專利名稱：利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)生菌的分離方法，具體涉及一種利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的殺滅白蟻的藥劑均為化學(xué)藥劑，故都有很大的毒副作用，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，該方法通過微生物生產(chǎn)對(duì)人畜無毒或低毒的可以抗白蟻的化合物。本發(fā)明是這樣利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌從而實(shí)現(xiàn)抗白蟻方法的(一)從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；(二)從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；(三)利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對(duì)白蟻共生菌作抑菌試驗(yàn)；(四)用對(duì)白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對(duì)白蟻進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。本發(fā)明從能抗白蟻的樹木之中分離其內(nèi)生菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)獲得其代謝產(chǎn)物，利用代謝產(chǎn)物抑制白蟻體內(nèi)有較強(qiáng)木質(zhì)素、纖維素分解能力的共生菌，進(jìn)而做白蟻的飼喂試驗(yàn)，結(jié)果證明能夠抑制白蟻共生菌的樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物也對(duì)白蟻有較好的抑制作用。本發(fā)明采用從白蟻體內(nèi)分離的有較強(qiáng)木質(zhì)素、纖維素分解能力的共生菌作為指示菌，先通過牛津杯法作抑菌試驗(yàn)檢驗(yàn)從Western Red Cedar和Port-orford-cedar中分離出內(nèi)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白蟻共生菌是否有抑制作用，進(jìn)而用對(duì)白蟻的共生菌有抑制作用的發(fā)酵產(chǎn)物浸泡濾紙片對(duì)白蟻進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。經(jīng)過白蟻的藥物飼喂試驗(yàn)，并且經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析表明試驗(yàn)組白蟻取食濾紙片的量明顯比對(duì)照組少，而實(shí)驗(yàn)組白蟻的死亡率明顯多于對(duì)照組，差異極其顯著；從白蟻的活動(dòng)情況上來看實(shí)驗(yàn)組的白蟻活動(dòng)比對(duì)照組弱，從而說明發(fā)酵液中含有能抗白蟻的化合物。對(duì)白蟻的共生菌有較好抑制作用的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)白蟻也有較好的殺滅作用，而且二者有呈線性關(guān)系的趨勢(shì)，這就為殺白蟻生物藥劑的篩選及快速檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)潔而可行的新的途徑。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式
一本實(shí)施方式是這樣利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌從而實(shí)現(xiàn)抗白蟻方法的(一)從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；(二)從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；(三)利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對(duì)白蟻共生菌作抑菌試驗(yàn)；(四)用對(duì)白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對(duì)白蟻進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。所述抗白蟻樹木為Western Red Cedar和port-orford-cedar。
具體實(shí)施例方式
二本實(shí)施方式是這樣利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌從而實(shí)現(xiàn)抗白蟻方法的一、材料的選取1、Western Red Cedar(2003年9月10日取樣于美國(guó)路易斯安納州)2、port-orford-cedar(2003年9月取樣于美國(guó)俄勒岡州)3、黑翅土白蟻(Odontotermes formosanus)(取樣于中國(guó)武漢市珞珈山)4、美國(guó)白蟻(取樣于美國(guó)路易斯安納州立大學(xué))二、培養(yǎng)基的配制(一)指示菌培養(yǎng)基1、纖維素培養(yǎng)基1.1細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na(羧甲基纖維素鈉簡(jiǎn)稱CMC)10g、NH4H2PO40.5g、K2HPO42.0g、MgSO42.0g、MnSO4·H2O2.5mg、FeSO4·7H2O7.5mg、NaCl0.3g、蛋白胨10g、瓊脂20g、水1000ml。
