專利名稱：具有低亞麻酸的高產(chǎn)量大豆植物的制作方法
背景技術(shù)：
本申請要求2004年9月29日提交的美國臨時專利申請序號60/614,331的優(yōu)先權(quán)，將其完整公開內(nèi)容特別引入本文作為參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本申請總的來說涉及植物育種領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及具有商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和中/低亞麻酸含量的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆品種。
2.相關(guān)技術(shù)描述大豆種子是世界上用于食品的植物油的重要來源。大豆油中相對高水平(通常約8％)的亞麻酸(18∶3)降低了其穩(wěn)定性和風(fēng)味。
大豆油的氫化用于降低亞麻酸(18∶3)的水平和提高大豆油的穩(wěn)定性和風(fēng)味(Dutton等人，1951；Lui和White，1992)。然而，氫化導(dǎo)致產(chǎn)生反式脂肪酸，其當(dāng)被消費時增加了冠心病的風(fēng)險(Hu等人，1997)。
已經(jīng)通過突變、篩選和育種產(chǎn)生了低亞麻酸大豆品種(Fehr等人，1992；Rahman和Takagi，1997；Ross等人，2000；Byrum等人，1997；Stoisin等人，1998)。具體地已經(jīng)產(chǎn)生了亞麻酸含量為1％或更低的品種(美國專利號5,534,425和5,714,670)。然而，迄今為止產(chǎn)生的低亞麻酸系具有種子產(chǎn)量低和商業(yè)生產(chǎn)所需的其他農(nóng)學(xué)特征差的麻煩。該問題難以解決并且由于諸如亞麻酸含量和產(chǎn)量的農(nóng)學(xué)性狀的數(shù)量性質(zhì)而復(fù)雜化。因此，低亞麻酸含量大豆的有用性在許多商業(yè)背景中受到限制。
在大多數(shù)大豆栽培種開發(fā)程序中，開發(fā)具有重要商業(yè)意義的種子產(chǎn)量的產(chǎn)品是高度優(yōu)先考慮的。產(chǎn)量受到許多基因的控制，并且受到環(huán)境的強烈影響。它是品種的商業(yè)價值的最重要的特征并且育種者不斷嘗試提高產(chǎn)量到超過當(dāng)前可得到的產(chǎn)量。一個艱巨的挑戰(zhàn)是將低亞麻酸含量合并到高產(chǎn)量栽培種中。
同樣因為該困難，現(xiàn)有技術(shù)不能提供也具有低亞麻酸和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的高產(chǎn)大豆品種。然而，本領(lǐng)域中非常需要此類大豆植物。食物和藥物管理局(Food and Drug Administration)(FDA)已經(jīng)對營養(yǎng)標(biāo)簽提出規(guī)程以要求在營養(yǎng)成分表(Nutrition Fact panel)中包括食物中反式脂肪酸的量。除了降低我們對大豆油氫化的依賴性的健康益處外，前述FDA的提議引起了對于產(chǎn)生不需要或需要較少的氫化的低亞麻酸(小于3％)大豆的很大興趣。降低的亞麻酸可以顯著提高大豆收獲值。為了使降低的亞麻酸具有商業(yè)重要性，必須不相當(dāng)大地影響產(chǎn)量和/或優(yōu)良農(nóng)學(xué)性狀。因此，提供農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的同時高產(chǎn)并且具有降低的亞麻酸的大豆植物將代表本領(lǐng)域的實質(zhì)性進步并且同樣使農(nóng)民和消費者受益。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了具有中/低亞麻酸含量和商業(yè)重要意義的產(chǎn)量的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良品種的大豆植物。還提供了該植物的部分，包括但不限于，花粉、胚珠、細胞和種子。還提供了植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)物，其中組織培養(yǎng)物再生能夠表達該植物的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的大豆植物。在本發(fā)明的一個實施方案中，可再生的細胞是胚、分生細胞、花粉、葉、根、根尖或者花或者從它們得到的原生質(zhì)體或者愈傷組織。本發(fā)明還提供了從組織培養(yǎng)物再生的大豆植物，其能夠表達起始植物的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。
在本發(fā)明的一些實施方案中，中/低亞麻酸含量定義為亞麻酸含量為總的種子脂肪酸重量的約1.0％到約3.0％，包括總的種子脂肪酸重量的約1.5％到約3.0％、約2％到約2.6％、約2％到約3％、約1％到約2.6％、約1％到約2.2％、約1.6％到約2.6％和約2％到約2.4％。還可以將此類植物定義為籽粒產(chǎn)量(grain yield)為對照系A(chǔ)G2703和DKB23-51的至少約90％、94％、98％、100％、103％、105％或約110％。系A(chǔ)G2703也具有名稱SN79553和9323265446452，在美國專利號6,184,442中獲得專利，將該專利的公開內(nèi)容完整引入本文作為參考。命名為DKB23-51的系也具有名稱02122920和958361722350，在美國專利號6,369,302中獲得專利，將該專利的公開內(nèi)容完整引入本文作為參考。AG2703和DKB23-51的種子已經(jīng)保藏在ATCC，ATCC保藏號分別為PTA-2577和PTA-3933。
在再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明植物的植物部分。此類部分的實例包括花粉、胚珠、分生組織或者細胞。本發(fā)明還提供了本文描述的植物的種子，以及包含這種植物的細胞的組織培養(yǎng)物，其中組織培養(yǎng)物再生表達該植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的大豆植物。組織培養(yǎng)物可以包含可再生的細胞，如胚、分生細胞、花粉、葉、根、根尖或者花。
在再一方面，本發(fā)明提供了包含轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明的大豆植物。轉(zhuǎn)基因可以在一個實施方案中定義為賦予一種性狀，該性狀選自除草劑耐受性；抗病性；昆蟲或者害蟲抗性；改變的脂肪酸、蛋白質(zhì)或者糖類代謝；增加的籽粒產(chǎn)量；改變的植物成熟期，和改變的形態(tài)學(xué)特征。除草劑抗性的一個實例是草甘膦抗性。
在具體實施方案中，本發(fā)明的植物還可以定義為通過下面的方法產(chǎn)生，該方法包括步驟a)將第一種和第二種大豆植物雜交，其中所述植物包含賦予降低的亞麻酸含量的Fad3-1b和Fad3-1c等位基因，其中第一種植物具有低/中亞麻酸含量，且其中第二種植物包含商業(yè)上重要的產(chǎn)量；b)測定雜交所得后代大豆植物的產(chǎn)量和所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中多態(tài)性的存在；和c)選擇包含所述多態(tài)性和商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量的至少第一種農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的后代植物以得到權(quán)利要求1的植物。
