專(zhuān)利名稱(chēng)：內(nèi)生真菌在雪蓮苗培養(yǎng)和雪蓮栽培中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)涉及兩種內(nèi)生真菌在雪蓮苗培養(yǎng)和雪蓮栽培中的應(yīng)用和對(duì)雪蓮的促生長(zhǎng)效果。

背景技術(shù)：
雪蓮屬菊科鳳毛菊屬(SaussureaDC.)植物，是我國(guó)高寒地區(qū)民間常用的一類(lèi)名貴中草，分布于我國(guó)新疆、青海、甘肅、四川、云南和西藏等省區(qū)的高寒地區(qū)，民間多用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女小腹冷痛、閉經(jīng)、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、陽(yáng)萎等癥的治療。近年來(lái)，對(duì)雪蓮的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)不斷深入，已經(jīng)發(fā)展成為一種新的抗炎鎮(zhèn)痛，終止早孕的中藥，在護(hù)膚保健、防治心血管疾病、治療風(fēng)濕疼癥、延緩衰老、抗癌和計(jì)劃生育等方面有很大的開(kāi)發(fā)利用潛力。
雪蓮生長(zhǎng)緩慢，商品需求量大，目前對(duì)雪蓮的過(guò)度采挖已經(jīng)使其藥材資源處于瀕危狀態(tài)。一直以來(lái)，對(duì)雪蓮的研究多涉及文獻(xiàn)考證、藥理、化學(xué)成分、組培及商品調(diào)查等方面，雪蓮對(duì)其特殊生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性研究方面尚無(wú)人問(wèn)津。雪蓮是一類(lèi)典型的高山植物，其生長(zhǎng)的生態(tài)條件極為嚴(yán)酷，具有溫度低、風(fēng)大、氧氣稀薄、紫外輻射強(qiáng)等特點(diǎn)。由于在低溫條件下有機(jī)物質(zhì)的分解率和礦化率低，導(dǎo)致高山地區(qū)的土壤營(yíng)養(yǎng)可利用性差，有機(jī)物質(zhì)隨海拔高度增加而相對(duì)增加，直接利用有機(jī)物質(zhì)成為高山植物的一條有效的營(yíng)養(yǎng)途徑。高山植物的根常和一些內(nèi)生、寄生真菌及老根中的腐生真菌相關(guān)聯(lián)，其中一類(lèi)有深色隔膜的內(nèi)生真菌(Dark septateendophytes，簡(jiǎn)稱(chēng)DSE真菌)可以引起寄主植物的共生反應(yīng)。目前的研究情況表明，DSE真菌可能屬于子囊菌的幾個(gè)不同的屬，在北極和高山環(huán)境中普遍存在的，且隨海拔高度的增加，DSE真菌的存在更普遍。DSE真菌具有能有效利用有機(jī)物質(zhì)的多種酶，與植物共生會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。
在對(duì)雪蓮的研究中，我們觀察到在雪蓮的根中存在DSE真菌等多種不同的內(nèi)生真菌，并對(duì)它們進(jìn)行了分離純化，然后利用內(nèi)生真菌和宿主植物共生培養(yǎng)的技術(shù)，將雪蓮與DSE真菌共生培養(yǎng)，從中篩選出對(duì)雪蓮的生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用的優(yōu)良菌株。這項(xiàng)工作對(duì)保存雪蓮種質(zhì)資源、提高藥效，開(kāi)辟雪蓮大面積栽培繁殖具有重大理論意義和應(yīng)用價(jià)值。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供雪蓮內(nèi)生真菌的培養(yǎng)方法、雪蓮無(wú)菌苗快速繁殖的方法和內(nèi)生真菌與雪蓮苗共同培養(yǎng)的方法，該方法繁殖率高，生產(chǎn)周期短，可以提高雪蓮產(chǎn)量。
本發(fā)明的另一目的在于促進(jìn)雪蓮苗的生長(zhǎng)發(fā)育，提高栽培雪蓮的抗病害能力，提高栽培雪蓮中活性成分的含量，以便大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)雪蓮，解決雪蓮藥用資源緊缺的問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是先分別培養(yǎng)內(nèi)生真菌和雪蓮苗，再將內(nèi)生真菌與雪蓮苗共生培養(yǎng)。本發(fā)明采用的兩種內(nèi)生真菌由新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar.etKir.)根中分離得到，經(jīng)鑒定為Mycocentrospora屬真菌DSE-1(Mycocentrospora sp.)和Leptodontidium屬真菌DSE-2(Leptodontidium sp.)，這兩種真菌于2005年10月28日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)分別為Mycocentrospora屬真菌DSE-1CGMCCNo.1516；Leptodontidium屬真菌DSE-2CGMCC No.1517。保藏和存活證明見(jiàn)附件。
具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟方法如下(除有特殊說(shuō)明外，本發(fā)明中所述的比例均為重量百分比) 1.內(nèi)生真菌的培養(yǎng) 將上述兩種DSE真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，分別轉(zhuǎn)接于PDA平皿中，于22-28℃恒溫培養(yǎng)15-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)制成種子菌種；種子菌種可以進(jìn)一步接入液體或固體培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)。
