專利名稱：一種建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域或植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)是棗樹(shù)的起源地和栽培中心，種質(zhì)資源非常豐富。冬棗(Ziziphus jujuba Mill。)是鼠李科棗屬植物，因果實(shí)成熟在寒露節(jié)后而得名。冬棗風(fēng)味獨(dú)特，產(chǎn)量高，是品質(zhì)優(yōu)良的一個(gè)鮮食栽培品種，在果樹(shù)生產(chǎn)、貿(mào)易上具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。沾化冬棗是冬棗中鮮食品質(zhì)最好的品種之一，主產(chǎn)于山東省渤海灣地區(qū)，適合在中低度鹽地生長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。然而，沾化冬棗存在果實(shí)偏小、果核大、果皮薄及耐貯性差等缺點(diǎn)，而且農(nóng)戶為追求產(chǎn)量，使用激素處理增大果實(shí)，極大的降低了沾化冬棗的優(yōu)良品質(zhì)。由于冬棗花小，雌雄蕊分離困難，落花落果嚴(yán)重，胚容易退化，到目前為止，冬棗育種工作基本上停留在田間品種選優(yōu)，周期長(zhǎng)和效率低下。
多倍化是植物進(jìn)化變異的自然現(xiàn)象，也是促進(jìn)植物發(fā)生進(jìn)化改變的重要力量(楊繼，2001)。被子植物中，約70％的種類在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生過(guò)一次或多次多倍化(Masterson，1994)，這表明多倍化可以增強(qiáng)植物的適應(yīng)性和競(jìng)爭(zhēng)力。多倍體植株在形態(tài)上多表現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官的巨大性，適應(yīng)性、抗逆性較強(qiáng)，此外次生代謝產(chǎn)物也因倍性變化而產(chǎn)生變化。對(duì)以收獲營(yíng)養(yǎng)器官為目的的果樹(shù)來(lái)說(shuō)多倍體果實(shí)在果實(shí)大小、品質(zhì)、環(huán)境的適應(yīng)性及抗逆性方面具有更大的優(yōu)勢(shì)，而且還可能表現(xiàn)無(wú)核或少核的優(yōu)異性狀，在生產(chǎn)和育種上具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值(Stanford，1983)。二倍體玫瑰香葡萄利用秋水仙素得到的四倍體植株，不僅保持了二倍體的優(yōu)良品種，而且增強(qiáng)了抗逆性，果實(shí)也顯著增大，獲得了極好的經(jīng)濟(jì)性狀(羅耀武，1995)。秋水仙素誘導(dǎo)的同源四倍體金柑表現(xiàn)大果、無(wú)或少核的多倍體性狀(李傳生和張美珍，1988)。
有性多倍化是多倍體形成的主要路線，2n配子在多倍性形成中起著極其重要的作用。對(duì)于不能產(chǎn)生2n配子或僅能產(chǎn)生SDR(second division restitution)或PMD(Post-meitotic doubling)型配子的作物，體細(xì)胞染色體加倍是進(jìn)行多倍化的理想途徑(Stanford，1983)。前人研究認(rèn)為適合染色體加倍的作物應(yīng)具備染色體數(shù)目少、收獲營(yíng)養(yǎng)體為主、異花授粉及多年生和營(yíng)養(yǎng)繁殖的特性(Dewey，1981)。自1937年Blakeslee和Avery利用秋水仙素誘導(dǎo)曼陀羅四倍體植株獲得成功以后，秋水仙素在果樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方面的得到廣泛應(yīng)用，用來(lái)改良果實(shí)性狀或誘導(dǎo)雜交親本(Preieri，2001)。沾化冬棗多倍體誘導(dǎo)技術(shù)難度較大，主要是由于目前冬棗的組培體系效率較低，植株在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢。目前關(guān)于冬棗的離體培養(yǎng)體系報(bào)道較少，王玉珍(1999)和徐華陵(2003)以冬棗的莖尖和莖段為外植體培養(yǎng)，獲得了再生植株，但繁殖效率不高。陳宗禮等(2002)以沾化冬棗葉片為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，但愈傷組織分化率僅為40％。
棗利用秋水仙素處理進(jìn)行染色體加倍的研究報(bào)道較少，嚴(yán)仁玲等(1996)用不同濃度的秋水仙素處理金絲小棗試管苗單芽莖段，促使不定芽染色體加倍，獲得了同源四倍體株系。蔣洪恩等(2004)以冬棗、臨猗梨棗和辣椒棗一年生嫁接苗為試材，以秋水仙堿為誘變劑誘導(dǎo)多倍體，但僅在臨猗梨棗中獲得一株純化的四倍體植株。
目前報(bào)道獲得的四倍體棗為金絲小棗和臨猗梨棗，是與冬棗基因型完全不同的栽培品種，而且在所用處理材料類型、秋水仙素處理程序，培養(yǎng)基種類以及激素方面都有顯著差異。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是，以冬棗莖尖和葉片為處理材料，利用離體培養(yǎng)體系，用秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍手段，建立一種冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，以選擇獲得同質(zhì)四倍體植株。