專利名稱：牡丹組織培養(yǎng)技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中國傳統(tǒng)名花牡丹的組織培養(yǎng)繁育苗木的方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種牡丹外植體表面消毒的表面消毒劑；建立牡丹無菌培養(yǎng)體系的起始培養(yǎng)基，不定芽擴繁的增殖培養(yǎng)基；不定芽生根成苗的生根培養(yǎng)基；試管苗從試管向田間條件移栽過渡的誘導劑；苗木無土栽培基質(zhì)；以及利用表面消毒劑、培養(yǎng)基、移栽誘導劑、無土栽培基質(zhì)繁育觀賞牡丹的工藝、條件和步驟。
背景技術：
牡丹是中國傳統(tǒng)名花，以其雍容華貴被尊為“百花之王”，明清時已是國花，在國內(nèi)外有極高盛譽。牡丹作為觀賞植物栽培從南北朝開始至今，也傳播到歐洲、日本、美國等世界上其他國家。牡丹已經(jīng)形成一種國際貿(mào)易商品。國際間的貿(mào)易往來主要是牡丹種苗，而源于中國的牡丹在國際上的貿(mào)易份額的80％被日本占領。我國生產(chǎn)的牡丹種苗沒有國際競爭力的主要原因是產(chǎn)品質(zhì)量檔次低，攜帶病原菌情況嚴重，特別是根腐病、根節(jié)線蟲病等危害嚴重。我國牡丹產(chǎn)區(qū)的花農(nóng)已經(jīng)采取化學和物理的方法積極防治但是問題還是沒有得到根本解決。為使牡丹種苗質(zhì)量提高，商品價值大幅度提升，切實可行的方法是牡丹種苗生產(chǎn)應該實現(xiàn)組織培養(yǎng)——無土栽培一體化的生產(chǎn)工藝。
牡丹繁殖最成熟的技術是嫁接和分株。這種傳統(tǒng)的繁殖方法受母株上可以利用的繁殖材料數(shù)量和質(zhì)量的限制，種苗大小、長勢等參差不齊，商品種苗質(zhì)量難以標準化控制。組織培養(yǎng)技術快速繁育苗木已經(jīng)在一些林木種苗生產(chǎn)上獲得成功。牡丹組織培養(yǎng)技術的論文于1984年首次在《科學通報》上公開發(fā)表，其后中國、英國、法國、美國、荷蘭等國的科學家先后研究過牡丹的組織培養(yǎng)快速繁育苗木的技術，但都沒有獲得生產(chǎn)上可以應用的技術體系。該技術不成熟的關鍵點主要是(1)不定芽分化率低即擴增系數(shù)小以致不具備商業(yè)開發(fā)價值；(2)試管苗生根困難，即使生根數(shù)量也非常少；(3)生根的試管苗在移栽過程中容易死亡因此成苗率非常低。研究開發(fā)牡丹組織培養(yǎng)育苗新技術將在牡丹苗木的繁育產(chǎn)量和質(zhì)量上保證國內(nèi)外需求，產(chǎn)生生態(tài)、經(jīng)濟、政治和文化的多重效益。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決牡丹組織培養(yǎng)過程中存在的技術難題，本發(fā)明提供一種能在室內(nèi)周年生產(chǎn)牡丹優(yōu)質(zhì)種苗的方法。其要點之一是提供一種適合牡丹外植體表面滅菌的消毒劑。以次氯酸鈣5％-15％或次氯酸鈉1％-5％或氯化汞0.1％為基本消毒劑，復配乙醇70％、吐溫20-80和水，有效解決牡丹外植體不容易滅菌的難題。
本發(fā)明的要點之二是提供一種牡丹組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基配方。該配方包括(1)無機物氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯，每升培養(yǎng)基分別含有15-48、1-1.25、10-25、1300-1800、3-10、1.5-5、0.03-0.2、0.05-0.15、0.02-0.08、0.04-0.2、0.01-0.05、0.01-0.05、0.03-0.08毫摩爾。(2)有機物肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖，其含量為每升培養(yǎng)基60-130、0.1-0.7、0.1-1.5、0.1-0.7、0-3、1000-4000毫克。