在再一個方面，本發(fā)明提供了得到大豆種質(zhì)的方法，其包括步驟a)鑒定Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中賦予降低的亞麻酸含量的至少第一種多態(tài)性；b)測定大豆植物的所述多態(tài)性的存在；和c)選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物。該方法可以包括鑒定所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因兩者的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中的多態(tài)性并且測定所述多態(tài)性的存在。在一個實施方案中，所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1b基因序列的對應(yīng)于SEQID NO1的核苷酸2021的位置上的單核苷酸多態(tài)性。在另一實施方案中，所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c基因序列的對應(yīng)于SEQ ID NO2的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位置上的單核苷酸多態(tài)性。第一種多態(tài)性還可以包含F(xiàn)ad3-1c基因序列中的缺失，并且可以包含F(xiàn)ad3-1c啟動子中的多態(tài)性，如對應(yīng)于SEQ ID NO3的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位置上的單核苷酸多態(tài)性?？梢酝ㄟ^任何方法檢測多態(tài)性，所述方法包括PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳、裂解片段長度多態(tài)性分析和/或DNA測序。
在再一方面，本發(fā)明提供了植物育種方法，其包括步驟a)測定Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中賦予降低的亞麻酸含量的至少第一種多態(tài)性的存在；b)選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物；和c)將該第一種大豆植物與第二種大豆植物雜交，以產(chǎn)生包含所述多態(tài)性的子代植物。該方法還可以包括步驟d)選擇包含所述多態(tài)性的子代植物并將所述子代植物與第三種大豆植物雜交以產(chǎn)生另外的子代植物。在該方法中，第二種和第三種植物可以是相同的品種。在一些實施方案中，該方法還包括重復(fù)步驟d)約2-10次。該方法可以還包括測定大豆植物Fad3-1b和Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中多態(tài)性的存在并且基于所述多態(tài)性的存在選擇所述第一種大豆植物。在一些實施方案中，可以測定與Fad3-1b和Fad3-1c連鎖的標(biāo)記而不用測定與Fad3-1a緊密連鎖的標(biāo)記，因為發(fā)明人已經(jīng)表明Fad3-1b和Fad3-1c等位基因有助于低亞麻酸含量。
在該方法的一些實施方案中，第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1b基因中對應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸2021的位置上的單核苷酸多態(tài)性。該第一種多態(tài)性可以還包含F(xiàn)ad3-1c基因中對應(yīng)于SEQ ID NO2的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位置上的單核苷酸多態(tài)性。在其他實施方案中，第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c基因序列中的缺失，和/或Fad3-1c啟動子中對應(yīng)于SEQ ID NO3的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位置上的單核苷酸多態(tài)性。可以通過任何方法選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物，所述方法為例如PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳、裂解片段長度多態(tài)性分析和/或DNA測序。
在再一方面，本發(fā)明提供了在嚴(yán)格條件下與Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50 cM內(nèi)大豆基因組區(qū)域雜交的探針或引物，其中該探針或引物是選自SEQ ID NOs4-98的核酸序列。
本發(fā)明的再一個方面是生產(chǎn)用于人或者動物消費的食品的方法，其包括(a)得到本發(fā)明的植物；(b)栽培該植物至成熟；和(c)從該植物制備食品。在本發(fā)明的一些實施方案中，食品可以是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、粗粉、油、面粉或者大豆外殼。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過提供了具有中/低亞麻酸含量和商業(yè)上可接受的籽粒產(chǎn)量的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆品種克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明是重要的，因為盡管這些特征的益處已經(jīng)單獨實現(xiàn)，但是以前還沒有將它們組合在單個品種中。提供中/低亞麻酸含量與其他所需的特征的組合提供了許多益處。例如，由于油穩(wěn)定性的問題，當(dāng)前的大豆油通常必須至少部分氫化和/或與其他油混合。降低的亞麻酸含量減少了提高穩(wěn)定性對任一解決方案的需求，并且根據(jù)用途，可以消除對氫化的需要。因此，通過降低亞麻酸含量可以顯著改善大豆油的成本和質(zhì)量，從而使得大豆油相對于其他種子油的競爭力增強。低亞麻酸含量還減少了臭味，從而具有該特征的系擁有更高的商業(yè)價值(Liu和White，1992)。然而，低亞麻酸品種的廣泛采用迄今為止已受到產(chǎn)量低或者農(nóng)學(xué)品質(zhì)差的阻礙。
本發(fā)明提供了遺傳標(biāo)記和它們用于產(chǎn)生此類改良的植物的方法。由于數(shù)量性狀如產(chǎn)量和亞麻酸含量的復(fù)合遺傳，這是重要的，當(dāng)試圖組合這些性狀時所述復(fù)合遺傳為指數(shù)的。使用候選基因方法鑒定了標(biāo)記。設(shè)計基因座特異性嵌套引物來覆蓋由三個獨立基因座組成的整個FAD3基因家族。從包含9種突變型和16種野生型的25種不同的基因型產(chǎn)生擴增子。通過序列比對鑒定SNP和插入/缺失。遺傳分離分析證實所鑒定的標(biāo)記與等位基因Fad3-1b和Fad3-1c連鎖，其與對應(yīng)的野生型序列中產(chǎn)生低亞麻酸表型的突變有關(guān)。對分離植物的分析證明Fad3-1b和Fad3-1c加性地控制大豆中的亞麻酸含量。因此，使用Fad3-1b和Fad3-1c的標(biāo)記組合，本發(fā)明允許準(zhǔn)確預(yù)測植物中亞麻酸含量，而不需昂貴的生物化學(xué)分析。這些標(biāo)記被成功地證明用于低亞麻酸大豆育種程序并且首次允許開發(fā)組合低亞麻酸表型與商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良性狀的大豆品種。
現(xiàn)有技術(shù)不能提供這種品種的植物，可能是由于組合具有復(fù)合遺傳的不同性狀的困難和缺少克服這些困難的手段。通過描述產(chǎn)生此類植物的方法和提供這些植物的實例，本發(fā)明現(xiàn)在允許制備可能無限數(shù)目的新的大豆品種，其顯示出商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量與低亞麻酸含量和特別是中/低亞麻酸含量的組合。一旦生產(chǎn)了這種優(yōu)良品種，組合的產(chǎn)量和低亞麻酸含量就可以通過如下所述的合適的回交和選擇轉(zhuǎn)移到其他品種，以維持所需的性狀。
I.本發(fā)明的植物本發(fā)明首次提供了大豆品種的植物和其衍生物，其組合商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和中/低亞麻酸含量，具有農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的表型。此類植物可以定義為具有商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量，例如，定義為對照系A(chǔ)G2703和DKB23-51的至少103％的產(chǎn)量。在一些其他實施方案中，提供了具有中/低亞麻酸含量和這些系的至少約90％、94％、98％、100％、105％或約110％的籽粒產(chǎn)量的植物。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將此類植物定義為在至少10種環(huán)境中具有超過每英畝約35、37、39、41、43或45蒲式耳的產(chǎn)量。在本發(fā)明的具體實施方案中，可以將中/低亞麻酸含量定義為約1％到約3％種子脂肪酸含量，包括約1.3％到約3％、約1.5％到約3％、約1.8％到約3％、約2.1％到約3％、約2.4％到約3％、約2.6％到約3％、約1％到約2.6％、約1.3％到約2.6％、約1.8％到約2.6％、約2％到約2.6％、約2％到約2.4％以及約1.6％到約2.4％的種子脂肪酸含量。