DSE真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量為1.5-4％；無(wú)機(jī)鹽類(lèi)成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量為1-5％。培養(yǎng)基pH5.0-6.5。三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量30-60％。培養(yǎng)基滅菌后接入上述DES真菌，種子菌種接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-15％。DSE真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘，22-26℃暗培養(yǎng)15-25天。培養(yǎng)結(jié)束后可直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用。
DSE真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有豆餅粉、富含纖維素的天然添加物和經(jīng)人工加工生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中豆餅粉的加入量為0.5-2％；富含纖維素的天然添加物可以為闊葉樹(shù)鋸末，或小麥秸，或玉米秸，或玉米芯，或闊葉樹(shù)鋸末、小麥秸、玉米秸和玉米芯四種天然物中的任意兩種或兩種以上以任意比例混合的混合物，其加入量均為20-25％；經(jīng)人工加工生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以為甘油和玉米漿，其加入量為甘油1-7％，玉米漿0.2-1％。培養(yǎng)基pH5.0-6.5。試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量50-80％。培養(yǎng)基滅菌后接入液體培養(yǎng)的DES種子菌種，接種量為培養(yǎng)容器裝量的2-10％。DSE真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為22-26℃暗培養(yǎng)，待菌絲從培養(yǎng)基頂部長(zhǎng)入底部或長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用。
2.雪蓮苗的培養(yǎng) 與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)的雪蓮苗可以是雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗和無(wú)菌叢生苗 (1)雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗的培養(yǎng)雪蓮種子經(jīng)表面消毒處理后，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，待種子萌發(fā)形成苗。
(2)雪蓮無(wú)菌叢生苗的培養(yǎng)雪蓮胚芽經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽、誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗、誘導(dǎo)叢生苗生根等步驟的處理，培育成苗。各步驟所用的培養(yǎng)基分別為 ①用于誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽的培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入6-BA1.0-3.0mg，NAA0.02-0.1mg； ②用于誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗的培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加6-BA和NAA，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入6-BA0.08-2.0mg，NAA0.1-0.3mg； ③用于誘導(dǎo)叢生苗生根的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加NAA，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入NAA0.1-0.3mg。
雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗和叢生苗培養(yǎng)中用到的MS或1/2MS基本培養(yǎng)基中要添加蔗糖、肌醇和瓊脂，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖15-35g·L-1、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g。培養(yǎng)基pH5.0-6.5。用試管或玻璃瓶等器皿培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量10-50％。苗的培養(yǎng)條件為15-26℃光照培養(yǎng)15-45天，光照強(qiáng)度1500-5000Lux，光照時(shí)間8-12小時(shí)/天。
