專利名稱:番茄純合體的快速培育方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種番茄純合體的快速培育方法,用于番茄、茄子、辣椒等茄果類蔬菜新品種培育,屬于農(nóng)作物育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
番茄為嚴(yán)格的自花授粉植物,長期的人工馴化和有性雜交,使其基因背景越來越窄,一些耐逆境基因及一些不易被人們味覺感知的品質(zhì)基因已很難在其栽培種中找到,但能在其野生近緣種中找到。例如,秘魯番茄的維生素C含量為栽培番茄的100倍之多;秘魯番茄、奇士曼尼番茄、潘那利番茄、醋栗番茄都表現(xiàn)出一定的耐鹽性等。
雖說許多研究證明上述野生材料都能與栽培種通過有性雜交實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移和重組,但由于后代遺傳性狀的分離必須進(jìn)行多代自交才能獲得純系,大大延長了育種時(shí)間。通過花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株,再經(jīng)染色體自然或人工加倍能快速得到純合二倍體。這種純合二倍體在遺傳上穩(wěn)定,不易發(fā)生性狀分離,因此,通過花藥或花粉培養(yǎng)能極早穩(wěn)定分離后代、縮短育種年限(倪丕沖,我國水稻花培育種及其應(yīng)用,農(nóng)業(yè)科技通迅,1991,(5)5~6)。
在蔬菜作物中,番茄自發(fā)的單倍體植株首先被發(fā)現(xiàn),其次是石刁柏和辣椒。但由于單倍體的自然發(fā)生率極低(通常為0.002%-0.02%),因此,人為地誘導(dǎo)形成單倍體植株引起了不少研究者的關(guān)注(董艷榮,龔義勤.茄果類蔬菜花藥和花粉培養(yǎng)研究進(jìn)展.長江蔬菜,2001,530-32)。
在以往的研究中,大家習(xí)慣于通過核型分析的染色體計(jì)數(shù)來區(qū)別真假單倍體,有時(shí)會誤將花藥或花粉培養(yǎng)過程中自然加倍的純合二倍體丟棄,而忽略了培育單倍體的最終目的是為了獲得純合體這個(gè)事實(shí)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種新的番茄純合體的快速培育方法,能夠縮短育種周期,快速獲得番茄純合體。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的,本發(fā)明通過細(xì)胞學(xué)觀察后,選取適宜花藥進(jìn)行培養(yǎng),獲得培養(yǎng)苗,再用SSR(Simple Sequence Repeats,簡單序列重復(fù))分子標(biāo)記驗(yàn)證篩選出純合體。本發(fā)明方法的各個(gè)步驟如下①細(xì)胞學(xué)觀察將不同長短的番茄花藥用碘-碘化鉀染色壓片檢查花粉發(fā)育時(shí)期,以確定用于花藥培養(yǎng)所需要的適宜花藥。
②外植體的制備于晴天10:00-15:00采集6-8mm長的花蕾,置于4℃預(yù)處理2-5天。接種前將花蕾用70%酒精消毒30秒,然后用飽和的漂白粉上清液消毒5-7分鐘,然后經(jīng)無菌水沖洗3-4次。接著,在無菌條件下將花藥從花蕾取出,選取2-5mm長的花藥(其內(nèi)的花粉發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期)用于花藥培養(yǎng)。
③花藥培養(yǎng)將上述花藥接種于MS(Murashige and Skoog的基本培養(yǎng)基),附加KT(激動素)1.0mg/L,NAA(萘乙酸)0.5mg/L,蔗糖4%,瓊脂0.7%,pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃,光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1,10小時(shí)光/14小時(shí)暗的光周期。
4-8周后,當(dāng)愈傷組織大小為2-3mm時(shí),將其接種于MS培養(yǎng)基附加BA(芐基腺嘌呤)2.0mg/L,IAA(吲哚乙酸)0.2mg/L,蔗糖2%,瓊脂0.7%,pH5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃,光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1,14小時(shí)光/10小時(shí)暗的光周期。
④完整植株的獲得分化培養(yǎng)4周,當(dāng)愈傷組織分化出小植株時(shí),切取小植株,并將其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2%的生根培養(yǎng)基中,進(jìn)行生根培養(yǎng)。兩周左右獲得完整植株。
⑤SSR分子標(biāo)記檢測篩選出純合體。
因?yàn)镾SR為共顯性標(biāo)記,能夠區(qū)分純合體和雜合體。純合體的帶型應(yīng)該比雜合體(對照)少一條帶。雜合體的帶型則與對照相同。
本發(fā)明與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比,有一定優(yōu)勢在番茄上常規(guī)育種技術(shù)從F1代開始到獲得純合體需要2-3年的時(shí)間,而本發(fā)明僅需要2.5-3個(gè)月,大大縮短了育種周期;與傳統(tǒng)的核型分析相比,本發(fā)明利用SSR分子標(biāo)記檢測純合體,大大提高了檢測效率,且不會丟失自然加倍的純合二倍體。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1于晴天上午10:00,采集鮮豐‘98-7’(Lycopersicon esculentum Mill.)×奇士曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii LA166)的F1代植株上長度為6-8mm的花蕾,并將其置于4℃預(yù)處理3天。用碘-碘化鉀染色壓片確定花粉發(fā)育時(shí)期。將上述花蕾浸入70%酒精30秒,然后用10%~13%漂白粉飽和溶液表面消毒5-7分鐘,再用無菌水沖洗3-4次。在無菌條件下將花藥取出,選取2-5mm長的花藥(其內(nèi)的花粉發(fā)育時(shí)期為單核期)接種于MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖4%+瓊脂0.7%,pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃,光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1,10小時(shí)光/14小時(shí)暗的光周期。
