專利名稱：高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法
所屬領域本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域或植物基因工程領域，尤其是一種高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法。
背景技術：
轉(zhuǎn)基因抗衰老、耐貯藏系列番茄品種的培育是由天津農(nóng)學院和中國農(nóng)業(yè)大學聯(lián)合研究和開發(fā)的項目。從1995年開始由國家自然基金資助，通過基因沉默技術獲得轉(zhuǎn)反義ACS和ACC基因耐貯藏番茄新品種T95-1、T96-2、T98-3。2001年又由天津教委資助將乙烯受體蛋白基因-反義NR基因?qū)敕勋@得抗衰老、耐貯藏新品種N2，又相繼獲得轉(zhuǎn)反義CTR1、ENT1和EIN2基因新品種F1、F2、F3。目前我們已經(jīng)獲得7個品種、28個類型；已經(jīng)進行了F1代和F2代的觀察和篩選；我們曾獲得了該轉(zhuǎn)基因品種的環(huán)境釋放。上述轉(zhuǎn)基因番茄主要表現(xiàn)出抗衰老、耐貯藏、貨架期可延長2個多月，抗逆性增強，并保持了品種原有的風味和品質(zhì)。
我國農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后損失十分驚人(損失率在20％)，其主要原因就是品種不耐貯藏、貯藏量和加工量低直接導致我國農(nóng)產(chǎn)品采后價值很低。僅我國番茄醬生產(chǎn)中加工前的經(jīng)濟損失為3774萬元。減少番茄產(chǎn)后損失，可大大提高農(nóng)民收入。
我國僅番茄的種植面積就達217千公頃，對其種子的總需求量為195噸，而種子每千克的單價為47.06美元，形成了一個充滿商機與潛力的廣闊市場。
世界上現(xiàn)有100個以上基因的50種農(nóng)作物基因工程產(chǎn)品被正式批準投入商品化生產(chǎn)。全世界轉(zhuǎn)基因作物推廣面積已經(jīng)從1996年的170萬公頃猛增至4420萬公頃。其中美國的轉(zhuǎn)基因作物種植面積最廣，達到了3030萬公頃而我國僅為50萬公頃，占1％。
所以，轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄具有質(zhì)量和價格方面的雙重趨勢。
在利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)基因研究中遇到的主要問題是如何提高轉(zhuǎn)化率。影響轉(zhuǎn)化率的因素主要有轉(zhuǎn)化所用的農(nóng)桿菌的株型、Ti質(zhì)粒的構建、外植體的再生率，篩選標記的可靠性以及轉(zhuǎn)化過程中外部環(huán)境的控制。其中前幾個因素在轉(zhuǎn)化研究確立后很難有大的調(diào)整和改變，而轉(zhuǎn)化的外部環(huán)境可以按照操作者根據(jù)實際情況和主觀需要作出較大調(diào)整。這些調(diào)整在提高轉(zhuǎn)化率上往往收效顯著，其中有報道的主要有改變農(nóng)桿菌侵染的濃度，預培養(yǎng)的時間，用化學試劑對農(nóng)桿菌和外植體進行處理等。本專利通過在番茄轉(zhuǎn)化過程中這些外部環(huán)境的改變，找出提高轉(zhuǎn)化率的有效方法和措施，從而建立一套標準的轉(zhuǎn)化體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的難題，提供一種高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法。該方法采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因工程技術，通過克隆和反義構建乙烯受體蛋白基因并轉(zhuǎn)化番茄，以此得到抗衰老、耐儲藏的番茄。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的該高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法的步驟為(1).將番茄種子消毒后播種在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，至兩片子葉長大；(2).取攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上，在搖床上培養(yǎng)；(3).馬鈴薯傷流液與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽；(4).采用IAA以及IBA與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽；(5).在含有選擇標記的分化培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化芽；(6).將該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)；(7).植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；(8).生根移栽；(9).入土栽培。
而且，所述的番茄種子消毒采用含氯離子濃度為2.8的次氯酸鈉溶液進行番茄種子消毒，消毒時間為10～20分鐘，然后用無菌水沖洗三次；接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為1-3周，培養(yǎng)的環(huán)境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX。
而且，所述的在搖床上培養(yǎng)攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上的方法是取攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上，在25～28℃溫度條件下，在搖床上以200轉(zhuǎn)/min搖擺48小時，該液體培養(yǎng)基內(nèi)添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素，待其OD值為0.6時待用。
而且，所述的馬鈴薯傷流液與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是取番茄幼嫩組織傷流液經(jīng)抽濾滅菌后分別稀釋1-5倍，與培養(yǎng)過夜地農(nóng)桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽。
而且，所述的采用IAA或IBA與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是用1-5mg/L濃度的IAA以及IBA分別與農(nóng)桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽。
而且，在含有選擇標記的分化培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化芽采用的方法是將上述處理后的外植體從菌液中取出，用無菌濾紙吸干，將子葉接種到分化培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，48小時后轉(zhuǎn)入生芽培養(yǎng)基；該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等構成；在該分化培養(yǎng)基上放一層濾紙，把該子葉放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養(yǎng)48小時取出，然后去掉濾紙，在分化培養(yǎng)基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧變青霉素；在此過程中，子葉的傷口要充分接觸培養(yǎng)基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養(yǎng)2-4周后，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽。
而且，所述的該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)的方法是將該轉(zhuǎn)化芽切下，在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，每天光照培養(yǎng)12小時；該伸長培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧變青霉素構成。
而且，所述的植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)的方法為待再生轉(zhuǎn)化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，植入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12小時；該生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧變青霉素構成。
而且，所述的生根移栽為取出再生芽，沖洗掉培養(yǎng)基，將其栽到蛭石培養(yǎng)基內(nèi)，澆MS營養(yǎng)液，保持每天3～4小時太陽光直射，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明實施例做進一步詳述本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化方法由以下步驟構成(1)番茄種子消毒后播種在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，至兩片子葉長大。
首先采用含氯離子濃度為2.8的次氯酸鈉溶液消毒番茄種子10～20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，接種到MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1-3周，培養(yǎng)的環(huán)境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX。
(2)用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌液的準備取攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上，在25～28℃溫度條件下，以200轉(zhuǎn)/min搖擺48小時，該液體培養(yǎng)基內(nèi)添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素，待其OD值為0.6時待用。