3.雪蓮苗與內(nèi)生真菌的共生培養(yǎng) 雪蓮與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)中含有土壤、富含纖維素的天然添加物和營(yíng)養(yǎng)液，其中土壤可以為腐殖質(zhì)土，或蛭石，或腐殖質(zhì)土和蛭石以5∶1-5的比例混合的混合土壤；富含纖維素的天然添加物可以是山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹(shù)或其他雜木樹(shù)的自然落葉，用時(shí)粉碎并浸濕，碎樹(shù)葉直徑0.5-2cm，其加入量為培養(yǎng)基質(zhì)中土壤重量的2-20％；營(yíng)養(yǎng)液可以是MS液體培養(yǎng)基，或0.5-3.5％的蔗糖溶液，或水，其添加比例按重量計(jì)是土壤∶營(yíng)養(yǎng)液＝0.8-1.3∶2.5-4。
當(dāng)在玻璃容器中進(jìn)行雪蓮苗和真菌的共生培養(yǎng)時(shí)，先在玻璃容器的底部放置一層濕的碎樹(shù)葉，再在樹(shù)葉上鋪放土壤，然后加入營(yíng)養(yǎng)液，滅菌后使用。當(dāng)在栽培地、或育苗床、或煉苗地進(jìn)行雪蓮苗和真菌的共生培養(yǎng)時(shí)，先在栽培地、或育苗床、或煉苗地的基部鋪放一層濕的碎樹(shù)葉，再在樹(shù)葉上鋪放土壤，然后加入營(yíng)養(yǎng)液。在栽培地、或育苗床、或煉苗地使用的土壤，可以直接使用，或提前堆積并蓋塑料布發(fā)酵1-2個(gè)月，使其熟化殺菌后使用。
雪蓮苗和真菌共生培養(yǎng)時(shí)，上述2種內(nèi)生真菌DSE-1和DSE-2可以任選一種單獨(dú)使用，也可以共同使用。雪蓮苗可以單株或2-5株苗為一叢進(jìn)行栽培。先將液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的DSE真菌接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)的樹(shù)葉層，接種量為每株苗或每叢苗下接種固體培養(yǎng)的DSE真菌0.2-1.5g，或經(jīng)過(guò)勻漿的液體培養(yǎng)的DSE真菌0.2-1.5ml，再將雪蓮苗按株行距2-15cm×2-15cm植入共生培養(yǎng)基質(zhì)中，使苗的根能接觸到DSE真菌，用土壤把苗的根埋好。
雪蓮苗與DSE真菌的共生培養(yǎng)可以在栽培地，或育苗床，或煉苗地，或培養(yǎng)室中的玻璃器皿中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度晝/夜為15-25℃/5-18℃，光照周期8-15小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000-10000Lux?？梢栽谠耘嗟貞?yīng)用DSE真菌直接在共生培養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行雪蓮的栽培，也可以將雪蓮苗與真菌移入共生培養(yǎng)基質(zhì)中共生培養(yǎng)30-50天后，將雪蓮苗連根取出進(jìn)行移栽。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例一 1.DSE-1真菌(Mycocentrospora sp.)的培養(yǎng) 將DSE-1真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)15天，用φ5mm的打孔器在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
DSE-1液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.1％，天然物為麥麩4％(煮汁)，以上組分均按重量百分含量計(jì)算。培養(yǎng)基pH5.6，500mL三角瓶裝培養(yǎng)基250mL，121℃滅菌30分鐘，接入上述DSE-1(Mycocentrospora sp.)菌片。培養(yǎng)條件為搖床振蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘，23℃暗培養(yǎng)23天后，用勻漿機(jī)打碎菌體及發(fā)酵物備用。
2.水母雪蓮(Saussurea meduasa Maxim)無(wú)菌實(shí)生苗的培養(yǎng) 水母雪蓮種子用70％酒精消毒50秒，0.1％升汞消毒7分鐘，無(wú)菌水漂洗3次，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)。
每升(L)1/2MS固體培養(yǎng)基中要添加蔗糖25g，肌醇100mg，瓊脂8g。培養(yǎng)基pH5.6。100mL玻璃三角瓶裝量40mL，121℃滅菌20分鐘，接入上述經(jīng)表面消毒后的雪蓮種子。培養(yǎng)條件22-24℃光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。經(jīng)過(guò)1周左右的培養(yǎng)，水母雪蓮種子萌發(fā)，幼苗根單一，無(wú)分支。經(jīng)過(guò)2周左右的培養(yǎng)，幼苗具3-5片葉，根長(zhǎng)3厘米左右，即可用于共生培養(yǎng)。
3.水母雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗與DSE-1真菌的共生培養(yǎng) 水母雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗與DSE-1真菌共生的培養(yǎng)基質(zhì)組成為腐殖質(zhì)土、濕的碎櫟樹(shù)葉和MS營(yíng)養(yǎng)液，三者加入量之間的比例按重量計(jì)為腐殖質(zhì)土∶濕的碎櫟樹(shù)葉∶MS營(yíng)養(yǎng)液＝10∶1∶25。培養(yǎng)容器為玻璃三角瓶。培養(yǎng)基的制備方法為在三角瓶的底部平鋪一層濕的，直徑0.2-1cm的碎樹(shù)葉，樹(shù)葉層上鋪放腐殖質(zhì)土，然后加入MS培養(yǎng)液。培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌45分鐘。