本發(fā)明的一方面因此涉及前述植物和其部分和使用這些植物和植物部分的方法。植物部分包括，但不限于，花粉、胚珠和細胞。本發(fā)明還提供了這些植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物再生能夠表達起始品種的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的大豆植物。此類可再生的細胞可以包括胚、分生細胞、花粉、葉、根、根尖或者花，或者從其得到的原生質(zhì)體或愈傷組織。本發(fā)明還提供了從此類組織培養(yǎng)物再生的大豆植物，其中該植物能夠表達用以得到所述可再生細胞的起始植物品種的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。
II.用于產(chǎn)生中/低亞麻酸含量的大豆品種的標(biāo)記輔助的選擇本發(fā)明提供了遺傳標(biāo)記和將賦予中/低亞麻酸含量的基因座導(dǎo)入大豆植物的方法。本發(fā)明因此首次允許產(chǎn)生組合該亞麻酸含量與商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和農(nóng)學(xué)優(yōu)良的遺傳背景的植物。使用本發(fā)明的方法，賦予降低的亞麻酸含量的基因座可以導(dǎo)入潛在的任何所需的大豆遺傳背景，例如，在產(chǎn)生具有商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和中/低亞麻酸含量的新品種中。
標(biāo)記輔助的漸滲現(xiàn)象涉及將來自一種種質(zhì)的一種或多種標(biāo)記定義的染色體區(qū)域轉(zhuǎn)移到第二種種質(zhì)。該方法中的最初步驟是通過基因作圖對性狀進行定位，基因作圖是通過連鎖分析確定基因相對于其他基因和遺傳標(biāo)記的位置的方法。連鎖作圖的基本原理是染色體上的兩個基因越近，它們一起遺傳的可能性越高。簡言之，通常在兩種遺傳上相容的但是相對于研究中的性狀不同的親本之間進行雜交。然后可以用遺傳標(biāo)記跟蹤雜交所得的子代(通常為回交(BC1)、F2或者重組近交群體)中所研究的性狀的分離。
術(shù)語數(shù)量性狀基因座或者QTL用于描述基因組的區(qū)域，該區(qū)域?qū)Ρ硇惋@示出質(zhì)量或者加性效應(yīng)。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了兩種這樣的QTLFad3-1b和Fad3-1c的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明因此允許使用分子工具來組合這些QTL與所需的特征。
A.連鎖的遺傳標(biāo)記的開發(fā)可以對樣品第一植物群體確定遺傳的遺傳標(biāo)記的基因型以形成基因型數(shù)據(jù)庫。本文使用的“遺傳的遺傳標(biāo)記”是單個基因座上的等位基因?；蜃侨旧w上的位置，并且等位基因指這些基因座上基因的狀況，即不同的核苷酸序列。每個基因座的標(biāo)記等位基因組成可以是純合或者雜合的。為了在雜交中從遺傳標(biāo)記得到信息，標(biāo)記必須是多態(tài)的；即它必須以不同的形式存在從而攜帶突變基因的染色體可以通過它攜帶的標(biāo)記的形式而與具有正?；虻娜旧w區(qū)分開來。
通過直接觀察來自樣品植物的人工或者自然自花傳粉的子代的一種或多種性狀或者通過定量評估樣品植物的組合能力可完成基因型數(shù)據(jù)庫的形成。例如，植物系可以與一種或多種測交品系(tester)雜交或者被一種或多種測交品系雜交。測交品系可以是近交系、單交雜種、雙交雜種或者多交雜種，或者通過受控制的或者自由交配產(chǎn)生或維持的植物的任何其他集聚，或者其任意組合。對于一些自花傳粉植物，優(yōu)選直接評估，而不用子代測試。
可以在測交世代中確定標(biāo)記基因型并對標(biāo)記基因座作圖。為了通過連鎖方法對特定性狀作圖，必須在特定染色體基因座的遺傳和性狀的遺傳之間建立正相關(guān)。對于復(fù)合遺傳，如數(shù)量性狀，具體包括亞麻酸含量和產(chǎn)量，連鎖通常將更難以辨別。在該情況中，可以需要統(tǒng)計學(xué)方法來確立表型和基因型之間的相關(guān)。這還必須檢查來自特定雜交的許多后代，因為單個基因座可以具有對總體表型的小貢獻。
特定性狀和標(biāo)記的共同遺傳或者遺傳連鎖提示它們在染色體上物理上接近。通過分析雜交中基因和標(biāo)記的遺傳模式來確定連鎖。重組的單位是厘摩(cM)。兩種標(biāo)記如果在減數(shù)分裂中在它們必須重組的每100次機會中重組一次，那么它們相距1厘摩。厘摩是一種遺傳度量，不是物理度量。位于與第二種基因座小于50cM的那些標(biāo)記被認(rèn)為是遺傳連鎖的，因為它們不相互獨立地遺傳。從而，每代在基因座之間觀察到的重組百分比將小于50％。在本發(fā)明的具體實施方案中，可以使用在染色體上相距小于約45、35、25、15、10、5、4、3、2、或1或更小的cM的標(biāo)記。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以使用檢測有貢獻的基因座自身內(nèi)的多態(tài)性，并從而各自對于所述基因座位于0cM處的標(biāo)記，例如，包含F(xiàn)ad3-1b或Fad3-1c編碼序列或者調(diào)節(jié)元件內(nèi)的突變。
在減數(shù)分裂期間，同源染色體對聚到一起并且在稱作重組的過程中交換片段。標(biāo)記越是遠離基因，在基因和該標(biāo)記之間的重組的機會越大。在連鎖分析中，在特定雜交中跟蹤標(biāo)記和基因或性狀的共同遺傳。計算它們觀察到的遺傳模式可以僅僅偶然發(fā)生，即它們完全不連鎖的概率。重復(fù)該計算，從而假定具體的連鎖程度，并確定兩種概率(無連鎖對特定程度的連鎖)的比率。該比率表達了是(及不是)所述程度連鎖的可能性，并且因為使用了比率的對數(shù)，所以它被稱為可能性對數(shù)，例如，lod評分。例如，等于或者大于3的lod評分用于證實基因和標(biāo)記連鎖。這代表兩個基因座連鎖的1000∶1可能性。通過使用利用程序的統(tǒng)計學(xué)分析極大地促進了連鎖計算。
通過基因作圖模型可以確立標(biāo)記分子的遺傳連鎖，所述基因作圖模型為諸如但不限于，Lander和Botstein(1989)報導(dǎo)的側(cè)翼標(biāo)記模型，和基于Lander和Botstein(1989)描述的最大似然法并且用軟件包MAPMAKER/QTL(Lincoln和Lander，1990)實現(xiàn)的區(qū)間作圖。其它的軟件包括Qgene，版本2.23(1996)(Department of PlantBreeding and Biometry，266 Emerson Hall，Cornell University，Ithaca，NY)。
B.遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記包括兩個或更多個植物攜帶的遺傳信息中檢測得到的差異(多態(tài)性)。用遺傳標(biāo)記對基因座的遺傳作圖通常需要兩個基本的組分可檢測的多態(tài)性等位基因和那些等位基因的重組或者分離。在植物中，測量的重組事實上總是減數(shù)分裂的，且因此，動物基因作圖的兩個遺傳需求是多態(tài)性遺傳標(biāo)記，和其中所述那些等位基因是分離的一種或多種植物。
標(biāo)記優(yōu)選以共顯性方式遺傳，從而可以容易地檢測在二倍體基因座上兩種等位基因的存在，并且它們沒有環(huán)境變異，即它們的遺傳率為1。二倍體生物如大豆中標(biāo)記基因型通常在每個基因座上包含兩個標(biāo)記等位基因。每個基因座的標(biāo)記等位基因組成可以是純合或雜合的。純合性是其中基因座上的兩個等位基因的特征是相同的核苷酸序列的情況。雜合性指基因座上該基因的不同的狀況。
許多不同的標(biāo)記類型可以用于遺傳作圖。用于本發(fā)明的示例性遺傳標(biāo)記類型包括但不限于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和同工酶?？梢砸远喾N方法測定包含小至單個核苷酸改變的多態(tài)性。例如，通過電泳技術(shù)可以進行檢測，所述技術(shù)包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Orita等人，1989)、變性梯度凝膠電泳(Myers等人，1985)，或者裂解片段長度多態(tài)性(Life Technologies，Inc.，Gathersberg，MD 20877)，但是DNA測序機器的廣泛利用使得僅僅直接測序擴增產(chǎn)物更容易。一旦多態(tài)性序列差異是已知的，就可以設(shè)計快速測定用于子代測試，通常包括特定等位基因的某種形式的PCR擴增(PASA，Sommer，等人，1992)，或者多個特定等位基因的PCR擴增(PAMSA，Dutton和Sommer，1991)。