(3)馬鈴薯傷流液預處理。
取番茄幼嫩組織傷流液經(jīng)抽濾滅菌后分別稀釋1-5倍，與培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，放在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽。
(4)生長素預處理。
用1-5mg/L濃度的IAA，IBA分別與農(nóng)桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，放在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽。
(5)放在含有選擇標記的分化培養(yǎng)基上進行轉(zhuǎn)化芽的篩選。
將上述處理后的外植體從菌液中取出，用無菌濾紙吸干，將子葉接種到分化培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，48小時后轉(zhuǎn)入生芽培養(yǎng)基。該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等構成。在該分化培養(yǎng)基上放一層濾紙，把該子葉放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養(yǎng)48小時取出，然后去掉濾紙，在分化培養(yǎng)基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧變青霉素。在此過程中，子葉的傷口要充分接觸培養(yǎng)基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養(yǎng)2-4周后，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽。
(6)將該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)。
把該轉(zhuǎn)化芽切下，在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，每天光照培養(yǎng)12小時。該伸長培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧變青霉素構成。
(7).植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)待再生轉(zhuǎn)化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，植入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12小時。該生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧變青霉素構成。
(8)生根移栽。
取出再生芽，沖洗掉培養(yǎng)基，將其栽到蛭石培養(yǎng)基內(nèi)，澆MS營養(yǎng)液，保持每天3～4小時太陽光直射，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
(9)入土栽培。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是通過馬鈴薯傷流液預處理、生長素預處理、轉(zhuǎn)化芽的篩選、伸長培養(yǎng)基等步驟，使番茄的抗衰老基因—反義乙烯基因的轉(zhuǎn)化率大大提高；而且，整個轉(zhuǎn)化工藝比較簡單，成本較低，花費時間較少。
下面是本發(fā)明的主要實驗數(shù)據(jù)


權利要求
1.一種高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于該轉(zhuǎn)化方法的步驟為(1).將番茄種子消毒后播種在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，至兩片子葉長大；(2).取攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上，在搖床上培養(yǎng)；(3).馬鈴薯傷流液與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽；(4).采用IAA以及IBA與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽；(5).在含有選擇標記的分化培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化芽；(6).將該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)；(7).植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；(8).生根移栽；(9).入土栽培。
2.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的番茄種子消毒采用含氯離子濃度為2.8的次氯酸鈉溶液進行番茄種子消毒，消毒時間為10～20分鐘，然后用無菌水沖洗三次；接種到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的時間為1-3周，培養(yǎng)的環(huán)境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX。
3.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的在搖床上培養(yǎng)攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上的方法是取攜帶番茄反義乙烯基因的農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基上，在25～28℃溫度條件下，在搖床上以200轉(zhuǎn)/min搖擺48小時，該液體培養(yǎng)基內(nèi)添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素，待其OD值為0.6時待用。
4.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的馬鈴薯傷流液與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是取番茄幼嫩組織傷流液經(jīng)抽濾滅菌后分別稀釋1-5倍，與培養(yǎng)過夜地農(nóng)桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽。
5.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的采用IAA或IBA與農(nóng)桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是用1-5mg/L濃度的IAA以及IBA分別與農(nóng)桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養(yǎng)基上誘導再生芽。
6.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在含有選擇標記的分化培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化芽采用的方法是將上述處理后的外植體從菌液中取出，用無菌濾紙吸干，將子葉接種到分化培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，48小時后轉(zhuǎn)入生芽培養(yǎng)基；該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等構成；在該分化培養(yǎng)基上放一層濾紙，把該子葉放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養(yǎng)48小時取出，然后去掉濾紙，在分化培養(yǎng)基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧變青霉素；在此過程中，子葉的傷口要充分接觸培養(yǎng)基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養(yǎng)2-4周后，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽。
7.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)的方法是將該轉(zhuǎn)化芽切下，在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，每天光照培養(yǎng)12小時；該伸長培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧變青霉素構成。
8.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)的方法為待再生轉(zhuǎn)化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，植入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)12小時；該生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧變青霉素構成。
9.根據(jù)權利要求1所述的高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的生根移栽為取出再生芽，沖洗掉培養(yǎng)基，將其栽到蛭石培養(yǎng)基內(nèi)，澆MS營養(yǎng)液，保持每天3～4小時太陽光直射，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術領域或植物基因工程領域的一種高效番茄基因轉(zhuǎn)化方法。主要技術特點是該方法采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因工程技術，采用克隆和反義構建乙烯受體蛋白基因并轉(zhuǎn)化番茄，通過馬鈴薯傷流液預處理、生長素預處理、轉(zhuǎn)化芽的篩選、伸長培養(yǎng)基等步驟，使番茄的抗衰老基因—反義乙烯基因的轉(zhuǎn)化率大大提高，以此得到抗衰老、耐儲藏的番茄；而且，整個轉(zhuǎn)化工藝比較簡單，成本較低，花費時間較少。
文檔編號A01H1/00GK1871896SQ20051001357
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優(yōu)先權日2005年6月1日
發(fā)明者楊靜慧, 劉艷軍, 羅云波, 張偉玉, 楊恩芹 申請人:天津農(nóng)學院