水母雪蓮實(shí)生苗以單株植入培養(yǎng)，每瓶植入3株苗，苗間距2-3cm，成等腰三角形分布。首先將上述液體培養(yǎng)的DSE-1真菌接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)的樹(shù)葉層，每株苗接入0.4mL，再接種水母雪蓮實(shí)生苗，注意使水母雪蓮苗的根與DSE-1真菌接觸，用腐殖質(zhì)土把水母雪蓮苗的根埋好。
在培養(yǎng)室中進(jìn)行水母雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗與DSE-1真菌的共生培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度晝/夜＝25℃/18℃，光照周期12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為3000Lux。共生培養(yǎng)45天后，連根取出雪蓮苗，洗凈培養(yǎng)基質(zhì)，移栽。
實(shí)施例二 1.DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)的培養(yǎng) 將DSE-2真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于PDA平皿中，25℃恒溫培養(yǎng)20天，用φ5mm的打孔器在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
DSE-2真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖3％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸鎂0.25％，天然物為麥麩2％(煮汁)，以上組分均按重量百分含量計(jì)算。培養(yǎng)基pH5.8，500mL三角瓶裝培養(yǎng)基200mL，121℃滅菌30分鐘，接入上述DSE-2(Leptodontidium sp.)菌片。培養(yǎng)條件為搖床振蕩轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，25℃暗培養(yǎng)15天，為DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)的種子菌種。
將液體培養(yǎng)的DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)的種子菌種接入固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。DSE-2真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為豆餅粉1.5％，闊葉樹(shù)鋸末25％，甘油3％，玉米漿0.5％，以上組分均按重量百分比計(jì)算。培養(yǎng)基pH5.3。培養(yǎng)基裝在玻璃罐頭瓶中，培養(yǎng)容器裝量60-70％，121℃滅菌60分鐘，接入上述液體培養(yǎng)的DES-2種子菌種，接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-8％。培養(yǎng)條件為25-26℃靜置暗培養(yǎng)。待DSE-2真菌的菌絲從培養(yǎng)基頂部長(zhǎng)入底部或長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用。
2.新疆雪蓮(S.involucraata Kar.et Kir.)無(wú)菌叢生苗的培養(yǎng) 無(wú)菌培養(yǎng)的新疆雪蓮種子產(chǎn)生的胚芽，依次經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽、誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗、誘導(dǎo)叢生苗生根等步驟的處理，培育成苗。
誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽的培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖20g，肌醇100mg，6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.5mg，萘乙酸(NAA)0.05mg，瓊脂7g。培養(yǎng)基pH5.6。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入無(wú)菌培養(yǎng)的雪蓮胚芽。培養(yǎng)條件24℃光照培養(yǎng)40天，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間10小時(shí)/天。
誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗的培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖30g，肌醇120mg，6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，瓊脂7.5g。培養(yǎng)基pH5.8。100mL玻璃三角瓶裝量25mL，121℃滅菌20分鐘，接入雪蓮叢生芽。培養(yǎng)條件25℃光照培養(yǎng)30天，光照強(qiáng)度3000Lux，光照時(shí)間12小時(shí)/天。
