后，收集產(chǎn)物并且用冰冷卻的水洗滌。用水重結(jié)晶之后，分離純形式的對(duì)-亞硝基苯酚產(chǎn)物(13.4克)。
將這樣制備的對(duì)-亞硝基苯酚產(chǎn)物(12.3克，0.1摩爾)還有N-苯基-2-萘胺(14.5克，0.067摩爾，Aldrich，17805-5)溶解于乙醇(400毫升)并且將該混合物冷卻到15℃。向該溶液中加入濃鹽酸(15克)。溫度自發(fā)升高，并且通過過濾分離異繞森酮產(chǎn)物(鹽酸鹽形式)并且從乙醇-水(50％-50％)混合物中重結(jié)晶。重結(jié)晶的產(chǎn)物通過首先溶解于乙醇，然后加入羥胺，以及最后將該溶液加到熱水中而可以轉(zhuǎn)化為其游離堿形式。
將溶液冷卻時(shí)游離堿(異繞森酮)以深栗棕色結(jié)晶的形式沉淀出。真空下過濾產(chǎn)生15克純產(chǎn)物。
通過在濃KOH的1-丁醇的溶液中回流異繞森酮而獲得目的產(chǎn)物(5)。通過在二氧化硅上進(jìn)行閃式層析來純化產(chǎn)物，用乙酸乙酯作為洗脫劑。
實(shí)施例6b根據(jù)和實(shí)施例1描述的相同的方法制備苯并藏花醇的半乳糖苷衍生物。
實(shí)施例7:對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(PNB-gal)檢測(cè)具有β-D-半乳糖苷酶活性的微生物的用途如下制備含有PNB-gal的固體瓊脂培養(yǎng)基向含有100毫克PNB-gal和30毫克IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的1升蒸餾水加入41克哥倫比亞瓊脂以有利于誘導(dǎo)β-半乳糖酶活性。在116℃下將瓊脂高壓滅菌10分鐘。在分布到20毫升培養(yǎng)皿中之前將培養(yǎng)基緩慢冷卻到55℃下。
從臨床和環(huán)境樣本中收集367種不同的菌株，包括303腸桿菌科并且利用API 20E圖庫(bioMerieux，法國)作為參考方法進(jìn)行鑒定。在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上在37℃下將菌株培養(yǎng)24小時(shí)，然后對(duì)于每一種菌株接種大約108微生物/毫升(等于0.5McFarland標(biāo)準(zhǔn))。使用Denley接種器，將每一種懸浮液各1微升接種到上面制備的PNB-gal培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿20個(gè)菌株。所有這些培養(yǎng)皿在37℃下溫育18小時(shí)。溫育之后，與哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)相比較，對(duì)培養(yǎng)皿檢查是否存在紫色菌落。結(jié)果在表I中給出。
表I
該表表明所述底物作為β-半乳糖苷酶活性的指示劑是非常有效的。沒有檢測(cè)到?jīng)]有β-半乳糖苷酶活性的菌株，這意味著沒有假陽性，與API20E參照方法相比，對(duì)腸桿菌科菌株的靈敏性是95.1％。
實(shí)施例8pH對(duì)對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶發(fā)揮活性的影響將培養(yǎng)基高壓滅菌之后，將46.37克/升濃度的哥倫比亞堿，0.03克/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和0.1克/升的對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷調(diào)節(jié)至各種pH(5，5-6，0-6，5-7，0-7，5-8，0-8，5)。這些各種培養(yǎng)基分布到培養(yǎng)皿中，對(duì)它們自身接種并且在三次實(shí)驗(yàn)中使用來自ATCC或NCTC型收集的0.5McFarland表征得很好的微生物的懸浮液。這些培養(yǎng)皿在37℃下溫育48小時(shí)。目測(cè)檢查24小時(shí)和48小時(shí)溫育之后形成的菌落，并且注意顏色。結(jié)果在下面的表II中給出
表II
-指沒有顏色，TI代表在培養(yǎng)皿上溫育的時(shí)間。
根據(jù)菌株和培養(yǎng)的時(shí)間，菌落的顏色隨著pH而不同，是pH的函數(shù)。一般情況下，在酸性pH下更呈橙色至棕色，在堿性pH下呈綠色至土黃色。這使得可以區(qū)分不同組的微生物，根據(jù)需要調(diào)節(jié)顏色(與其它酶底物組合，pH指示劑)或者證明幾種代謝產(chǎn)物(酶水解和pH變化)，其是PNB-gal底物的好處。
實(shí)施例9反應(yīng)介質(zhì)對(duì)對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶發(fā)揮活性的影響向哥倫比亞胰胨豆胨瓊脂(TSA)和山梨糖醇MacConkey(SMAC)介質(zhì)中加入下面的混合物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷……………………0.03克/升對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷……………….0.1克/升高壓滅菌之后，23℃下培養(yǎng)基的pH對(duì)于SMAC，TSA和哥倫比亞培養(yǎng)基分別是7.1，7.1，和7.2。這些不同的培養(yǎng)基分布在培養(yǎng)皿上，并且對(duì)它們自身接種并且在三次實(shí)驗(yàn)中使用來自ATCC或NCTC型收集的0.5McFarland表征得很好的微生物的懸浮液。這些培養(yǎng)皿在37℃下溫育48小時(shí)。目測(cè)檢查24小時(shí)和48小時(shí)溫育之后形成的菌落，并且注意顏色。結(jié)果在下面的表III中給出表III