限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是DNA經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶消化后，一般通過瓊脂糖凝膠電泳顯示出的DNA片段長度可以檢測的遺傳差異?？梢岳枚喾N限制性內(nèi)切核酸酶，其特征是它們的核苷酸切割位點和它們的來源，例如，EcoRI。來自限制位點序列內(nèi)的單個堿基對多態(tài)性和給定限制性片段RFLP內(nèi)的可測量的插入或者缺失的RFLP結(jié)果是容易和相對廉價產(chǎn)生的(需要克隆的DNA，但是不需要序列)，并且是共顯性的。RFLP的缺點是在分型階段是勞動密集型的，盡管這可以通過許多任務(wù)的多路化和印跡的再利用在一定程度上減輕。大多數(shù)RFLP是雙等位基因的并且比微衛(wèi)星具有更小的多態(tài)性含量。由于該原因，在動物基因作圖中RFLP的使用已經(jīng)減少。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到許多類型的分子標(biāo)記可以用作監(jiān)控基因遺傳的工具并且不限于RFLP、SSR和SNP，并且技術(shù)人員將還理解可以用多種檢測方法來跟蹤多種分子標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員將還認(rèn)識到不同類型的標(biāo)記可以用于作圖，特別是隨著技術(shù)的發(fā)展和鑒定出了新類型的標(biāo)記和新的鑒定方法。
為了方便的目的，可以將遺傳的標(biāo)記基因型轉(zhuǎn)化成數(shù)字得分，例如，如果使用特定酶，在特定基因座上有稱作A和B的兩種形式的SNP，或者其他標(biāo)記，那么可以將二倍體互補序列轉(zhuǎn)化成數(shù)字得分，例如，為AA＝2，AB＝1，和BB＝0；或AA＝1，AB＝0和BB＝1。得分的絕對值不是重要的。重要的是數(shù)字標(biāo)號的加性性質(zhì)。上面的得分涉及共顯性標(biāo)記?？梢越o予類似的評分系統(tǒng)，其與顯性標(biāo)記相一致。
C.標(biāo)記輔助的選擇本發(fā)明提供了具有低/中亞麻酸含量組合商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良特征的大豆植物。此類植物可以根據(jù)本發(fā)明通過標(biāo)記輔助的選擇方法產(chǎn)生，所述方法包括測定基因組DNA中與賦予降低的亞麻酸的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因遺傳連鎖的標(biāo)記的存在。
在本發(fā)明的一些實施方案中，需要得到與Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因連鎖的額外的標(biāo)記。這可以例如如下進行首先通過自交F1雜種制備F2群體，所述F1雜種通過近交品種的雜交產(chǎn)生，所述近交品種中僅一個包含賦予降低的亞麻酸含量的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因。然后可以制備重組近交系(RIL)(遺傳上相關(guān)的系；通常＞F5，從連續(xù)自交的F2系朝純合性開發(fā))并將其用作作圖群體。從顯性標(biāo)記得到的信息可以通過使用RIL最大化，因為所有基因座都是純合的或者接近純合的。
回交群體(例如從所需的品種(回歸親本)和攜帶前者中不存在的性狀的另一品種(供方親本)之間的雜交產(chǎn)生)也可以用作作圖群體。可以進行與回歸親本的一系列回交以恢復(fù)其所需的性狀的大多數(shù)。從而，產(chǎn)生由與回歸親本相似的個體組成的群體，但是每個個體攜帶來自供方親本的不同量的基因組區(qū)域。如果回歸親本中的所有基因座都是純合的并且供方親本和回歸親本具有對比的多態(tài)性標(biāo)記等位基因，那么回交群體可以用于顯性標(biāo)記作圖(Reiter等人，1992)。
用于作圖目的的有用的群體是近等基因系(NIL)。通過多次回交產(chǎn)生一系列個體來產(chǎn)生NIL，所述個體除了所需的性狀或者基因組區(qū)域外在遺傳組成上接近相同，且NIL可以用作作圖群體。在用NIL作圖中，預(yù)期僅部分多態(tài)性基因座作圖到所選的區(qū)域?？梢栽谵D(zhuǎn)化的植物系上進行作圖。
D.植物育種方法育種技術(shù)利用了植物的傳粉方法。有兩種一般的傳粉方法自花傳粉，其中來自一朵花的花粉轉(zhuǎn)移到相同植物的相同或者另一朵花；和異花傳粉，其中花粉來自不同植物上的花。已經(jīng)自花傳粉并且對許多世代進行類型選擇的植物在幾乎所有基因座上都純合，并且產(chǎn)生均一群體的不分離子代，純合植物。
在合適的品種的開發(fā)中，可以使用譜系育種。特定性狀的譜系育種方法涉及雜交兩種基因型。每種基因型可以具有另一種基因型中缺少的一種或多種所需的特征；或者每種基因型可以與另一種互補。如果兩種最初的親本基因型不提供所有所需的特征，那么在育種群體中可以包括其他基因型。將這些雜交產(chǎn)生的優(yōu)良植物自交并在每個連續(xù)世代中再次自交。每個連續(xù)世代由于自花傳粉和選擇而變得更純合。通常，這種育種方法涉及5代或者更多代的自交和選擇S1→S2；S2→S3；S3→S4；S4→S5等等。自交的世代(S)可以被認(rèn)為是一種類型的雜交后代(F)并且同樣命名為F。至少5代后，認(rèn)為近交植物是遺傳上純的。
每個育種程序?qū)ㄓN步驟效率的周期性的客觀評價。評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)目標(biāo)和目的而變。將有希望的較晚育種系充分測試并在代表商業(yè)目標(biāo)區(qū)域的環(huán)境中與合適的標(biāo)準(zhǔn)一般比較3年或更多年?；祀s的植物性狀或者環(huán)境因素可以掩蔽由于基因型值而在遺傳上更優(yōu)良的個體的鑒定。鑒定優(yōu)良植物的一種方法是觀察其相對于其他實驗植物和一種或多種廣泛栽培的標(biāo)準(zhǔn)品種的性能。單次觀察可能是不確定的，但是重復(fù)觀察提供了對遺傳價值的更好的估計。
混合選擇和輪回選擇可以用于改進自花或者異花傳粉的農(nóng)作物的群體。通過幾種不同親本的互交可以鑒定或者產(chǎn)生雜合個體的遺傳變異群體?；趥€體優(yōu)越性、杰出的子代或者優(yōu)秀的組合能力選擇最好的植物。將所選的植物互交以產(chǎn)生新的群體，其中繼續(xù)其他輪的選擇。關(guān)于常用于不同性狀和農(nóng)作物的其他育種方法的描述可以見幾種參考書籍之一(例如，Allard，1960；Simmonds，1979；Sneep等人，1979；Fehr，1987a，b)。
在育種程序中對具有目的性狀(例如，高產(chǎn)量、抗病性、脂肪酸譜)的基因型的選擇的有效性將取決于1)群體中個體植物的目的性狀的變異性是由于遺傳因素的結(jié)果并且從而傳遞到所選基因型的子代的程度；和2)植物中目的性狀中多少變異性是由于不同基因型所生長的環(huán)境。性狀的遺傳范圍為通過一種主要基因控制(其表達不受環(huán)境的影響(即，質(zhì)量性狀))到受到許多基因的控制(其效果受到環(huán)境的很大影響(即數(shù)量性狀))。對于數(shù)量性狀如產(chǎn)量的育種的其他特征是如下事實1)每種基因的影響導(dǎo)致的差異是小的，從而使得難以或者不可能單獨地鑒定它們；2)有助于一種性狀的基因的數(shù)目很大，從而很少(如果得到的話)得到不同的分離比；和3)基因的影響可以基于環(huán)境變異以不同方式表達。因此，超親分離系(segragate)或者具有目的性狀的優(yōu)良基因型的準(zhǔn)確鑒定極端困難，并且它的成功取決于植物育種者使得影響群體中數(shù)量性狀的表達的環(huán)境變異最小化的能力。
隨著組合到一種基因型的性狀的數(shù)目的增加，鑒定超親分離子的可能性很快減小。例如，如果在三種復(fù)雜性狀(如產(chǎn)量、亞麻酸含量和至少第一種農(nóng)學(xué)性狀)有差別的栽培種之間進行雜交，那么不用分子工具極其難以通過將三種性狀的每一種的最大數(shù)目的有利基因重組到一個基因型中同時回收。因此，所有育種者一般所希望的是得到除所選基因外到一個基因型中的第一種復(fù)雜性狀的基因的有利分配與第二種性狀的基因的有利分配組合。