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，包括①冬棗細(xì)胞旺盛分裂的莖尖和葉片培養(yǎng)；②以冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和葉片為處理材料，用秋水仙素處理進(jìn)行染色體加倍；③小苗生根和移栽；④四倍體植株的嫁接；⑤四倍體植株的特征和應(yīng)用；其中，所述的冬棗細(xì)胞旺盛分裂的莖尖和葉片培養(yǎng)是指將莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基生長(zhǎng)，將葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基生長(zhǎng)；所述秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法是將長(zhǎng)至5mm-6mm的冬棗細(xì)胞分裂旺盛的莖尖或葉片，放于含有質(zhì)量體積百分比為0.01％-0.2％的秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，在25℃±2℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)24-72小時(shí)，之后，無(wú)菌水沖洗2-3次，莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30-35天繼代一次；所述小苗生根和移栽方法是指將秋水仙素處理誘導(dǎo)后的四倍體冬棗組織培養(yǎng)苗，接種在生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根；當(dāng)根長(zhǎng)2cm-3cm時(shí)，移入砂∶蛭石的重量比為1∶1的基質(zhì)中，前6-7天蓋好封口膜，保持濕度為90％，20℃～25℃環(huán)境下，生長(zhǎng)15-20天，之后移至室外土壤中生長(zhǎng)，其間每2-3天澆一次1/2 MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽溶液，隔天澆水一次。
上述莖延伸培養(yǎng)基是指添加有1-3mg L-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；上述葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基是指添加有0.5-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.3-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的WPM固體培養(yǎng)基；上述生根培養(yǎng)基是指添加有0.1-0.5mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基；在上述培養(yǎng)基中涉及的激素濃度的優(yōu)選量，因培養(yǎng)材料的基因型不同，可在所述用量范圍內(nèi)變動(dòng)。
上述MS固體培養(yǎng)基(Murashige and Skoog)的配方是KNO31900mg L-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O0.025mg L-1，鹽酸硫胺素10.0mg L-1，鹽酸吡哆醇1.0mg L-1，煙酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0；該培養(yǎng)基主要用于冬棗莖尖培養(yǎng)和繼代。
上述WPM固體培養(yǎng)基(Woody plant medium)的配方是NH4NO3400mg L-1，CaCl2·H2O96mg L-1，Ca(NO3)2556mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，K2SO49900mg L-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1，MnSO4·H2O22.3mg L-1，H3BO36.2mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1，CuSO4·5H2O 0.25mg L-1，鹽酸硫胺素1.6mg L-1，煙酸0.5mg L-1，肌醇100.0mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0；該培養(yǎng)基主要用于冬棗葉片離體培養(yǎng)。
上述Nithsh固體培養(yǎng)基的配方是KNO3950mg L-1，NH4NO3720mg L-1，CaCl2·2H2O166mg L-1，MgSO4·7H2O 185mgL-1，KH2PO4·H2O 68mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.85mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 25mg L-1，KI 10mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，MoO30.25mg L-1，肌醇5000mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0；該培養(yǎng)基主要用于栽培苗的生根。
其中，MS液體培養(yǎng)基、WPM液體培養(yǎng)基、Nithsh液體培養(yǎng)基的配方是指不添加所述的瓊脂粉的配方；上述1/2 MS基本培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽溶液是指MS液體培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽成分含量的一半。
本發(fā)明中所述培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)均熱壓滅菌；秋水仙素過(guò)濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法中，所述冬棗是指鼠李科棗屬植物的晚熟栽培棗品種(Zizyphus jujuba Mill)。
上述冬棗優(yōu)選是沾化冬棗。
