專利名稱：海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大型經(jīng)濟海藻—海帶的種質(zhì)保存技術(shù)。
背景技術(shù)：
海帶(Laminaria japonica Aresch)是中國重要的經(jīng)濟藻類，養(yǎng)殖產(chǎn)量和規(guī)模連續(xù)多年居世界首位，豐富的種質(zhì)資源是漁業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，保護和利用好海帶種質(zhì)資源將為提高海帶品種水平、實現(xiàn)海帶良種化生產(chǎn)提供重要保證，海帶生活史分兩個明顯的世代階段孢子體世代和配子體世代，配子體世代是海帶的單倍體階段，游孢子是配子體世代的開始階段，種海帶成熟后，放散游孢子，游孢子經(jīng)2小時左右的游動，或附著或懸浮形成胚孢子，胚孢子逐漸萌發(fā)成配子體。傳統(tǒng)的保種技術(shù)就是在該階段將雌配子體(female gametophyte)和雄配子體(male gametophyte)單個分離培養(yǎng)，形成無性繁殖系(clone)，通過繼代培養(yǎng)無性系的方法保存種質(zhì)。但是，這種傳統(tǒng)保存技術(shù)具有明顯的不足(1)液體培養(yǎng)是唯一的保存途徑，手段單一，限制了保存的規(guī)模和效率；(2)液體培養(yǎng)保存一般需要在半月內(nèi)更新一次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質(zhì)污染及混雜的機會；(3)采孢子前無法對種海帶進行無菌處理，整個保存過程都在有菌條件下，不能徹底杜絕微生物尤其雜藻的污染；(4)培養(yǎng)中細胞形態(tài)異常、單性生殖等現(xiàn)象時有發(fā)生，培養(yǎng)因子有待進一步優(yōu)化。因此，目前的保種技術(shù)還不能作到種質(zhì)永久保存，無法完全排除混雜、污染、變異的可能性。
藻類種質(zhì)超低溫保存的研究開始于20世紀60年代，80年代以后發(fā)展速度較快，從淡水藻類到海水藻類，從微藻類到大型藻類，從非經(jīng)濟藻類到經(jīng)濟藻類都給予了較多的關(guān)注。藻類超低溫冷凍保存的方法主要是兩步冰凍法(two-step freezing)，該方法首先在保存材料中加入抗凍保護劑，進行預(yù)凍，再將預(yù)凍過的材料投入液氮中快速冷凍，目前已成為藻類種質(zhì)冰凍保存的常規(guī)方法；超低溫冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用受到限制的主要原因在于冰凍操作程序的建立主要靠經(jīng)驗性的實驗結(jié)果，適合一種藻類的保存技術(shù)對另一種藻類可能完全不適用。超低溫兩步法凍存在大型經(jīng)濟藻類中使用的種類有紫菜和裙帶菜，有關(guān)海帶游(胚)孢子超低溫保存的方法目前仍為一個空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進已有的繼代培養(yǎng)保存無性系技術(shù)的不足而提供一種用于海帶孢子保存、可大量保存種質(zhì)材料、成活率很高的海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，其特點是該方法包括以下步驟材料處理、平衡、逐級降溫冰凍和復(fù)蘇。
材料處理是選擇孢子囊色澤呈墨綠色、表面有白色的薄膜開始脫落的海帶，剪取帶有孢子囊的葉片，用脫紙棉和消毒海水反復(fù)搽洗十余遍，置于燒杯中，倒入5-10℃低溫消毒海水，放散孢子，孢子濃度達到50/160×以上時，用300目篩絹濾出雜質(zhì)和黏液獲得孢子懸液。
平衡是將孢子懸液與消毒海水配制的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min。
凍存是將平衡后的孢子混合液裝入1.5ml凍存管中，凍存管懸吊在液氮罐內(nèi)距液面3cm處預(yù)凍30min后投入液氮，或投-20℃冰箱冷凍30min后投入液氮。
復(fù)蘇是超低溫冰凍后，將凍存管從液氮中取出，迅速移到39℃恒溫水浴中快速震蕩，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下顯著特點和積極效果本發(fā)明采用超低溫逐級冷凍保存海帶游(胚)孢子，將海帶游(胚)孢子首先進行預(yù)凍，然后投入液態(tài)氮中冷凍保存，使海帶游(胚)孢子在超低溫(-196℃)狀態(tài)下代謝完全停止，生命以靜止的形式可以在這種狀態(tài)下長期保存，解凍后又可恢復(fù)其原有的生物活性和遺傳特性，有效地解決了海帶種質(zhì)保存中污染、混雜、變異的問題而保持遺傳穩(wěn)定，可望實現(xiàn)藻類種質(zhì)的永久保存；本發(fā)明方法可以大量保護海帶種質(zhì)，改變了一個器皿只能保存一個株系的傳統(tǒng)方法，可以在一個器皿中保存一個品(種)系中的多個株系，提高了效率。本發(fā)明方法的最大特點一是可以保持品種的遺傳穩(wěn)定，二是可大量保存種質(zhì)材料，三是存活率高。與游(胚)孢子快速冷凍保存法相比存活率高，與無性系超低溫凍存相比可大量保存種質(zhì)材料，本發(fā)明保存材料的獲得受季節(jié)限制，只有在海帶成熟季節(jié)才能獲得，另外操作較游(胚)孢子快速冷凍保存法繁瑣，因此海帶游(胚)孢子超低溫快速冷凍保存法、逐級冷凍保存法以及海帶絲狀體程序降溫冷凍保存法、逐級冷凍保存法四種保存方法各有價值、有同時存在的必要。