回交是轉(zhuǎn)移特定所需性狀的有效方法。這可以通過例如首先將優(yōu)良品種近交系(A)(回歸親本)與供方近交系(非回歸親本)雜交來實現(xiàn)，所述供方近交系攜帶對于研究中的性狀合適的基因(Fehr，1987)。然后將該雜交的子代與優(yōu)良回歸親本(A)回交，接著在所得子代中選擇將從非回歸親本轉(zhuǎn)移的所需性狀。這種選擇可以基于如下面提到的遺傳測定法，或者備選地，可以基于子代植物的表型。經(jīng)過5或者更多回交世代選擇所需的性狀后，子代對于控制正轉(zhuǎn)移的性狀的基因座是雜合的，但是對于大多數(shù)或者幾乎所有其他基因與優(yōu)良親本相似。將回交的最后世代自交，或者同胞交配，以得到對于所轉(zhuǎn)移的基因，例如，提供具有降低的亞麻酸含量的植物的基因座不分離的子代。
在本發(fā)明的一個實施方案中，回交轉(zhuǎn)變的方法可以定義為包括下面步驟的方法(a)將含有一種或多種所需的基因、DNA序列或者元件，如與降低的亞麻酸含量有關(guān)的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因的第一種基因型的植物與缺少所述所需的基因、DNA序列或者元件的第二種基因型的植物雜交；(b)選擇含有所述所需的基因、DNA序列或者元件的一種或多種子代植物；(c)將所述子代植物與第二種基因型的植物雜交；并(d)重復(fù)步驟(b)和(c)以用于將來自第一種基因型的植物的所述所需的基因、DNA序列或者元件轉(zhuǎn)移到第二種基因型的植物中。
特定DNA元件或者一組元件向植物基因型的漸滲現(xiàn)象定義為回交轉(zhuǎn)變的方法的結(jié)果。DNA序列已經(jīng)漸滲入的植物基因型可以稱作回交轉(zhuǎn)變的基因型、系、近交系或者雜種。類似地，缺少所需的DNA序列的植物基因型可以稱作未轉(zhuǎn)變的基因型、系、近交系或者雜種。在育種過程中，與減少的亞麻酸含量連鎖的遺傳標(biāo)記可以用于輔助育種以用于產(chǎn)生具有降低的亞麻酸含量、且優(yōu)選中/低亞麻酸含量的大豆植物?；亟缓蜆?biāo)記輔助的選擇尤其可以用于本發(fā)明以將根據(jù)本發(fā)明的降低的亞麻酸含量性狀引入任意品種，這通過用與所述性狀有關(guān)的Fad3-1b和/或Fad3-1c等位基因(優(yōu)選兩種基因座)轉(zhuǎn)變該品種來實現(xiàn)。
合適的回歸親本的選擇是成功的回交方法的重要步驟?；亟环桨傅哪康氖歉淖兓蛘叽孀畛踅幌抵械男誀罨蛘咛卣?。為了完成該目的，將回歸近交系的一個或多個等位基因用來自非回歸親本的所需基因修飾或者代替，而保持基本上所有剩余的所需遺傳，并且因此保持最初近交系的所需生理學(xué)和形態(tài)學(xué)組成。具體非回歸親本的選擇將取決于回交的目的，其在本發(fā)明的情況中可以為加入賦予降低的亞麻酸含量的一種或多種等位基因。確切的回交方案將取決于被改變的特征或者性狀以確定合適的測試方案。盡管當(dāng)被轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時，回交方法可以簡化，但也可以轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在該情況中，必須引入子代的測試以確定是否已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)移了所需的特征。對于本發(fā)明，人們可以測試在回交程序期間產(chǎn)生的子代系的亞麻酸含量以及使用本文描述的標(biāo)記系統(tǒng)來基于標(biāo)記而不是視覺性狀選擇系。
通過天然或者機械技術(shù)可以雜交大豆植物(大豆(Glycine maxL.))(見例如，F(xiàn)ehr，1980)。通過自花傳粉或者天然異花傳粉在大豆中發(fā)生天然傳粉，其通常得到傳粉生物的幫助。在天然或者人工雜交中，開花和開花時間是重要的考慮因素。大豆是短日照植物，但是對光周期的敏感性有相當(dāng)大的遺傳變異(Hamner，1969；Criswell和Hume，1972)。開花的臨界日長范圍為對于適應(yīng)熱帶緯度的基因型的約13小時到對于在更高緯度生長的光周期不敏感的基因型的24小時(Shibles等人，1975)。大豆在出苗(emergence)后9天對日長似乎不敏感。需要7到26天的短于臨界日長的光周期來完成花誘導(dǎo)(Borthwick和Parker，1938；Shanmugasundaram和Tsou，1978)。
大豆花通常在花冠開放當(dāng)天是自花傳粉的。柱頭在開花前約1天對于對花粉是接受的并且在開花后2天保持接受花粉，如果不除去花瓣的話。9個雄蕊絲融合，并且最接近旗瓣的絲是離生的。雄蕊在柱頭下形成環(huán)，直到開花前約1天，然后它們的絲開始快速延長并且在柱頭周圍升高花藥?；ㄋ幵陂_花當(dāng)天裂開，花粉粒落到柱頭上，并且在10小時內(nèi)，花粉管到達子房并且完成受精(Johnson和Bernard，1963)。在不操作花的情況下，大豆天然發(fā)生自花傳粉。對于雜交兩種大豆植物，通常優(yōu)選(盡管不是需要的)利用人工雜交。在人工雜交中，用作雜交中雌性的花在該花的花粉成熟前被手工異花傳粉，從而防止自體受精，或者備選地，使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)將花的雄性部分去勢。用于大豆花的雄性部分去勢的技術(shù)包括例如，物理除去雄性部分、使用賦予雄性不育的遺傳因子和對雄性部分應(yīng)用化學(xué)殺配子劑。
使用和不使用雌花的去勢，可以通過用鑷子從雄性親本的花除去雄蕊和雌蕊并對雌花的柱頭輕輕刷花藥進行手工傳粉。通過除去前萼片和龍骨瓣花瓣，或者用閉合的鑷子穿刺龍骨瓣并允許它們打開以推開花瓣可以實現(xiàn)接近雄蕊。在柱頭上刷花藥導(dǎo)致它們破裂，且當(dāng)在柱頭上清晰可見花粉時，得到最高百分比的成功雜交?？梢酝ㄟ^在刷柱頭前輕打花藥檢查花粉的釋放。當(dāng)條件不利時，可能必須使用幾朵雄花以得到合適的花粉釋放，或者可以使用具有良好花粉釋放的相同雄花對幾朵花傳粉。
遺傳雄性不育可以在大豆中得到并且可以用于促進本發(fā)明背景中的雜交，尤其對于輪回選擇程序(Brim和Stuber，1973)。完全隔離雜交區(qū)組(block)所需的距離還不清楚；然而，當(dāng)雄性不育植物與外來花粉來源為12m或者更遠時，異型雜交小于0.5％(Boerma和Moradshahi，1975)。雜交區(qū)組的邊界上的植物與外來花粉維持最多的異型雜交并且可以在收獲時除去以使污染最小化。
一旦收獲，通常將豆莢在不超過38℃的溫度下風(fēng)干，直到種子含有13％水分或者更小，然后手工取出種子。如果相對濕度為50％或者更低，可以將種子在約25℃下令人滿意的保存最長達1年。在濕潤氣候中，萌發(fā)百分?jǐn)?shù)快速降低，除非種子被干燥到7％水分并且在密封容器中室溫下保存。通過將種子干燥到7％水分并將其在10℃或更低溫度下在50％相對濕度的房間或者在密封容器中保存最好地完成了在任何氣候中的長期保存。
III.用于修飾和改進大豆品種的性狀在一些實施方案中，本發(fā)明提供的大豆植物可以包含一種或多種轉(zhuǎn)基因。此類轉(zhuǎn)基因的一個實例賦予除草劑抗性。通常的除草劑抗性基因包括賦予草甘膦抗性的EPSPS基因，賦予對卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)基因(Fraley等人，1983)，賦予對抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Vanden Elzen等人，1985)，賦予對草銨膦或者broxynil的抗性的基因(Comai等人，1985；Gordon-Kamm等人，1990；Stalker等人，1988)，如二氫葉酸還原酶和乙酰乳酸合酶(Eichholtz等人，1987，Shah等人，1986，Charest等人，1990)。其他實例包括賦予對咪唑啉酮類(imidazalinone)或者磺酰脲類的抗性的突變ALS和AHAS酶(Lee等人，1988；Miki等人，1990)、賦予膦絲菌素抗性的膦絲菌素-乙?；?轉(zhuǎn)移酶基因(歐洲申請0 242 246)、賦予苯氧基丙酸和cycloshexones，如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾定的抗性的基因(Marshall等人，1992)；和賦予對三嗪的抗性的基因(psbA和gs+基因)和對芐腈抗性的基因(腈水解酶基因)(Przibila等人，1991)。