-指沒有顏色，TI代表在培養(yǎng)皿上溫育的時(shí)間。
根據(jù)菌株和培養(yǎng)的時(shí)間，菌落的顏色隨著培養(yǎng)基而不同，是培養(yǎng)基的函數(shù)。一般情況下，在SMAC培養(yǎng)基上是橙色，在哥倫比亞培養(yǎng)基上是棕色，沒有可能將此差異與對(duì)于培養(yǎng)基的pH的顏色聯(lián)系在一起。對(duì)于SMAC培養(yǎng)基，可以將粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)與其它細(xì)菌分別開來，在另外兩種培養(yǎng)基中則不是這種情況。另外，有利地，根據(jù)給出其它顏色(例如粉色或棕色)的其它酶底物的使用，能調(diào)節(jié)用對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷獲得的菌落的顏色。
實(shí)施例10溫育大氣對(duì)對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶發(fā)揮活性的影響向下面的培養(yǎng)基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)或者對(duì)-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(PNB-gal)0.1克/升酵母提取液……………………6克/升明膠蛋白胨……………………5克/升NaCl…………………………8克/升碳酸鈉…………………………0.1克/升異丙基-β-D-硫代半乳糖苷…0.03克/升瓊脂……………………………13克/升這些不同的培養(yǎng)基分布在培養(yǎng)皿上，并且使用來自ATCC或NCTC型收集的表征得很好的微生物接種。這些培養(yǎng)皿在各種氣體下在37℃下溫育48小時(shí)需氧生活(AE)，微需氧(MAP)，厭氧生活(ANA)，CO2，通過GENbox系統(tǒng)(bioMerieuz，法國)控制周圍氣體。目測(cè)檢查24小時(shí)和48小時(shí)溫育之后形成的菌落，并且注意強(qiáng)度和顏色。結(jié)果在下面的表IV中給出
表IV
*顏色強(qiáng)度(以目測(cè)觀察為基礎(chǔ)的比例規(guī)格)；-指沒有顏色；TI代表溫育的時(shí)間。
X-Gal使得可能檢測(cè)E.faecium菌株的活性，與PNB-Gal不一樣，對(duì)于在需氧生活(大腸埃希氏桿菌，陰溝腸桿菌)下強(qiáng)水解X-Gal的菌株，PNB-Gal使可能檢測(cè)該不依賴周圍氣體并且更強(qiáng)的β-D-半乳糖苷酶活性。具體地說，在試驗(yàn)3條件下強(qiáng)度弱或非常弱，而在試驗(yàn)7條件下強(qiáng)度強(qiáng)。
實(shí)施例118-氯-1，2-苯并-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷(CBR-gal)用于檢測(cè)在固體培養(yǎng)基中具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的用途以下面的濃度將CBR-gal底物摻入哥倫比亞瓊脂中2，6，10和20毫克/100毫升，將這樣制備的培養(yǎng)基分布到培養(yǎng)皿中。用下面的微生物接種每一個(gè)培養(yǎng)皿大腸埃希氏桿菌(NCTC，10418)，肺炎克雷白氏桿菌(NCTC，10896)，雷氏普羅威登斯菌(NCTC，7475)，陰溝腸桿菌(NCTC，11936)，粘質(zhì)沙雷氏菌(NCTC，10211)，和鼠傷寒沙門氏菌(NCTC，74)。以每100毫升哥倫比亞瓊脂3毫克的濃度向所有的這些培養(yǎng)基中摻入IPTG。所有的培養(yǎng)皿都在37℃下保溫過夜。
對(duì)于β-半乳糖苷酶活性呈陽性的菌株(大腸埃希氏桿菌，肺炎克雷白氏桿菌，陰溝腸桿菌，和粘質(zhì)沙雷氏菌)在溫育過夜之后快速水解底物，給出粉色顏色，這只限于細(xì)菌菌落。所有試驗(yàn)濃度都可以區(qū)分這些物種，但是獲得清晰可見粉色顏色而沒有背景噪音的最佳濃度是大約10毫克/100毫升。對(duì)于所有試驗(yàn)濃度都沒有觀察到生長(zhǎng)的抑制作用。