本發(fā)明的要點之三是提供牡丹組織培養(yǎng)不同階段添加在基本培養(yǎng)基中的植物激素種類和劑量。在不定芽誘導培養(yǎng)階段，細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤，糠基腺嘌呤，玉米素，TIBA之一的濃度為培養(yǎng)基0.1-3毫克；生長素吲哚乙酸，萘乙酸，2，4-二氯苯氧乙酸的濃度為每升培養(yǎng)基0.1-5毫克，而細胞分裂素與生長素之比大于1。不定根發(fā)生階段，細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤，糠基腺嘌呤，玉米素，TIBA之一的濃度為0.1-5毫克/升；生長素吲哚丁酸，吲哚乙酸，萘乙酸之一的濃度為0.5-10毫克/升，生長素與細胞分裂素之比大于1。
本發(fā)明的要點之四是提供一種使牡丹從試管向營養(yǎng)缽移栽的成活率提高的方法。該方法包括3個步驟，(1)誘導牡丹試管苗頂芽休眠，以脫落酸和高溫處理植株處理試管苗一定時間；(2)移栽，將牡丹試管苗根部的瓊脂在溫水中融容，浸蘸促根劑，移植到無土基質(zhì)的花盆里；(3)誘導牡丹苗木頂芽恢復生長，以赤霉素和低溫處理植株致使頂芽開綻恢復生長。
本發(fā)明的牡丹品種，可以是來自種子的實生苗、也可以是來自分株、嫁接、扦插繁殖的苗木。中原地區(qū)的牡丹(Paeonia suffruticosa Androws.)、西北地區(qū)的矮牡丹(P.suffruticosa subsp.spontanea(Rehder)S.G.Haw & L.A.Lauener)、紫斑牡丹(P.rockii T.Hong et J.J.Li)和江南地區(qū)的楊山牡丹(P.ostii T.Hong et J.X.Zhang)，以及含有這些牡丹血統(tǒng)的品種如來自日本的牡丹品種也包括在內(nèi)，其花色可以是紫、紅、粉、黃、白、綠、蘭、墨紫的品種。
具體實施例方式
實施例一楊山牡丹品種‘鳳丹’的無菌培養(yǎng)體系的建立鳳丹(Paenoia ostti T.Hong et J.X.Zhang var.Lishizhenii B.A.Shenin Acta Phytota.Sin.35(4)360-361.1997)，在10-3月份，從生長健壯的植株上采集無病蟲害、飽滿的鱗芽作為外植體，洗滌劑清潔表面污著，置入三角瓶中流水沖洗30min，轉(zhuǎn)移到超靜工作臺上，加入70％乙醇與次氯酸鈉0.15％的混合液(1∶3)，滴加10滴土溫80，滅菌3-11min，水沖洗3-4次，沖洗后的鱗芽置于培養(yǎng)皿中，吸水紙吸干表面水分，用剪刀、鑷子、解剖刀剝掉芽外部鱗片，接種在預先制備的培養(yǎng)基上，在23-28攝氏度，光照2000-3000勒克斯條件下培養(yǎng)3-10天，將沒有被污染的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到誘導培養(yǎng)基上在同樣條件下培養(yǎng)，頂芽開綻生長，一個無菌培養(yǎng)體系已經(jīng)建成。
實施例二中原牡丹品種‘紫搖臺’苗木的組織培養(yǎng)擴繁中原牡丹品種‘紫搖臺’(Paeonia suffroticosa T.Hong et J.X.Zhang var.lishizhenii B.A.Shen)在11月份采集休眠的鱗芽按實施例一所述方法建立無菌培養(yǎng)體系；將無菌的外植體轉(zhuǎn)移到增值培養(yǎng)基上培養(yǎng)，增值培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加細胞分裂素6-BA0.3-2毫克/升，生長素NAA 0-3.2毫克/升，在23-28攝氏度，光照2000-3000勒克斯條件下培養(yǎng)28天，每個培養(yǎng)物將產(chǎn)生3-6個不定芽，根據(jù)組織培養(yǎng)增值率的計算方法，每個不定芽年產(chǎn)組培苗670萬株。
實施例三牡丹品種‘鳳丹’生根試管苗從試管向田間盆缽的移栽鳳丹(Paenoia ostti T.Hong et J.X.Zhang var.Lishizhenii B.A.Shen inActa Phytota.Sin.35(4)360-361.1997)無根組培苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)25天產(chǎn)生不定根，形成牡丹生根試管苗。生根培養(yǎng)基的制作為在本說明書要點之二所述的基本培養(yǎng)基中添加細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤5毫克/升；生長素吲哚丁酸10毫克/升組成。生根試管苗向田間的移栽按以下3個步驟進行(1)在植物頂芽附近滴加脫落酸0.5-5mg/L誘導鱗芽休眠，使植株整體進入休眠狀態(tài)，該步驟也可以用26-35攝氏度的高溫處理10-25天代替化學試劑處理；(2)將已休眠的牡丹植株從試管移植到無土基質(zhì)的花盆里，澆水保證空氣相對濕度80％左右；(3)在植物頂芽附近滴加赤霉素0.5-5mg/L誘導鱗芽開綻，抽枝展葉，該步驟也可以用4攝氏度低溫處理25-35天代替化學試劑處理鱗芽。