本發(fā)明的植物還可以包含賦予對昆蟲、害蟲、病毒或者細菌攻擊的抗性的基因。例如，賦予對害蟲如大豆胞囊線蟲的抗性的基因在PCT申請WO96/30517和PCT申請WO93/19181中描述。Jones等人，(1994)描述了賦予對暗黃枝孢(Cladosporium fulvum)的抗性的番茄Cf-9基因的克??；Martin等人，(1993)描述了賦予對丁香假單胞菌致病變種(Pseudomonas syringae pv.)的抗性的番茄Pto基因，以及Mindrinos等人，(1994)描述了賦予對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性的鼠耳芥(Arabidopsis)RSP2基因。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)內(nèi)毒素也可以用于昆蟲抗性(見，例如，Geiser等人，(1986))。維生素結(jié)合蛋白，如抗生物素蛋白也可以用作殺幼蟲劑(PCT申請US93/06487)。
已知病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)化的植物細胞中的應(yīng)用賦予對病毒感染和/或該外殼蛋白基因所來源的病毒以及相關(guān)病毒影響的疾病發(fā)展的抗性(見Beachy等人，1990)。已經(jīng)賦予轉(zhuǎn)化植物對苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同前。還可以使用通過病原體或者寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育停頓蛋白。例如，Logemann等人，(1992)已經(jīng)表明表達大麥核糖體滅活基因的轉(zhuǎn)基因植物對真菌疾病具有增強的抗性。
轉(zhuǎn)基因還可以用于賦予增加的營養(yǎng)價值或者另一種提高價值的性狀。一個實例是修飾的脂肪酸代謝，例如，通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以增加植物的硬脂酸含量(見Knutzon等人，1992)。還可以引入有義去飽和酶基因以改變脂肪酸含量。通過導(dǎo)入肌醇六磷酸酶編碼基因來增強肌醇六磷酸的分解來改變肌醇六磷酸含量，從而向轉(zhuǎn)化的植物增加更多的游離磷酸。也可以例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來影響改變的糖類組成。(見Shiroza等人，1988)(變異鏈球菌(Streptococcus mutants)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz等人，(1985)(枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen等人，(1992)(產(chǎn)生表達地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifonnis)α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物)；Elliot等人，(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；Sgaard等人，(1993)(大麥α-淀粉酶基因的定點誘變)；和Fisher等人，(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II))。
轉(zhuǎn)基因還可以用于改變蛋白質(zhì)代謝。例如，美國專利號5,545,545描述了賴氨酸不敏感的玉米二氫吡啶二羧酸合酶(DHPS)，其顯著抗反過來抑制天然DHPS活性的L-賴氨酸的濃度。類似地，EP 0640141描述了編碼賴氨酸不敏感的天冬氨酸激酶(AK)的序列，其能夠?qū)е赂哂谡５奶K氨酸生產(chǎn)，以及編碼反義賴氨酸-酮戊二酸還原酶的亞片段，其用于增加賴氨酸。
在另一實施方案中，可以使用改變植物糖類代謝的轉(zhuǎn)基因。例如，已知果糖激酶基因用于轉(zhuǎn)基因植物和它們的果實中果糖激酶基因表達的代謝工程化(見美國專利號6,031,154)?？梢允褂玫霓D(zhuǎn)基因的另一實例是改變籽粒產(chǎn)量的基因。例如，美國專利號6,486,383描述了用腺苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶(“ADPG PPase”)的亞基蛋白質(zhì)改變植物中的淀粉含量。在EP0797673中，討論了轉(zhuǎn)基因植物，其中特定DNA分子的導(dǎo)入和表達導(dǎo)致在液泡外形成容易移動的磷酸庫和增強的生物量產(chǎn)生和/或改變的開花行為。還已知改變植物成熟期的基因。美國專利號6,774,284描述了編碼植物脂肪酶的DNA和其用于控制植物中衰老的方法。美國專利號6,140,085討論了改變開花特征，尤其開花時間選擇的FCA基因。美國專利號5,637,785討論了基因修飾的植物，其具有受調(diào)節(jié)的花發(fā)育，如具有早期花分生組織發(fā)育并且在其基因組中包含編碼LEAFY蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
用于改變植物形態(tài)學(xué)特征的基因也是已知的并且可以根據(jù)本發(fā)明使用。美國專利號6,184,440討論了基因工程改造的植物，其由于表達細胞壁調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因而顯示出改變的結(jié)構(gòu)或者形態(tài)學(xué)。細胞壁調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的實例包括纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、纖維素結(jié)合蛋白，或者細胞壁修飾蛋白或者酶，如內(nèi)切木葡聚糖(endoxyloglucan)轉(zhuǎn)移酶、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶、擴展蛋白、纖維素合酶，或者新分離的內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶。
導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的方法是本領(lǐng)域公知的并且包括生物學(xué)和物理學(xué)的植物轉(zhuǎn)化方案。見例如Miki等人(1993)。
一旦轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入品種中，它就可以容易地通過雜交轉(zhuǎn)移。通過使用回交，除了通過回交技術(shù)轉(zhuǎn)移到品種中的基因座外，回收了品種的基本上所有所需的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征?；亟环椒梢杂糜诒景l(fā)明以提高或向植物中引入特征(Poehlman等人，1995；Fehr，1987a，b)。
IV.大豆植物的組織培養(yǎng)物和體外再生本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的大豆品種的組織培養(yǎng)物。本文使用的術(shù)語“組織培養(yǎng)物”指包含相同或不同類型的分離細胞的組合物或者組織成植物的部分的一組這類細胞。組織培養(yǎng)物的示例性類型是在植物或植物部分中完整的原生質(zhì)體、愈傷組織和植物細胞，如胚、花粉、花、葉、根、根尖、花藥等等。在優(yōu)選實施方案中，組織培養(yǎng)物包含胚、原生質(zhì)體、分生細胞、花粉、葉或花藥。
用于制備可再生大豆細胞的組織培養(yǎng)物和從其再生大豆植物的示例性方法公開在美國專利號4,992,375；美國專利號5,015,580；美國專利號5,024,944和美國專利號5,416,011中，將它們每一個的公開內(nèi)容都完整地特別引入本文作為參考。
組織培養(yǎng)物的一種重要的能力是能夠再生可育的植物。這允許例如轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)物細胞后再生轉(zhuǎn)基因細胞。為了有效轉(zhuǎn)化和成功轉(zhuǎn)化，必須將DNA導(dǎo)入細胞中，該細胞產(chǎn)生植物或者種系組織。
大豆通常通過兩種不同的過程再生枝條形態(tài)發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生(Finer，1996)。枝條形態(tài)發(fā)生是枝條分生組織組構(gòu)和發(fā)育的過程。枝條從來源組織長出并被切斷和生根得到完整植物。在體細胞胚胎發(fā)生中，從體細胞植物組織形成含有枝條和根軸的胚(類似于合子胚)。從體細胞胚的萌發(fā)得到完整植物而不是生根的枝條。