誘導(dǎo)叢生苗生根的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每升(L)培養(yǎng)基加入蔗糖25g，肌醇80mg，萘乙酸(NAA)0.25mg，瓊脂7g。培養(yǎng)基pH5.7。100mL玻璃三角瓶裝量25mL，121℃滅菌20分鐘，接入雪蓮叢生苗。23℃光照培養(yǎng)15天，光照強(qiáng)度2000Lux，光照時(shí)間9小時(shí)/天。
3.新疆雪蓮無(wú)菌叢生苗與DSE-2真菌的共生培養(yǎng) 新疆雪蓮無(wú)菌叢生苗與DSE-2真菌共生的培養(yǎng)基質(zhì)組成為腐殖質(zhì)土和蛭石以5∶3的比例混合的混合土壤、濕的碎櫟樹(shù)葉和水，三者加入量之間的比例按重量計(jì)為混合土壤∶濕的碎櫟樹(shù)葉∶MS營(yíng)養(yǎng)液＝10∶1.5∶20。培養(yǎng)基的制備方法為在育苗床的基部平鋪一層濕的，直徑0.2-1cm的碎樹(shù)葉，樹(shù)葉層上鋪放腐殖質(zhì)土和蛭石的混合土壤，然后澆水。
新疆雪蓮叢生苗以3株為一叢進(jìn)行栽培，苗的株行距為10cm×10cm。首先將上述固體培養(yǎng)的DSE-2真菌接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)的樹(shù)葉層，接種量為每叢苗接入1.5g，再接種新疆雪蓮叢生苗，注意使新疆雪蓮苗的根與DSE-2真菌接觸，用混合土壤把新疆雪蓮苗的根埋好。
在大棚內(nèi)的育苗床上進(jìn)行新疆雪蓮無(wú)菌叢生苗和DSE-2真菌的共生培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度晝/夜＝18-22℃/10-14℃，光照周期9-10小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為5000-8000Lux。共生培養(yǎng)40天后，連根取出雪蓮苗移栽到大田。
比較例 1.DSE真菌對(duì)雪蓮苗生長(zhǎng)的影響 將DSE-1真菌(Mycocentrospora sp.)和DSE-2真菌(Leptodontidium sp.)分別用液體培養(yǎng)基搖床振蕩暗培養(yǎng)18天，制成種子菌種。DSE-1和DSE-2種子菌種分別接入固體培養(yǎng)基中，靜置暗培養(yǎng)。待兩種DSE真菌的菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用。
新疆雪蓮(S.involucraata Kar.et Kir.)胚芽經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)30天形成叢生芽，叢生芽經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)30天形成叢生苗，叢生苗經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)20天生根，培育成苗。
在共生培養(yǎng)基質(zhì)上，用新疆雪蓮叢生苗分別與固體培養(yǎng)的DSE-1真菌和DSE-2真菌進(jìn)行共生培養(yǎng)，考察兩種DSE真菌和對(duì)新疆雪蓮苗生長(zhǎng)的影響，以沒(méi)有接入DSE真菌的新疆雪蓮叢生苗的生長(zhǎng)情況為對(duì)照。共生培養(yǎng)在三角瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石、濕的碎櫟樹(shù)葉和水。
新疆雪蓮叢生苗以3株為一叢接入培養(yǎng)基質(zhì)中，每瓶接入3叢，苗叢間距2-3cm，在三角瓶中成等腰三角形分布。先將上述固體培養(yǎng)的兩種DSE真菌分別接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)的樹(shù)葉層，接種量為每叢苗接入1g左右，再接入新疆雪蓮叢生苗，使苗的根部與DSE真菌接觸，用蛭石把新疆雪蓮苗的根埋好。在培養(yǎng)室中進(jìn)行新疆雪蓮無(wú)菌叢生苗與DSE真菌的共生培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度晝/夜＝24℃/20℃，光照周期10小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為3000Lux。將新疆雪蓮叢生苗直接接入培養(yǎng)基質(zhì)中，按以上條件進(jìn)行光照培養(yǎng)，作為對(duì)照。
培養(yǎng)50天后，將共生培養(yǎng)和對(duì)照的新疆雪蓮苗連根取出，洗凈培養(yǎng)基質(zhì)，測(cè)量并記錄新疆雪蓮苗地上部分高度和根的數(shù)目。將新疆雪蓮苗于55℃干燥后稱(chēng)量苗的干重。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，與對(duì)照相比，新疆雪蓮苗與DSE-1真菌共生培養(yǎng)后，地上部分高度增加了85.5％，根的數(shù)目增加了337.5％，苗干重增加了63.0％；新疆雪蓮苗與DSE-2真菌共生培養(yǎng)后，地上部分高度增加了22.8％，苗干重增加了31.3％。在顯微鏡下觀察與DSE-1真菌共生培養(yǎng)的新疆雪蓮苗根部切片，觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSE-1真菌定殖于根外層衰老的表皮細(xì)胞，很少侵染內(nèi)層表皮細(xì)胞，絕對(duì)不侵染皮層細(xì)胞。在表皮細(xì)胞內(nèi)，有時(shí)真菌的菌絲緊密包裹成厚壁的圓形細(xì)胞，形成類(lèi)似于微菌核的結(jié)構(gòu)。