實(shí)施例128-氯-1，2-苯并-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷(CBR-gal)用于檢測(cè)在液體培養(yǎng)基中具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的用途以0.5毫克/毫升至0.0078毫克/毫升不同濃度在液體培養(yǎng)基中試驗(yàn)CBR-gal底物。其中加入底物的液體反應(yīng)介質(zhì)由含有0.5％營養(yǎng)肉湯和0.5％氯化鈉的磷酸鹽緩沖液pH7.4組成。對(duì)于所有的底物濃度向介質(zhì)中加入30微升/毫升IPTG。試驗(yàn)菌株是大腸埃希氏桿菌(NCTC，10418)，肺炎克雷白氏桿菌(NCTC，10896)，雷氏普羅威登斯菌(NCTC，7475)，陰溝腸桿菌(NCTC，11936)，粘質(zhì)沙雷氏菌(NCTC，10211)，和鼠傷寒沙門氏菌(NCTC，74)，菌種為0.5McFarland。
所有具有β-半乳糖苷酶活性的菌株都隨著時(shí)間產(chǎn)生粉色顏色，如下面表V中總結(jié)的。
表V
*以小時(shí)給出的結(jié)果。-表示即使在24小時(shí)之后也沒有顏色。
權(quán)利要求
1.通式(I)的酶底物 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地在間位或?qū)ξ槐蝗〈?，?dāng)X代表碳原子時(shí)，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，R代表一個(gè)基團(tuán)，它使得O-R鍵能夠被酶水解。
2.權(quán)利要求1要求的酶底物，特征在于所述酶來自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-淀粉酶，α-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙?；?β-氨基葡糖苷酶或者N-乙?；?β-氨基半乳糖苷酶，或者來自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。
3.權(quán)利要求1和2要求的酶底物，特征在于R是α-或β-糖型殘基，優(yōu)選β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，或β-D-葡糖醛酸根或磷酸根，硫酸根或乙酸根。
4.通式(II)的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)要求的酶底物 其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，R5代表間位或?qū)ξ坏腍，NO2，CF3，CN，OCH3，F(xiàn)，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，R代表能夠使O-R鍵被酶水解的基團(tuán)。
5.權(quán)利要求4要求的酶底物，特征在于R1和R2代表稠合的苯環(huán)，R3和R4代表氫原子，R5代表氫原子，R代表α-或β-糖型殘基，優(yōu)選β-D-葡萄糖，或β-D-半乳糖，或硫酸根或乙酸根。
6.通式(III)的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)要求的酶底物 其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，R5代表間位或?qū)ξ坏腍，NO2，CF3，CN，OCH3，F(xiàn)，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，R代表能夠使O-R鍵被酶水解的一個(gè)基團(tuán)。
7.權(quán)利要求6要求的酶底物，特征在于R1和R2代表稠合的苯環(huán)，R3和R4代表氫原子，R5代表H，R代表α-或β-糖型殘基，優(yōu)選β-D-葡萄糖，或β-D-半乳糖。
8.通式(IVa)的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)要求的酶底物 其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，優(yōu)選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，優(yōu)選地，R3和R4代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解，特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
9.通式(IVb)的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)要求的酶底物 其中R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，優(yōu)選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，優(yōu)選地，R3和R4代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解，特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