枝條形態(tài)發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生是不同的過程并且再生的特定途徑主要依賴于用于組織培養(yǎng)操作的外植體來源和培養(yǎng)基。盡管系統(tǒng)是不同的，但是兩種系統(tǒng)都顯示出品種特異性應(yīng)答，其中一些系對于組織培養(yǎng)操作比其他系更有應(yīng)答性。在枝條形態(tài)發(fā)生中高度應(yīng)答的系不能產(chǎn)生許多體細胞胚。在“誘導(dǎo)”步驟過程中產(chǎn)生許多胚的系可能不產(chǎn)生快速生長的增殖培養(yǎng)物。因此，需要對每種大豆系最優(yōu)化組織培養(yǎng)條件。這些最優(yōu)化可以由組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員通過小規(guī)模培養(yǎng)研究容易地實施。除了系特異性應(yīng)答外，也可以觀察到增殖性培養(yǎng)物具有枝條形態(tài)發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生。增殖對于兩種系統(tǒng)都是有益的，因為它允許單個被轉(zhuǎn)化的細胞增殖到將促成種系組織的點。
Wright等人(1986)首次報導(dǎo)枝條形態(tài)發(fā)生為從大豆幼苗的子葉節(jié)從頭得到枝條所借助的系統(tǒng)。枝條分生組織在表皮下形成并且形態(tài)發(fā)生組織可以在含有芐基腺嘌呤(BA)的培養(yǎng)基上增殖。如果認(rèn)識到枝條的表皮下多細胞起點并且利用增殖培養(yǎng)物，那么該系統(tǒng)可以用于轉(zhuǎn)化。想法是靶定將產(chǎn)生新枝條的組織并且增殖分生組織內(nèi)的那些細胞以減少與嵌合狀態(tài)有關(guān)的問題。如果被轉(zhuǎn)化的細胞不足夠增殖并且不產(chǎn)生種系組織，那么在分生組織內(nèi)僅單個細胞的轉(zhuǎn)化得到的嵌合體的形成是有問題的。一旦充分理解了該系統(tǒng)并且令人滿意的重復(fù)該系統(tǒng)，那么它就可以用作大豆轉(zhuǎn)化的一種靶組織。
Christianson等人(1983)首次報導(dǎo)大豆中體細胞胚胎發(fā)生是其中最初從合子胚軸得到胚胎發(fā)生組織的系統(tǒng)。這些胚胎發(fā)生培養(yǎng)物是增殖的，但是該系統(tǒng)的重復(fù)性很低并且沒有報導(dǎo)胚的來源。后來對不同增殖性胚胎發(fā)生大豆培養(yǎng)物的組織學(xué)研究表明增殖性胚是頂端或者表面來源的，其中少數(shù)細胞促成胚形成。初生胚(來自最初外植體的第一個胚)的來源取決于外植體組織和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長素水平(Hartweck等人，1988)。使用增殖性胚培養(yǎng)物，“較老”體細胞胚的單個細胞或者小組表面細胞形成“較新”的胚。
如果認(rèn)識到胚的來源并且理解了增殖性胚胎發(fā)生培養(yǎng)物的生物學(xué)限制，那么胚胎發(fā)生培養(yǎng)物還可以成功地用于再生，包括轉(zhuǎn)基因植物的再生。生物學(xué)限制包括開發(fā)增殖性胚胎發(fā)生培養(yǎng)物的困難和與從長期增殖性胚胎發(fā)生培養(yǎng)物再生的植物有關(guān)的降低的生育力問題(培養(yǎng)物誘導(dǎo)的變異)。在長時間的培養(yǎng)過程中這些問題中的一些更明顯。使用更近期培養(yǎng)的細胞可以減小或者消除此類問題。
V.大豆植物的利用本發(fā)明提供的大豆植物可以用于認(rèn)為有價值的任意目的。通常的用途包括制備用于人類消費的食物、用于非人動物消費的飼料和工業(yè)用途。本文使用的“工業(yè)用途”或者“工業(yè)使用”指大豆或基于大豆的產(chǎn)品的非食物和非飼料用途。
通常將大豆加工成兩種主要產(chǎn)品大豆蛋白(粗粉)和粗大豆油。這兩種產(chǎn)品通常被進一步精煉以用于特定目的。精煉的油產(chǎn)品可以分解成甘油、脂肪酸和固醇。這些可以用于食物、飼料或工業(yè)使用?？墒秤玫氖称酚猛纠影ㄏ∧逃椭?、人造黃油、蛋黃醬、藥物、色拉調(diào)料、起酥油、烘焙食品和巧克力糖衣。
大豆蛋白產(chǎn)品(例如，粗粉)可以分成具有食物/飼料和工業(yè)用途的大豆粉濃縮物和分離物。大豆粉和粗渣(grit)通常用于生產(chǎn)肉類增補劑和類似物、寵物食物、烘焙成分和其他食品。由大豆粉和分離物制備的食品包括嬰兒食物、糖果產(chǎn)品、谷類、食物飲料、面條、酵母、啤酒、上面啤酒等等。大豆粗粉尤其常用作家畜飼養(yǎng)，主要是豬和家禽的蛋白質(zhì)來源。飼料用途從而包括但不限于，水產(chǎn)業(yè)飼料、蜜蜂飼料、小牛飼料替代品、魚飼料、家畜飼料、家禽飼料和寵物飼料等等。
完整大豆產(chǎn)品也可以用作食物或飼料。通常的食物使用包括這樣的產(chǎn)品，諸如種子、豆芽、烘焙的大豆、用于各種烘焙產(chǎn)品的全脂大豆粉、用作糖食的烘烤大豆、大豆醬(soy nut butter)、大豆咖啡(soycoffee)和東方食物的其他大豆衍生物。對于飼料使用，通常從大豆取出外殼并將其用作飼料。
大豆還具有許多工業(yè)用途。大豆的一種常見的工業(yè)用途是制備可以用于生產(chǎn)復(fù)合材料的粘合劑。例如，使用改性的大豆蛋白、水解大豆蛋白和PF樹脂的混合物、含有粉末樹脂的大豆粉和含有起泡膠水的大豆蛋白可以生產(chǎn)木材復(fù)合材料。利用基于大豆的粘合劑生產(chǎn)常見的木材產(chǎn)品，如膠合板已經(jīng)超過70年了。盡管脲甲醛和酚醛樹脂的引入已經(jīng)降低了木材產(chǎn)品中基于大豆的粘合劑的使用，但是環(huán)境問題和消費者對從可再生的原料生產(chǎn)的粘合劑的偏愛已經(jīng)導(dǎo)致重新出現(xiàn)對開發(fā)用于木材復(fù)合材料工業(yè)的新的基于大豆的產(chǎn)品的興趣。
粘合劑的制備代表大豆的另一常見的工業(yè)用途。大豆粘合劑的實例包括大豆水解產(chǎn)物粘合劑和大豆粉粘合劑。大豆水解產(chǎn)物是無色的水溶液，其通過將大豆蛋白分離物在5％氫氧化鈉溶液中加熱(120℃)和加壓(30psig)反應(yīng)而制備。得到的降解的大豆蛋白溶液在室溫下是堿性的(pH 11)和可流動的(約500cps)。大豆粉是從大豆制備的精細研磨的脫脂粗粉?？梢詮拇蠖狗壑苽涓鞣N粘合劑制劑，第一步通常需要將面粉溶解在氫氧化鈉溶液中。所得制劑的強度和其他性質(zhì)將依賴于制劑中的添加劑而變。大豆粉粘合劑還可能與其他商購的樹脂組合。
大豆油還可以應(yīng)用于多種工業(yè)用途。大豆油是最容易得到的和世界上成本最低的植物油之一。大豆油的常見的工業(yè)用途包括用作抗靜電劑、填隙化合物、消毒劑、殺真菌劑、墨水、油漆、保護涂層、壁板、消泡劑、醇、人造黃油、油漆、墨水、橡膠、起酥油、化妝品等等的組分。大豆油多年來也是醇酸樹脂的主要成分，所述醇酸樹脂溶解在載體溶劑中以制備基于油的油漆。在熱和壓力下將植物油轉(zhuǎn)化成為醇酸樹脂的基本化學(xué)是本領(lǐng)域技術(shù)人員完全了解的。
處于可商購的未精煉或者精煉的食用級狀態(tài)的大豆油是相當(dāng)穩(wěn)定和緩慢干燥的油。還可以改性大豆油以在環(huán)境條件下增強它的反應(yīng)性，或者輸入各種形式的能量，以導(dǎo)致大豆油共聚或者熟化成干燥膜。這些形式的改性中的一些包括環(huán)氧化作用、醇解或者酯交換、直接酯化、復(fù)分解、異構(gòu)化、單體修飾、和各種形式的聚合作用，包括熱增稠。對于許多工業(yè)用途，大豆油的反應(yīng)性亞油酸組分與其雙鍵可以比主要的油酸和亞油酸組分更有用。
還可以使用基于大豆的成分制備溶劑。例如，豆油脂肪酸甲酯(methyl soyate)-一種基于大豆油的甲酯-正在市場上被接受為在諸如部件清潔和脫脂、油漆和墨水去除和漏油補救應(yīng)用中的優(yōu)秀的溶劑替代備選方案。它還以多種配制的消費產(chǎn)品上市，所述產(chǎn)品包括洗手劑、汽車蠟和亂畫除去劑。通過大豆油與甲醇的酯交換產(chǎn)生豆油脂肪酸甲酯。它可以從多種生產(chǎn)商和供應(yīng)商商購得到。作為溶劑，豆油脂肪酸甲酯具有重要的環(huán)境和安全性相關(guān)的性質(zhì)，其使得它對于工業(yè)應(yīng)用是有吸引力的。它的毒性比大多數(shù)其他溶劑更低，容易生物降解，并且具有非常高的閃點和低水平的揮發(fā)性有機化合物(VOC)。豆油脂肪酸甲酯與金屬、塑料、大多數(shù)高彈體和其他有機溶劑的相容性是優(yōu)良的。豆油脂肪酸甲酯的當(dāng)前用途包括清潔劑、脫漆劑、漏油清除和生物補救(bioremediation)。農(nóng)藥佐劑、防腐劑和生物柴油機燃料添加劑。