上述冬棗因在寒露節(jié)后成熟而得名，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)，是鮮食優(yōu)良棗品種。沾化冬棗是其中鮮食品質(zhì)最好的品種之一，主產(chǎn)于我省渤海灣地區(qū)。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法中，所述秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法優(yōu)選是將長(zhǎng)至5mm-6mm的冬棗細(xì)胞分裂旺盛的莖尖或葉片，放于含有質(zhì)量體積百分比為0.05％-0.1％的秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，在25℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)48-72小時(shí)，之后，無(wú)菌水沖洗2-3次，莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30天繼代一次。
上述秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法最優(yōu)選是將長(zhǎng)至5mm-6mm的冬棗細(xì)胞分裂旺盛的莖尖或葉片，放于含有質(zhì)量體積百分比為0.1％的秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，在25℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)48小時(shí)，之后，無(wú)菌水沖洗2-3次，莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30天繼代一次。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法中，所述莖延伸培養(yǎng)基優(yōu)選是指添加有1-2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2-0.4mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；所述葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基是指添加有1-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.5-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固體培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基是指添加有0.2-0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3-0.6mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基。
上述莖延伸培養(yǎng)基最優(yōu)選添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基。
上述葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基最優(yōu)選添加有1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mgL-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固體培養(yǎng)基。
在上述的秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法中，處理后植株的倍性鑒定采用流式細(xì)胞儀測(cè)定葉片DNA含量的方式，DNA含量是二倍體植株兩倍的即為四倍體植株(見(jiàn)圖1)。細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果驗(yàn)證了流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果，對(duì)照二倍體的沾化冬棗根尖染色體數(shù)為2n＝2x＝24，而四倍體沾化冬棗植株的根尖染色體數(shù)目為2n＝4x＝48(見(jiàn)圖2)。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法中，所述生根培養(yǎng)基最優(yōu)選添加有0.2mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法中，所述四倍體植株的嫁接方法優(yōu)選是，選取生長(zhǎng)健壯的四倍體組培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在沾化冬棗大樹(shù)或棗砧木上。處理中，按常規(guī)嫁接方式處理砧木和接穗的切口，嫁接口用塑料薄膜纏繞，上部用塑料袋罩住保濕，并注意遮陰。
本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法中，所述四倍體植株的特征表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)緩慢，莖粗壯，節(jié)間較短，葉形變圓，氣孔密度和大小均與二倍體植株有顯著性差異(見(jiàn)圖3)。
利用本發(fā)明涉及的建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，以冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和葉片為受體材料，采用秋水仙素處理誘導(dǎo)染色體加倍，建立了多倍體誘導(dǎo)體系，經(jīng)選擇獲得同質(zhì)四倍體植株，將在冬棗生產(chǎn)和育種上起重要作用。冬棗生長(zhǎng)點(diǎn)不經(jīng)脫分化過(guò)程直接出芽，具有基因型依賴性小、體細(xì)胞無(wú)性系變異小等優(yōu)點(diǎn)，是合適的多倍體誘導(dǎo)材料。
本發(fā)明能獲得大量的具有很強(qiáng)植株再生能力的組培苗，再生植株體細(xì)胞無(wú)性系變異小。本發(fā)明的特點(diǎn)在于1)大幅度減少基因型障礙，可誘導(dǎo)絕大多數(shù)基因型的冬棗快速產(chǎn)生大量離體莖尖；2)培養(yǎng)的冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)分裂旺盛，生長(zhǎng)速度快，適于細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)；3)取材不受季節(jié)限制；4)可以較高頻率的誘導(dǎo)同質(zhì)多倍體植株。