2.DSE-1真菌(Mycocentrospora sp.)對(duì)新疆雪蓮苗中黃酮類(lèi)成分的影響 將DSE-1真菌用液體培養(yǎng)基搖床振蕩暗培養(yǎng)22天，用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用。
新疆雪蓮胚芽經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)30天形成叢生芽，叢生芽經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)30天形成叢生苗，叢生苗經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)20天生根，培育成苗。
在共生培養(yǎng)基質(zhì)上，用新疆雪蓮叢生苗與固體培養(yǎng)的DSE-1真菌進(jìn)行共生培養(yǎng)，考察DSE-1真菌對(duì)新疆雪蓮苗中黃酮類(lèi)化合物含量的影響，以沒(méi)有接入DSE-1真菌的新疆雪蓮叢生苗的黃酮類(lèi)化合物含量為對(duì)照。共生培養(yǎng)在三角瓶中進(jìn)行，培養(yǎng)基質(zhì)為腐殖質(zhì)土、濕的碎櫟樹(shù)葉和水。
新疆雪蓮叢生苗以3株為一叢接入培養(yǎng)基質(zhì)中，每瓶接入3叢，苗叢問(wèn)距2-3cm，在三角瓶中成等腰三角形分布。先將上述固體培養(yǎng)的DSE-1真菌接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)的樹(shù)葉層，接種量為每叢苗接入1g左右，再接入新疆雪蓮叢生苗，使苗的根部與DSE-1真菌接觸，用腐殖質(zhì)土把新疆雪蓮苗的根埋好。在培養(yǎng)室中進(jìn)行新疆雪蓮無(wú)菌叢生苗與DSE-1真菌的共生培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度晝/夜＝24℃/20℃，光照周期10小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為3000Lux。將新疆雪蓮叢生苗直接接入培養(yǎng)基質(zhì)中，按以上條件進(jìn)行光照培養(yǎng)，作為對(duì)照。
培養(yǎng)40天后，將共生培養(yǎng)和對(duì)照的新疆雪蓮苗連根取出，洗凈培養(yǎng)基質(zhì)，于55℃干燥。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定新疆雪蓮苗中總黃酮的含量。測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照相比，新疆雪蓮苗與DSE-1真菌共生培養(yǎng)后，苗中總黃酮的含量增加了1.6倍。
從以上比較例可以看出，DSE真菌有促進(jìn)雪蓮苗增高和增重作用，并對(duì)雪蓮苗根的發(fā)育和形態(tài)建成有促進(jìn)作用，DSE真菌還有提高雪蓮苗中的活性成分黃酮類(lèi)化合物含量的作用。顯微鏡下觀察到的，在根的表皮細(xì)胞中DSE-1真菌形成類(lèi)似微菌核的結(jié)構(gòu)，是DSE真菌定居在植物中形成的特征性結(jié)構(gòu)，表明DSE-1真菌與雪蓮植株建立了良好的共生關(guān)系。真菌不僅可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還由于其可以產(chǎn)生抗生素類(lèi)的物質(zhì)，從而保護(hù)了宿主植物不受到致病菌的侵染。這為移栽到野外的雪蓮植株的生長(zhǎng)創(chuàng)造一個(gè)良好的微環(huán)境，提高了雪蓮苗的抗病性。可見(jiàn)該項(xiàng)新技術(shù)，不僅可以大大縮短雪蓮的生長(zhǎng)周期，提高雪蓮產(chǎn)量和質(zhì)量，還對(duì)雪蓮栽培中病害的生物防治有積極意義。
權(quán)利要求
1.一種利用內(nèi)生真菌培養(yǎng)雪蓮苗和栽培雪蓮中的方法，包括步驟
(1)內(nèi)生真菌的培養(yǎng)
將內(nèi)生真菌DSE-1和DSE-2自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，分別轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的平皿中，于22-28℃恒溫培養(yǎng)15-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
由平皿固體菌種轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)的DSE-1和DSE-2真菌可以直接使用，也可以作為種子菌種，種子菌種再進(jìn)一步接入液體或固體培養(yǎng)基進(jìn)行放大培養(yǎng)；
真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振蕩或發(fā)酵罐通氣暗培養(yǎng)；
真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有豆餅粉、富含纖維素的天然添加物和經(jīng)人工加工生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，真菌用試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置暗培養(yǎng)；
(2)雪蓮苗的培養(yǎng)
①雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗的培養(yǎng)
雪蓮種子經(jīng)表面消毒處理后，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基中，用試管或玻璃瓶等器皿靜置光照培養(yǎng)，待種子萌發(fā)形成苗；