1.2真菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蛋白胨4g、尿素1g、瓊脂20g、水1000ml。
1.3放線菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na10g、KNO31g、NaCl0.4g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g、水1000ml。
1.4酵母菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na5g、酵母膏1g、KCl1.8g、醋酸鈉8.2g、瓊脂20g、水1000ml。
2、木質(zhì)素培養(yǎng)基2.1木質(zhì)素的制備稱取2g鋸末，用定性濾紙包好，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液(苯∶乙醇＝2∶1)，置沸水浴中抽提6小時(shí)(控制抽提液循環(huán)次數(shù)每小時(shí)4次)；抽提完后，將試樣取出風(fēng)干，轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的12～15℃含15ml 72％的濃硫酸的250ml具塞錐形瓶中，塞緊瓶塞，搖蕩1min，使試樣全部浸漬在酸液中，然后恒溫在18～20℃下保溫2.5小時(shí)，并經(jīng)常搖動(dòng)錐形瓶；保溫后轉(zhuǎn)入1000ml錐形瓶中，加345ml蒸餾水稀釋至酸濃度為3％，保持其濃度不變煮沸4小時(shí)，靜置，過濾，將濾渣烘干到恒重，即為木質(zhì)素。
2.2細(xì)菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素10g、NH4H2PO40.5g、K2HPO42.0g、MgSO42.0g、MnSO4·H2O2.5mg、FeSO4·7H2O7.5mg、NaCl0.3g、蛋白胨10g、瓊脂20g、水1000ml。
2.3真菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蛋白胨4g、尿素1g、瓊脂20g、水1000ml。
2.4放線菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素5g、KNO31g、NaCl0.4g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g、水1000ml。
2.5酵母菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素5g、酵母膏1g、KCl1.8g、醋酸鈉8.2g、瓊脂20g、水1000ml。
(二)樹木內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)基1、水瓊脂浸汁培養(yǎng)基用滅過菌的解剖刀將5g紅柏木材切成小塊，加入100ml水煮沸30min，取20ml樹木浸汁，加入15～20g瓊脂，加水至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌30min后，分裝到培養(yǎng)皿內(nèi)備用。
2、查氏培養(yǎng)基NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、瓊脂20g、水1000ml。
3、PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml、瓊脂20g。
4、S-7培養(yǎng)基葡萄糖1g、果糖3g、蔗糖6g、醋酸鈉1g、蛋白胨1g、維生素B11mg、維生素H1mg、維生素B61mg、泛酸鈣1mg、MgSO43.6mg、Ca(NO3)26.5mg、Cu(NO3)21mg、ZnSO42.5mg、MnCl25mg、FeCl32mg、苯丙氨酸5mg、苯酸鈉100mg、1mol/l的KH2PO4緩沖液1ml、水1000ml、pH自然。
(四)抑菌試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)基在平皿中傾入10ml素瓊脂，在37℃溫箱中過夜檢菌，把無菌牛津杯立在素瓊脂平板上，傾入15ml混有菌懸液的半固體培養(yǎng)基，待半固體培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子拔出牛津杯。
三、方法1、從白蟻中分離共生菌a、將從蟻巢中收集的白蟻切去頭部和胸部，腹部置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用0.1％升汞消毒1～2min或者用75％的乙醇消毒3～4min，用無菌水沖洗3次后，無菌操作將20只白蟻腹部轉(zhuǎn)入消過毒的研缽中，研磨成勻漿，勻漿作一系列的稀釋備用，與此同時(shí)，將消過毒的白蟻腹部于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板上滾動(dòng)擦拭，此平板與計(jì)數(shù)平板一起培養(yǎng)，以檢驗(yàn)白蟻表面消毒是否徹底，如果消毒不徹底，需要重新操作；b、用移液槍取0.2ml白蟻勻漿，分別加入細(xì)菌、真菌、酵母菌、放線菌的纖維素培養(yǎng)基和木質(zhì)素培養(yǎng)基平板中，用涂棒涂布均勻，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)，其它菌在28℃下培養(yǎng)；c、3～7d后上述纖維素培養(yǎng)基和木質(zhì)素培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌，用三區(qū)劃線法分離出單菌落，鑒定產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱后轉(zhuǎn)入斜面保存，從中挑選出產(chǎn)酶能力相對(duì)較高的菌株作為備用的指示菌；2、從Western