圖1冬棗二倍體及四倍體植株的DNA含量其中A二倍體植株葉片的DNA含量，B四倍體植株葉片的DNA含量圖2冬棗二倍體及四倍體植株的染色體數(shù)目其中A二倍體植株根尖染色體數(shù)目(2n＝2x＝24)，B四倍體植株葉片的DNA含量測(cè)定(2n＝4x＝48)圖3冬棗二倍體及四倍體植株的氣孔密度和大小其中A二倍體植株葉片氣孔密度和大??；B四倍體植株葉片氣孔密度和大小具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1沾化冬棗莖尖培養(yǎng)沾化冬棗是鮮食品質(zhì)最好的冬棗品種之一，主產(chǎn)于我省渤海灣地區(qū)。沾化冬棗休眠芽在28℃，70％濕度的恒溫培養(yǎng)箱中水培萌發(fā)。萌發(fā)的幼枝剪成單芽莖段，70％酒精殺菌30s，0.1％的升汞消毒8min，無(wú)菌水沖洗3-4次，然后接種在添加1mg L-1GA3和0.2mg L-16-BA的MS固體培養(yǎng)基上，35天繼代一次。組織培養(yǎng)苗10-15天可生長(zhǎng)2cm以上，生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞處于旺盛分裂狀態(tài)。
秋水仙素(Sigma，USA)添加在含有1mg L-1GA3和0.2mg L-1BA的MS液體培養(yǎng)基中，終濃度為0.1％。將細(xì)胞分裂旺盛的莖尖放于含有0.1％濃度秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，25℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)48h。秋水仙素處理后的莖尖，無(wú)菌水沖洗2-3次，轉(zhuǎn)入添加1mg L-1GA3和0.2mg L-16-BA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
上述MS固體培養(yǎng)基(Murashige and Skoog)的配方是KNO31900mg L-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O0.025mg L-1，鹽酸硫胺素10.0mg L-1，鹽酸吡哆醇1.0mg L-1，煙酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0。
上述Nithsh固體培養(yǎng)基的配方是KNO3950mg L-1，NH4NO3720mg L-1，CaCl2·2H2O166mg L-1，MgSO4·7H2O 185mgL-1，KH2PO4·H2O 68mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.85mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 25mg L-1，KI 10mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，MoO30.25mg L-1，肌醇5000mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0。
處理植株的倍性鑒定秋水仙素處理莖尖通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定葉片DNA含量，四倍體植株的DNA含量是二倍體植株的兩倍(見(jiàn)圖1)。細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果驗(yàn)證了流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果，對(duì)照二倍體的沾化冬棗根尖染色體數(shù)為2n＝2x＝24， 而四倍體沾化冬棗植株的根尖染色體數(shù)目為2n＝4x＝48(見(jiàn)圖2)。
四倍體植株的生根和移栽對(duì)誘導(dǎo)的四倍體沾化冬棗組培苗接種在添加0.2mg L-1IAA和0.3mg L-1IBA的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根。當(dāng)根長(zhǎng)2-3cm時(shí)，移入砂與蛭石1∶1的基質(zhì)中，開(kāi)始一周蓋好封口膜，保持濕度在90％，溫度為25℃。溫室環(huán)境下生長(zhǎng)15-16天后移至土壤中，每2-3天澆一次1/2MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽溶液，隔天澆水一次。
四倍體植株的嫁接選取生長(zhǎng)健壯的四倍體組培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在樹(shù)齡10-15的沾化冬棗大樹(shù)或棗砧木上，按常規(guī)嫁接方式處理砧木和接穗的切口，嫁接口用塑料薄膜纏繞，上部用塑料袋罩住保濕，并注意遮陰。
四倍體植株特征和應(yīng)用四倍體植株生長(zhǎng)緩慢，莖粗壯，節(jié)間較短，葉形變圓，二倍體與四倍體植株的氣孔密度和大小均有顯著性差異(見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例2具體方法如實(shí)施例1，其中，莖延伸培養(yǎng)基激素濃度為1.5mg L-1GA3和0.3mg L-16-BA，秋水仙素濃度為0.1％，處理時(shí)間為72小時(shí)，誘導(dǎo)獲得了同質(zhì)四倍體植株，生根培養(yǎng)基激素濃度為0.3mg L-1IAA和0.4mg L-1IBA。
實(shí)施例3具體方法如實(shí)施例1，其中，莖延伸培養(yǎng)基激素濃度為2mg L-1GA3和0.4mg L-16-BA，秋水仙素濃度為0.1％，處理時(shí)間為48小時(shí)，誘導(dǎo)獲得了同質(zhì)四倍體植株，生根培養(yǎng)基激素濃度為0.3mg L-1IAA和0.6mg L-1IBA。
實(shí)施例4具體方法如實(shí)施例1，莖延伸培養(yǎng)基激素濃度為1.5mg L-1GA3和0.3mg L-16-BA，秋水仙素濃度為0.1％，處理時(shí)間為24h，誘導(dǎo)獲得了同質(zhì)四倍體植株，生根培養(yǎng)基激素濃度為0.3mg L-1IAA和0.4mg L-1IBA。