所有組培苗均在溫室里進行從試管到田間的生態(tài)環(huán)境適應性馴化。待移植到盆里的牡丹苗的鱗芽開綻抽枝展葉，植株即已移栽成活。
權利要求
1.一種牡丹組織培養(yǎng)方法，包括a)將牡丹外植體進行無害化表面消毒處理；b)以培養(yǎng)基供給植物生長必需的最佳營養(yǎng)物質(zhì)種類和濃度；水分；離子平衡；激素種類、濃度及其比例；c)在人工控制的光照、溫度、濕度條件下無菌培養(yǎng)、移栽和馴化組培苗。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征為一種無害化的表面消毒劑，其成分為次氯酸鈣5％-15％或次氯酸鈉1％-5％或氯化汞0.1％、乙醇70％、吐溫20或吐溫80、水。
3.按照權利要求1或2的方法，其特征是乙醇與氯化物組成混合液，其比例為1∶1-3，每50毫升混合液中滴加0.2-1毫升土溫20或吐溫80。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基、植物激素、穩(wěn)定劑和凝固劑。
5.按照權利要求1或4所述的方法，其特征在于基本培養(yǎng)基含有(1)無機物，如氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯，其含量分別為每升培養(yǎng)基含有15-48、1-1.25、10-25、1300-1800、3-10、1.5-5、0.03-0.2、0.05-0.15、0.02-0.08、0.04-0.2、0.01-0.05、0.01-0.05、0.03-0.08毫摩爾。(2)有機物，如肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、蔗糖，其含量為每升培養(yǎng)基中含有60-130、0.1-0.7、0.1-1.5、0.1-0.7、0-3、1000-4000毫克。
6.按照權利要求1和4所述的方法，其特征在于植物激素由其種類、濃度和比例組成，其濃度和比例隨著培養(yǎng)物生長分化的進程適時調(diào)整。在不定芽發(fā)生階段，細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤，糠基腺嘌呤，玉米素，TIBA之一的濃度為每升培養(yǎng)基0.1-3毫克；生長素吲哚乙酸，萘乙酸，2，4-二氯苯氧乙酸之一的濃度為每升培養(yǎng)基0.1-5毫克，而細胞分裂素與生長素之比大于1。不定根發(fā)生階段，細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤，糠基腺嘌呤，玉米素，TIBA之一的濃度為0.1-5毫克/升；生長素吲哚丁酸，吲哚乙酸，萘乙酸之一的濃度為0.5-10毫克/升，生長素與細胞分裂素之比大于1。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于牡丹生根試管苗向田間移栽的過程包括三個步驟，(1)誘導植物頂芽休眠，脫落酸、高溫處理誘導試管苗進入休眠狀態(tài)；(2)移植，將休眠狀態(tài)的牡丹試管苗移植到無土基質(zhì)的花盆里；(3)誘導植物頂芽生長復蘇，GA、低溫處理誘導植株休眠芽抽枝展葉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡丹組織培養(yǎng)離體快速繁育苗木的方法。將牡丹外植體接種在一種特制的牡丹培養(yǎng)基上，人工調(diào)控環(huán)境因子的作用強度，培養(yǎng)物將以每28天為一個繼代周期在人工培養(yǎng)室指數(shù)式連續(xù)繁育苗木，根據(jù)理論計算(苗木數(shù)量＝周期增值系數(shù)(3)
文檔編號A01H4/00GK1600082SQ200410080358
公開日2005年3月30日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權日2004年9月30日
發(fā)明者羅曉芳, 王華芳 申請人:北京林業(yè)大學