②雪蓮無(wú)菌叢生苗的培養(yǎng)
雪蓮胚芽經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽、誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗、誘導(dǎo)叢生苗生根等步驟的處理，用試管或玻璃瓶等器皿靜置光照培養(yǎng)，培育成苗；
誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽和誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗所用的培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖、肌醇和瓊脂，添加不同種類(lèi)和濃度植物激素；
誘導(dǎo)叢生苗生根所用的培養(yǎng)基是以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖、肌醇和瓊脂，添加了不同種類(lèi)和濃度植物激素；
(3)雪蓮苗與內(nèi)生真菌的共生培養(yǎng)
雪蓮與DSE真菌共生培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)含有土壤、富含纖維素的天然添加物和營(yíng)養(yǎng)液，雪蓮和DSE真菌在栽培地、育苗床或玻璃器皿中光照培養(yǎng)；
將雪蓮苗與DSE真菌移入共生培養(yǎng)基質(zhì)中共生培養(yǎng)一段時(shí)間，移栽；也可以在栽培地應(yīng)用DSE真菌直接在共生培養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行雪蓮的栽培。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中所述的內(nèi)生真菌為DSE-1(Mycocentrospora sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No.1516，和DSE-2(Leptodontidium sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No.1517；以上兩種真菌在以下簡(jiǎn)稱(chēng)為DSE真菌。
3.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于DSE真菌液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中葡萄糖的加入量按重量計(jì)為1.5-4％；無(wú)機(jī)鹽類(lèi)成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量按重量計(jì)為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量按重量計(jì)為1-5％；培養(yǎng)基pH5.0-6.5；三角瓶或其他容器振蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量30-60％；培養(yǎng)基滅菌后接入上述DES真菌，種子菌種接種量為培養(yǎng)容器裝量的5-15％；液體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為振蕩轉(zhuǎn)速90-130轉(zhuǎn)/分鐘，22-26℃暗培養(yǎng)15-25天；培養(yǎng)結(jié)束后可直接使用或用勻漿機(jī)打碎培養(yǎng)產(chǎn)物備用。
4.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于DSE真菌固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中豆餅粉的加入量按重量計(jì)為0.5-2％；富含纖維素的天然添加物可以為闊葉樹(shù)鋸末，或小麥秸，或玉米秸，或玉米芯，或闊葉樹(shù)鋸末、小麥秸、玉米秸和玉米芯四種天然物中的任意兩種或兩種以上以任意比例混合的混合物，其加入量按重量計(jì)均為20-25％；經(jīng)人工加工生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以為甘油和玉米漿，其加入量按重量計(jì)為甘油1-7％，玉米漿0.2-1％；培養(yǎng)基pH5.0-6.5；試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量50-80％；培養(yǎng)基滅菌后接入液體培養(yǎng)的DES種子菌種，接種量為培養(yǎng)容器裝量的2-10％；固體培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為22-26℃暗培養(yǎng)，待菌絲從培養(yǎng)基頂部長(zhǎng)入底部或長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)取出備用。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于雪蓮無(wú)菌實(shí)生苗和叢生苗的培養(yǎng)中，所用的每升(L)MS基本培養(yǎng)基或每升(L)1/2MS基本培養(yǎng)基中，均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g；培養(yǎng)基pH5.0-6.5，用試管或玻璃瓶等器皿培養(yǎng)，培養(yǎng)容器裝量10-50％；苗的培養(yǎng)條件為15-26℃光照培養(yǎng)15-45天，光照強(qiáng)度1500-5000Lux，光照時(shí)間8-12小時(shí)/天；
雪蓮無(wú)菌叢生苗的培養(yǎng)中，