四、具體實施方案下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1，海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，是通過材料處理、平衡、逐級冰凍保存和復(fù)蘇來實現(xiàn)的，材料處理是選擇孢子囊色澤呈墨綠色、表面有白色的薄膜開始脫落的海帶，剪取5×5cm帶有孢子囊的葉片，用脫紙棉和消毒海水反復(fù)搽洗十余遍，置于500ml燒杯中，倒入8℃低溫消毒海水，放散孢子，孢子濃度達到50/160×以上時，一般在孢子濃度在80-100/160×?xí)r，用300目篩絹濾出雜質(zhì)和黏液獲得孢子懸液；平衡是將孢子懸液與消毒海水配制的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min；凍存是將平衡后的孢子混合液裝入1.5ml凍存管(cryotubes)中，凍存管懸吊在液氮罐內(nèi)距液面3cm處預(yù)凍30min后投入液氮；復(fù)蘇是超低溫冰凍后，將凍存管從液氮中取出，迅速移到39℃恒溫水浴中快速震蕩，至最后一粒冰晶消失倒入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，超低溫凍存的時間可以根據(jù)具體情況選取，在需要復(fù)蘇的時候結(jié)束凍存即可，沒有一定的限制。
實施例2，海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，是在實施例1基礎(chǔ)上，將平衡后的孢子混合液裝入1.5ml凍存管(cryotubes)中，投入-20℃冰箱冷凍30min后投入液氮，其他與實施例1完全相同。
采用本發(fā)明方法保存的海帶游(胚)孢子，熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)活性染色法測定存活率，存活率達到55％左右。
權(quán)利要求
1.海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，其特征是該方法包括以下步驟材料處理、平衡、逐級降溫冰凍和復(fù)蘇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，其特征材料處理是選擇孢子囊色澤呈墨綠色、表面有白色的薄膜開始脫落的海帶，剪取帶有孢子囊的葉片，用脫紙棉和消毒海水反復(fù)搽洗十余遍，置于燒杯中，倒入5-10℃低溫消毒海水，放散孢子，孢子濃度達到50/160×以上時，用300目篩絹濾出雜質(zhì)和黏液獲得孢子懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，其特征平衡是將孢子懸液與消毒海水配制的20％DMSO按1∶1比例混合，在0-4℃冰箱中平衡15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，其特征凍存是將平衡后的孢子混合液裝入1.5ml凍存管中，凍存管懸吊在液氮罐內(nèi)距液面3cm處預(yù)凍30min后投入液氮，或投入-20℃冰箱冷凍30min后投入液氮。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，其特征復(fù)蘇是超低溫冰凍后，將凍存管從液氮中取出，迅速移到39℃恒溫水浴中快速震蕩，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
全文摘要
本發(fā)明本發(fā)明公開了一種海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法，該方法包括以下步驟材料處理、平衡、逐級降溫冰凍和復(fù)蘇，本發(fā)明改進已有的繼代培養(yǎng)保存無性系技術(shù)的不足，提供了一種用于海帶孢子保存、可大量保存種質(zhì)材料、成活率很高的海帶游(胚)孢子的超低溫逐級冷凍保存法。
文檔編號A01H13/00GK1742554SQ20051004420
公開日2006年3月8日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日
發(fā)明者張全勝, 曲善村, 姜廣亮, 叢義周, 李曉捷 申請人:山東東方海洋科技股份有限公司, 煙臺大學(xué)