實(shí)施例5具體方法如實(shí)施例1，其中，所處理材料為冬棗葉片，葉片WPM培養(yǎng)基激素濃度為1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mg L-1吲哚乙酸(IAA)。秋水仙素濃度為0.1％，處理時(shí)間為24小時(shí)，誘導(dǎo)獲得了同質(zhì)四倍體植株，生根培養(yǎng)基激素濃度為0.3mg L-1IAA和0.4mg L-1IBA。
上述WPM固體培養(yǎng)基(Woody plant medium)的配方是NH4NO3400mg L-1，CaCl2·H2O96mg L-1，Ca(NO3)2556mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，K2SO49900mg L-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1，MnSO4·H2O22.3mg L-1，H3BO36.2mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1，CuSO4·5H2O 0.25mg L-1，鹽酸硫胺素1.6mg L-1，煙酸0.5mg L-1，肌醇100.0mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0。
權(quán)利要求
1.一種建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，包括①冬棗細(xì)胞旺盛分裂的莖尖和葉片培養(yǎng)；②以冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和葉片為處理材料，用秋水仙素處理進(jìn)行染色體加倍；③小苗生根和移栽；④四倍體植株的嫁接；⑤四倍體植株的特征和應(yīng)用；其特征在于所述的冬棗細(xì)胞旺盛分裂的莖尖和葉片培養(yǎng)是指將莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基生長(zhǎng)，將葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基生長(zhǎng)；所述秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法是將長(zhǎng)至5mm-6mm的冬棗細(xì)胞分裂旺盛的莖尖或葉片，放于含有質(zhì)量體積百分比為0.01％-0.2％的秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，在25℃±2℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)24-72小時(shí)，之后，無(wú)菌水沖洗2-3次，莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30-35天繼代一次；所述小苗生根和移栽方法是指將秋水仙素處理誘導(dǎo)后的四倍體冬棗組織培養(yǎng)苗，接種在生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根；當(dāng)根長(zhǎng)2-3cm時(shí)，移入砂∶蛭石的重量比為1∶1的基質(zhì)中，前6-7天蓋好封口膜，保持濕度為90％，20℃2～25℃環(huán)境下，生長(zhǎng)15-20天，之后移至室外土壤中生長(zhǎng)，其間每2-3天澆一次1/2MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽溶液，隔天澆水一次；上述莖延伸培養(yǎng)基是指添加有1-3mg L-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；上述葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基是指添加有0.5-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.3-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的WPM固體培養(yǎng)基；上述生根培養(yǎng)基是指添加有0.1-0.5mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基；上述MS固體培養(yǎng)基的配方是KNO31900mg L-1，NH4NO31650mg L-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，鹽酸硫胺素10.0mg L-1，鹽酸吡哆醇1.0mg L-1，煙酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH 6.0；上述WPM固體培養(yǎng)基的配方是NH4NO3400mg L-1，CaCl2·H2O 96mg L-1，Ca(NO3)2556mgL-1，MgSO4·7H2O 370mg L-1，K2SO49900mg L-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1，MnSO4·H2O 22.3mg L-1，H3BO36.2mgL-1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1，CuSO4·5H2O 0.25mg L-1，鹽酸硫胺素1.6mg L-1，煙酸0.5mg L-1，肌醇100.0mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH6.0；上述Nithsh固體培養(yǎng)基的配方是KNO3950mg L-1，NH4NO3720mg L-1，CaCl2·2H2O166mg L-1，MgSO4·7H2O 185mg L-1，KH2PO4·H2O 68mg L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.85mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 25mg L-1，KI 10mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，MoO30.25mg L-1，肌醇5000mg L-1，蔗糖30g L-1，瓊脂粉6g L-1，pH6.0；其中，MS液體培養(yǎng)基、WPM液體培養(yǎng)基、Nithsh液體培養(yǎng)基的配方是指不添加所述的瓊脂粉的配方；上述1/2MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽溶液是指MS液體培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽成分含量的一半。