當(dāng)愈傷組織大小為2-3mm時(shí),將其接種于MS+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖2%+瓊脂0.7%,pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃,光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1,14小時(shí)光/10小時(shí)暗的光周期。
分化培養(yǎng)28天后,愈傷組織分化出小植株時(shí),切取小植株,并將其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2%的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)2周獲得完整植株。SSR分子標(biāo)記檢測篩選出純合體基因組DNA(脫氧核糖核酸)提取和純化,參照方宣鈞等的CTAB(溴代十六烷基三甲胺)方法(方宣鈞,黃育民,陳啟鋒,等.若干水稻品種(組合)的等位酶和RAPD遺傳分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué).1999,32(2)1-8)。
SSR反應(yīng)SSR反應(yīng)體系為20~40ng左右模板DNA,MgCl2(氯化鎂)2.0mmol·L-1,dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)0.2mmol·L-1,引物0.4umol·L-1,Taq聚合酶0.65U,1×Taq Buffer(緩沖液),總體積15μl。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)具體程序?yàn)?4℃ 2分鐘;94℃ 25秒,50℃ 25秒,68℃ 25秒,35循環(huán);72℃ 8分鐘。
PCR產(chǎn)物檢測方法一擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(6%,8mol·L-1尿素,1×TBE buffer(三氨基甲烷,乙酸,乙二胺四乙酸緩沖液))分離。預(yù)電泳30分鐘后上樣,電泳時(shí)使用60W恒功率,電泳1.5~2小時(shí)。銀染顯色固定液為0.5%的冰醋酸和10%的無水乙醇混合液,固定15分鐘左右;水洗;染色液為0.2%的AgNO3(硝酸銀),染色時(shí)間為20分鐘;水洗,時(shí)間不超過10秒;顯影液為1.5%NaOH(氫氧化鈉)和0.5%甲醛;最后0.75%Na2CO3(碳酸鈉)定影。方法二擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖檢測,在紫外透射儀上觀察、拍照。
因?yàn)镾SR為共顯性標(biāo)記,能夠區(qū)分純合體和雜合體。純合體的帶型應(yīng)該比雜合體(對照)少一條帶。雜合體的帶型則與對照相同。
權(quán)利要求
1.一種番茄純合體的快速培育方法,其特征在于包括如下步驟1)將不同長短的番茄花藥用碘-碘化鉀染色壓片檢查花粉發(fā)育時(shí)期,以確定用于花藥培養(yǎng)所需要的適宜花藥;2)于晴天10:00-15:00采集6-8mm長的花蕾,置于4℃預(yù)處理2-5天,接種前將花蕾用70%酒精消毒30秒,再用飽和的漂白粉消毒5-7分鐘,然后經(jīng)無菌水沖洗,在無菌條件下將花藥從花蕾取出,選取2-5mm長的花藥用于花藥培養(yǎng),花藥內(nèi)的花粉發(fā)育時(shí)期為單核期;3)將上述花藥接種于MS培養(yǎng)基附加激動素KT1.0mg/L、萘乙酸NAA0.5mg/L、蔗糖4%、瓊脂0.7%、pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng),培養(yǎng)室的條件25±1℃,光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1,10小時(shí)光/14小時(shí)暗的光周期;4-8周后,當(dāng)愈傷組織大小為2-3mm時(shí),將其接種于MS培養(yǎng)基附加芐基腺嘌呤BA2.0mg/L、吲哚乙酸IAA0.2mg/L、蔗糖2%、瓊脂0.7%、pH5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng),培養(yǎng)室的條件25±1℃,光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1,14小時(shí)光/10小時(shí)暗的光周期;4)分化培養(yǎng)4周,當(dāng)愈傷組織分化出小植株時(shí),切取小植株,并將其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2%的生根培養(yǎng)基中,進(jìn)行生根培養(yǎng),獲得完整植株;5)SSR分子標(biāo)記檢測篩選出純合體。
全文摘要
一種番茄純合體的快速培育方法,通過細(xì)胞學(xué)觀察選取適宜花藥進(jìn)行培養(yǎng);將花藥接種于MS基本培養(yǎng)基+激動素KT+萘乙酸NAA+蔗糖+瓊脂的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng);將具有一定大小的愈傷組織接種于MS+芐基腺嘌呤BA+吲哚乙酸IAA+蔗糖+瓊脂的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng);切取分化的小植株,再接入MS+IAA+蔗糖的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),獲得完整植株;再用簡單序列重復(fù)SSR分子標(biāo)記驗(yàn)證篩選出純合體。本發(fā)明與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比,大大縮短了育種周期,利用SSR分子標(biāo)記檢測純合體可提高檢測效率,且不會丟失自然加倍的純合二倍體。
文檔編號A01G1/00GK1650697SQ20051002403
公開日2005年8月10日 申請日期2005年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日
發(fā)明者陳火英, 張建華, 劉楊, 朱麗萍, 莊天明 申請人:上海交通大學(xué)