10.通式(IVc)的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)要求的酶底物 其中A代表芳基或烷基，R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，優(yōu)選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，優(yōu)選地，R3和R4代表H，R代表一個(gè)基團(tuán)使得O-R鍵能夠被酶水解，特別地，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
11.權(quán)利要求8要求的酶底物，特征在于R1代表H而R2代表Cl，R3和R4代表H，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
12.權(quán)利要求10要求的酶底物，特征在于R1，R3和R4代表H，A代表苯基，R代表α-或β-糖型優(yōu)選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
13.權(quán)利要求1要求的酶底物的合成方法，特征在于制備具有通式(V)的中間體化合物，并且將合適地保護(hù)基R接枝到羥基上[sic] 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或?qū)ξ蝗〈?，?dāng)X代表碳原子時(shí)，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環(huán)，R3和R4各自獨(dú)立地代表H，Cl，F(xiàn)，I或Br，并且可以是相同或不同的。
14.權(quán)利要求13要求的方法，特征在于所述中間體化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)式(Va)
15.權(quán)利要求13要求的方法，特征在于所述中間體化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)式(Vb)
16.權(quán)利要求13要求的方法，特征在于所述中間體化合物相應(yīng)于下面的結(jié)構(gòu)式(Vc)
17.一種用于檢測(cè)和/或鑒定和/或定量測(cè)定至少一種微生物的組合物，其含有至少一種權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)要求的酶底物和適合所述微生物的反應(yīng)介質(zhì)。
18.權(quán)利要求17要求的組合物，特征在于所述組合物含有至少兩種權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)要求的底物，其酶解產(chǎn)生不同顏色和/或熒光產(chǎn)物。
19.權(quán)利要求17或18要求的組合物，特征在于其還含有另一種酶底物，其不同于權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)要求的底物，并且其酶解產(chǎn)生與權(quán)利要求17要求中使用底物酶解釋放的不同的或者與權(quán)利要求18要求中使用底物酶解釋放的不同的顏色和/或不同的熒光產(chǎn)物。
20.權(quán)利要求17，18或19要求的組合物，特征在于所述反應(yīng)介質(zhì)是固體，半固體或液體。
21.權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)要求的組合物，特征在于反應(yīng)介質(zhì)中酶底物的濃度在0.02和1克/升之間，有利地在0.03和0.30克/升之間，優(yōu)選地在0.04和0.10克/升之間。
22.包括權(quán)利要求17-21任一項(xiàng)要求的組合物和盛反應(yīng)介質(zhì)的容器的診斷試劑盒。
23.一種用于檢測(cè)和/或鑒定和/或定量測(cè)定樣本中至少一種微生物的方法，特征在于使來源于樣本的微生物接觸含有權(quán)利要求1-12中定義的酶底物以獲得接種培養(yǎng)基，并且檢測(cè)所述酶底物水解形成的有色或熒光產(chǎn)物。
24.權(quán)利要求23要求的方法，特征在于在控制的環(huán)境下例如需氧，厭氧或微需氧條件下或者在二氧化碳?xì)庀?，?yōu)選在需氧或微需氧條件下或者在二氧化碳條件下，溫育接種的反應(yīng)培養(yǎng)基。
25.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)要求的酶底物在使用酶活性的技術(shù)例如ELISA技術(shù)，所述技術(shù)中分析物是抗體，抗原或者核酸，或者其中分析物是β-半乳糖苷酶型基因的分子生物技術(shù)中檢測(cè)分析物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的通式(I)的酶底物，其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或?qū)ξ蝗〈?；?dāng)X代表碳原子時(shí)，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵；R
文檔編號(hào)C07H15/24GK1399641SQ00816190
公開日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月28日
發(fā)明者L·阿姆斯特朗, A·詹姆斯 申請(qǐng)人:比奧美希奧公司