(1)誘導(dǎo)胚芽形成叢生芽的培養(yǎng)基中添加的植物激素為6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入6-BA1.0-3.0mg，NAA0.02-0.1mg；
(2)誘導(dǎo)叢生芽形成叢生苗的培養(yǎng)基中添加的植物激素為6-BA和NAA，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入6-BA0.08-2.0mg，NAA0.1-0.3mg；
(3)誘導(dǎo)叢生苗生根的培養(yǎng)基中添加的植物激素為NAA，其加入量為每升(L)培養(yǎng)基加入NAA0.1-0.3mg。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于
(1)雪蓮苗與DSE真菌共生培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)中土壤可以為腐殖質(zhì)土，或蛭石，或腐殖質(zhì)土和蛭石以5∶1-5的比例混合的混合土壤；富含纖維素的天然添加物可以是山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹(shù)或其他雜木樹(shù)的自然落葉，用時(shí)粉碎并浸濕，碎樹(shù)葉直徑0.5-2cm，其加入量為培養(yǎng)基質(zhì)中土壤重量的2-20％；營(yíng)養(yǎng)液可以是MS液體培養(yǎng)基，或0.5-3.5％的蔗糖溶液，或水，營(yíng)養(yǎng)液的添加比例按重量計(jì)可以是土壤∶營(yíng)養(yǎng)液＝0.8-1.3∶2.5-4；
(2)雪蓮苗與DSE真菌共生培養(yǎng)基質(zhì)的制備方法為先在玻璃容器的底部放置一層濕的碎樹(shù)葉，再在樹(shù)葉上鋪放土壤，然后加入營(yíng)養(yǎng)液，滅菌后使用；或先在栽培地、或育苗床、或煉苗地的基部鋪放一層濕的碎樹(shù)葉，再在樹(shù)葉上鋪放土壤，然后加入營(yíng)養(yǎng)液；在栽培地、或育苗床、或煉苗地使用的土壤，可以直接使用，或提前堆積并蓋塑料布發(fā)酵1-2個(gè)月，使其熟化殺菌后使用。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于
(1)雪蓮苗和真菌共生培養(yǎng)時(shí)，上述2種內(nèi)生真菌DSE-1和DSE-2可以任選一種單獨(dú)使用，也可以共同使用；
(2)雪蓮苗與DSE真菌共生培養(yǎng)時(shí)，雪蓮苗可以單株或2-5株苗為一叢進(jìn)行栽培，先將上述液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的DSE真菌接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)的樹(shù)葉層，接種量為每株苗或每叢苗下接種固體培養(yǎng)的DSE真菌0.2-1.5g，或液體培養(yǎng)的DSE真菌0.2-1.5mL，再將雪蓮苗按株行距2-15cm×2-15cm植入共生培養(yǎng)基質(zhì)中，使苗的根與DSE真菌接觸，用土壤把苗的根埋好；
(3)雪蓮苗與DSE真菌的共生培養(yǎng)可以在栽培地，或育苗床，或煉苗地，或培養(yǎng)室中的玻璃器皿中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度晝/夜為15-25℃/5-18℃，光照周期8-15小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為2000-10000Lux。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于DSE真菌可以直接用于雪蓮栽培地的種植，或?qū)⒀┥徝缗cDSE真菌共培養(yǎng)30-50天后再進(jìn)行移栽，移栽時(shí)將雪蓮苗連根取出即可；在共生培養(yǎng)過(guò)程中，可以根據(jù)需要補(bǔ)加或噴施營(yíng)養(yǎng)液。
9.如權(quán)利要求1-8所述的方法也適用于雪蓮的大面積栽培。
10.用于任一權(quán)利要求1-9所述方法的真菌為DSE-1(Mycocentrospora sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No.1516和DSE-2(Leptodontidium sp.)，保藏編號(hào)CGMCC No.1517。
全文摘要
一項(xiàng)內(nèi)生真菌在雪蓮(Saussurea sp.)苗培養(yǎng)和雪蓮栽培中的應(yīng)用技術(shù)，所用的兩種內(nèi)生真菌為DSE－1(Mycocentrospora sp.)和DSE－2(Leptodontidium sp.)。先在無(wú)菌條件下分別培養(yǎng)真菌和雪蓮苗，再將雪蓮苗與真菌移入共生基質(zhì)中共生培養(yǎng)。使用該項(xiàng)技術(shù)可以省去雪蓮的煉苗環(huán)節(jié)，或大大縮短雪蓮的煉苗周期。該項(xiàng)技術(shù)在雪蓮與真菌共生培養(yǎng)過(guò)程中未使用任何激素和化學(xué)促生長(zhǎng)劑，能顯著促進(jìn)雪蓮苗的生長(zhǎng)發(fā)育，提高雪蓮產(chǎn)量，提高雪蓮中活性成分的含量。本發(fā)明在雪蓮大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H3/00GK1961631SQ20051011770
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者郭順星, 武勵(lì)勤, 陳曉梅, 王春蘭, 孟志霞, 肖培根 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所