Red Cedar和port-orford-cedar中分離樹木內(nèi)生菌a、用刀將樹枝切成1.0～1.5厘米的小段；b、用0.1％的升汞處理樹木小段1～4min，倒掉升汞，再用蒸餾水清洗3次除去殘留的升汞，或者用75％的乙醇處理樹木小段3～8min，再用蒸餾水清洗3次；c、把處理過的小木塊接入水瓊脂浸汁培養(yǎng)基中，3～5d分離培養(yǎng)基上的長(zhǎng)出菌；d、用三區(qū)劃線法把菌分別接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基中，分離出單菌落，然后分別把分離到的菌接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨斜面中，得到樹木內(nèi)生菌菌種，初步鑒定分為細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母菌四大類。
3、牛津杯法作抑菌試驗(yàn)
a、發(fā)酵液的制備將分離純化所得的樹木內(nèi)生菌菌種分別接種到相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、100r/min的條件下細(xì)菌培養(yǎng)2～3d，其他菌培養(yǎng)5～6d；將培養(yǎng)液以3500r/min離心分離10～15min，取上清液，傾入無菌錐形瓶，在無菌條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃恒溫水浴、150r/min條件下濃縮至其體積的十分之一，放入4℃冰箱中保存，作為備用的發(fā)酵液。
b、用牛津杯法作抑菌實(shí)驗(yàn)用從白蟻體內(nèi)分離到的有木質(zhì)纖維素分解能力的菌作為指示菌，取a步驟所述的發(fā)酵液作為抑菌物做抑菌實(shí)驗(yàn)制備素瓊脂平板1000ml水加20g的瓊脂，滅菌，倒平板，每個(gè)平板倒10～15ml的素瓊脂，把牛津杯立在素瓊脂平板上。
菌懸液的制備取5ml無菌水，加到指示菌(以白蟻的內(nèi)生菌為指示菌)的斜面上，在斜面上用接種環(huán)輕輕的刮擦，再用無菌移液管吸打混勻，做系列稀釋備用。
半固體培養(yǎng)基的制備分別取查氏、牛肉膏蛋白胨、馬丁氏、麥?zhǔn)?、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入0.75％的瓊脂。
取20ml半固體培養(yǎng)基加入小錐形瓶中，待冷卻至50℃時(shí)加入2ml稀釋好的菌懸液，混勻，倒入插有牛津杯的素瓊脂平板上，得到雙層培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入100μl濃縮的發(fā)酵液，在4℃冰箱中放置過夜，使發(fā)酵液充分?jǐn)U散到培養(yǎng)基中，然后細(xì)菌在37℃、其他菌在28℃下培養(yǎng)72h，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。
4.白蟻飼喂實(shí)驗(yàn)從蟻巢中取30只白蟻(25只工蟻、5只兵蟻)置于大約25℃下并保濕的容器中，把濾紙片稱重后用發(fā)酵液浸泡，陰干，稱重，給白蟻喂食。將白蟻分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組喂食用水浸泡的濾紙片，每天檢查實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組白蟻的死亡數(shù)，觀察活動(dòng)情況。計(jì)下死亡數(shù)，并清除死亡的白蟻。第八天把濾紙取出陰干秤重。
經(jīng)過白蟻的藥物飼喂試驗(yàn)，并且對(duì)結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析表明試驗(yàn)組白蟻取食濾紙片的量明顯比對(duì)照組少，而實(shí)驗(yàn)組白蟻的死亡率明顯多于對(duì)照組，差異極其顯著；從白蟻的活動(dòng)情況上來看實(shí)驗(yàn)組的白蟻活動(dòng)比對(duì)照組弱，從而說明發(fā)酵液中含有能抗白蟻的化合物。
權(quán)利要求
1.利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于它按照下述步驟進(jìn)行(一)從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；(二)從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；(三)利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對(duì)白蟻共生菌作抑菌試驗(yàn)；(四)用對(duì)白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對(duì)白蟻進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述從白蟻中分離共生菌是這樣進(jìn)行的a、白蟻切去頭部和胸部，將腹部置于已滅菌的培養(yǎng)皿中進(jìn)行消毒后，用無菌水沖洗，無菌操作將白蟻腹部轉(zhuǎn)入消過毒的研缽中，研磨成勻漿；b、用移液槍取白蟻勻漿，分別加入細(xì)菌、真菌、酵母菌、放線菌的纖維素培養(yǎng)基和木質(zhì)素培養(yǎng)基平板中，用涂棒涂布均勻，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)，其它菌在28℃下培養(yǎng)；c、3～7d后培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌，用三區(qū)劃線法分離出單菌落，鑒定產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱后轉(zhuǎn)入斜面保存，從中挑選出指示菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述分離樹木內(nèi)生菌的方法是這樣實(shí)現(xiàn)的用刀將抗白蟻樹木的樹枝切成1.0～1.5厘米的小段，把處理過的小木塊接入水瓊脂浸汁培養(yǎng)基中，3～5d分離培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌；用三區(qū)劃線法分別把菌接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，分離出單菌落，然后分別把分離到的菌接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨斜面中，得到樹木內(nèi)生菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述采用牛津杯法作抑菌試驗(yàn)是這樣進(jìn)行的取20ml半固體培養(yǎng)基加入小錐形瓶中，待冷卻至50℃時(shí)加入2ml指示菌菌懸液，混勻，倒入插有牛津杯的素瓊脂平板上；待培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入100μl發(fā)酵液，在4℃冰箱中放置過夜，然后細(xì)菌在37℃、其它菌在28℃下培養(yǎng)72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述菌懸液是這樣制備的取5ml無菌水，加到指示菌的斜面上，在斜面上用接種環(huán)輕輕的刮擦，再用無菌移液管吸打混勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述發(fā)酵液是這樣制備的將分離純化所得的樹木內(nèi)生菌菌種分別接種到相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7液體培養(yǎng)基中，在28℃、100r/min的條件下細(xì)菌培養(yǎng)2～3d，真菌培養(yǎng)5～6d；將培養(yǎng)液以3500r/min離心分離10～15min，取上清液，傾入無菌錐形瓶，在無菌條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃恒溫水浴、150r/min條件下濃縮至其體積的十分之一，放入4℃冰箱中保存，作為備用的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于半固體培養(yǎng)基是這樣制備的分別取查氏、牛肉膏蛋白胨、馬丁氏、麥?zhǔn)?、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入0.75％的瓊脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述素瓊脂平板是這樣制備的1000ml水加20g的瓊脂，滅菌，倒平板，每個(gè)平板倒10～15ml的素瓊脂，把牛津杯立在素瓊脂平板上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述抗白蟻樹木為Western Red Cedar和port-orford-cedar。
全文摘要
利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，它涉及一種利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法。本發(fā)明是這樣進(jìn)行的從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對(duì)白蟻共生菌作抑菌試驗(yàn)；用對(duì)白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對(duì)白蟻進(jìn)行飼喂試驗(yàn)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析表明試驗(yàn)組白蟻取食濾紙片的量明顯比對(duì)照組少，而實(shí)驗(yàn)組白蟻的死亡率明顯多于對(duì)照組，差異極其顯著；從白蟻的活動(dòng)情況上來看實(shí)驗(yàn)組的白蟻活動(dòng)比對(duì)照組弱，從而說明發(fā)酵液中含有能抗白蟻的化合物。
文檔編號(hào)A01G23/00GK1608431SQ20041004408
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者周東坡, 平文祥, 許中允, 李強(qiáng), 劉軍, 周剛, 韓雅紅, 蘇泊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)