2.按照權(quán)利要求1所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述冬棗是指鼠李科棗屬植物晚熟的栽培品種(Zizyphus jujuba Mill)。
3.按照權(quán)利要求2所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述冬棗是沾化冬棗。
4.按照權(quán)利要求1所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法是將長(zhǎng)至5mm-6mm的冬棗細(xì)胞分裂旺盛的莖尖或葉片，放于含有質(zhì)量體積百分比為0.05-0.1％的秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，在25℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)48-72小時(shí)，之后，無(wú)菌水沖洗2-3次，莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30天繼代一次。
5.按照權(quán)利要求4所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述秋水仙素處理冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)或葉片的方法是將長(zhǎng)至5mm-6mm的冬棗細(xì)胞分裂旺盛的莖尖或葉片，放于含有質(zhì)量體積百分比為0.1％的秋水仙素的MS液體培養(yǎng)基中，在25℃黑暗條件下，100rmp搖動(dòng)48小時(shí)，之后，無(wú)菌水沖洗2-3次，莖尖轉(zhuǎn)入莖延伸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，葉片轉(zhuǎn)入葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30天繼代一次。
6.按照權(quán)利要求1、4或5所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述莖延伸培養(yǎng)基是指添加有1-2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2-0.4mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；所述葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基是指添加有1-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.5-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固體培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基是指添加有0.2-0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3-0.6mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基。
7.按照權(quán)利要求6所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述莖延伸培養(yǎng)基是指添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-16-芐基嘌呤(6-BA)和300mgL-1酪蛋白水解物的MS固體培養(yǎng)基；所述葉片誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基是指添加有1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固體培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基是指添加有0.2mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固體培養(yǎng)基。
8.按照權(quán)利要求1所述建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，其特征在于所述四倍體植株的嫁接方法是，選取生長(zhǎng)健壯的四倍體組培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在沾化冬棗大樹(shù)或棗砧木上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種建立冬棗多倍體誘導(dǎo)體系的方法，包括①冬棗細(xì)胞旺盛分裂的莖尖和葉片培養(yǎng)；②以冬棗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)和葉片為處理材料，用秋水仙素處理進(jìn)行染色體加倍；③小苗生根和移栽；④四倍體植株的嫁接；⑤四倍體植株的特征和應(yīng)用等步驟。本發(fā)明以細(xì)胞分裂旺盛的莖尖和葉片為處理材料，能有效地克服基因型制約，獲得同質(zhì)多倍體植株的效率高，對(duì)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的棗的遺傳改良有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G1/06GK1672498SQ200510043219
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月4日
發(fā)明者谷曉峰, 張舉仁, 張可煒, 楊愛(ài)芳, 尹小燕 申請(qǐng)人:山東大學(xué)