VI.定義在下面的描述和表格中，使用了許多術(shù)語。為了提供對說明書和權(quán)利要求書的清楚和一致的理解，提供下面的定義A當(dāng)與詞語“包含”或者權(quán)利要求書中的其他開放措辭一起使用時，詞語“一個(a)”和“一個(an)”指“一個或多個”。
農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的如本文使用的，指基因型，其具有許多可區(qū)別性狀的最佳表現(xiàn)，如突出體、萌發(fā)勢、營養(yǎng)勢、抗病性、種子結(jié)實、站立能力和脫粒能力，其允許生產(chǎn)商收獲具有商業(yè)重要性的產(chǎn)品。
等位基因基因座的一種或多種可選形式的任一種，所有等位基因都涉及性狀或者特征。在二倍體細胞或者生物中，給定基因的兩個等位基因占據(jù)一對同源染色體上的對應(yīng)基因座。
回交一種方法，其中育種者將雜種后代，例如，第一代雜種(F1)與雜種后代的親本之一重復(fù)雜交?；亟豢梢杂糜趶囊环N遺傳背景向另一遺傳背景引入一個或多個單一基因座轉(zhuǎn)變。
商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量對栽培者具有商業(yè)重要性的籽粒產(chǎn)量，當(dāng)生長在相同條件下時，由對照系A(chǔ)G2703和DKB23-51的103％的實際籽粒產(chǎn)量來表示。
雜交兩種親本植物的交配。
異花傳粉通過來自不同植物的兩種配子的聯(lián)合受精。
F1雜種兩種非等基因植物雜交的第一代后代。
基因型細胞或生物的遺傳組成。
工業(yè)用途大豆植物的非食物或者非飼料用途。術(shù)語“大豆植物”包括大豆植物的植物部分和衍生物。
連鎖一種現(xiàn)象，其中相同染色體上的等位基因比如果等位基因的傳遞是獨立的而偶然預(yù)期的更傾向于一起分離。
標(biāo)記容易檢測的表型，優(yōu)選以共顯性方式遺傳(在二倍體雜合子中基因座上的兩個等位基因容易檢測)，沒有環(huán)境變異組分，即遺傳率為1。
表型細胞或者生物的可檢測的特征，該特征是基因表達的表現(xiàn)。
數(shù)量性狀基因座(QTL)數(shù)量性狀基因座(QTL)指在一定程度上控制通常連續(xù)分布的以數(shù)量表示的性狀的遺傳基因座。
嚴(yán)格條件指5X SSC、50％甲酰胺和42℃下的核酸雜交條件。
基本上等同的一種特征，當(dāng)被比較時，不與平均值顯示出統(tǒng)計學(xué)顯著差異(例如，p＝0.05)。
組織培養(yǎng)物組合物，其包含相同或不同類型的分離細胞或者一組組織成植物部分的此類細胞。
轉(zhuǎn)基因遺傳基因座，其包含已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大豆植物的基因組的序列。
VII.實施例包括下面的實施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白下面實施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實踐中良好運行的技術(shù)，并且因此可以被認(rèn)為組成它的實踐的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容將明白，在所公開的特定實施方案中可以在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下做出許多改變并且仍然得到同樣或者相似的結(jié)果。更具體地，將明白化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑可以代替本文描述的試劑而將實現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的所有此類相似的替代和修飾都在所附權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
實施例1作圖群體和多態(tài)性鑒定選擇低亞麻酸系6P248、T27111、T27190、T26767和T26830用于鑒定成熟組1-4中的低亞麻酸(low-lin)相關(guān)的多態(tài)性。這些系的亞麻酸含量為約3％。低亞麻酸系Soyola和N98-44將用于成熟組4-5。其他低亞麻酸系包括A5和C1640。還使用具有下面的商業(yè)名稱的16種野生型系A(chǔ)2247、AG1902、AG2402、AG2703、AG3201、AG3302、AG3702、AJB2102J0C、AJB2302K0C、CSR2533、CSR2622N、CSR3922N、DKB19-51、DKB23-95和WP25920。為了促進作圖，來自以前使用的作圖群體的系HS-1和PI507354(PIC)用于一些測序區(qū)域中。使用標(biāo)準(zhǔn)DNA提取方案從每種基因型分離DNA。
設(shè)計嵌套引物以完全覆蓋基因座Fad3-1a、Fad3-1b和Fad3-1c。產(chǎn)生的擴增子來自不同的系。將這些擴增子的序列進行比對以鑒定與低亞麻酸表型有關(guān)的SNP和插入/缺失。最初，從Fad3-1a設(shè)計了13對引物，從Fad3-1b設(shè)計了6對引物，并從Fad3-1c設(shè)計了12對引物。一旦從該研究確定了它們的序列，就為來自內(nèi)含子的Fad3-1c設(shè)計額外的14對引物。表1列出了用于該分析的引物。用DNA Star包的Seqman程序進行序列比對。
由Applied Biosystems根據(jù)SNP序列設(shè)計并制造Taqman測定。根據(jù)Applied Biosystems的說明書進行SNP檢測。
表1.為對Fad3-1a、Fad3-1b和Fad3-1c基因再測序(resequencing)設(shè)計的引物(分別為SEQ ID NOs4-82)
FAD3_1A1F CCTATTCTAGGTTTTTACGCACCAFAD3_1A1R AAGTTGTCTAAAGCCAAATGAAGAAFAD3_1A2F GGACATGATTGGTAATAATTTTTGTGFAD3 1A2R AGGAAGCATAAAGATTCCCTTTTTFAD3_1A3F AAAGGGAATCTTTATGCTTCCTGFAD3_1A3R TCTGCACATGATCAAACAATTACAFAD3_1A4F ATGTAATTGTTTGATCATGTGCAGFAD3_1A4R AAAATAAAATCTTGTGGGTGCAATFAD3_1A5F TGGCGGATCTATGTAAATGAGTGFAD3_1A5R AATGAAAAACGGGGCTTGTAAFAD3_1A6F TTTTGTTGGTCAAGGGACTTAGATFAD3_1A6R CACCACCAAGCTCCCAGTATAGTAFAD3_1A7F CCTCCTTTCTAGGTGTACATGCTTFAD3_1A7R ATCATGGATCCCATGTCTCTCTATFAD3_1A8F TTGTTCTTGGACATGATTGGTAATFAD3_1A8R TTCAATGACAAATGAACAAACAAAFAD3_1A9F GAAATCACATCTGGAATGTGAAAGFAD3_1A9R AATAATGTGTTGTTGTCTTCCAAGTFAD3_1A10F GAAATCACATCTGGAATGTGAAAGFAD3_1A10R GTTCAAGAACAGCCTCAGGAAGFAD3_1A11F GGTGAACACTTAAATGCGAGATAGFAD3_1A11R TTATGGGGGCAAAGTTTTATTTTAFAD3_1A12F TCCATAAATAAGTAAAACAAGTGACAAFAD3_1A12R CCACTTACCACACTTTCTTTGTTGFAD3_1A13F TCATTTTCAGTTGCATGATTCTAAFAD3_1A13R CAGAAGTATCAAAGCATGTACACCFAD3_1B1F CAACATGTTGGTAATGGTGCAGGGAFAD3_1B1R CGAACAATCATGCATAACCAAFAD3_1B2F TGCATGATTGTTCGTTCATATGTTFAD3_1B2R TGACATAAAGGCATAAAGACACATFAD3_1B3F GATGTGAATTTCATGAAGTGGTTCFAD3_1B3R GGACTTGGACATGTGTTAACCTCFAD3_1B4F TATTTGCAACCTACACCGAAGTAAFAD3_1B4R ACATGGAGTAAGTTTCTACCTTCTTTFAD3_1B5F TATTTGCAACCTACACCGAAGTAAFAD3_1B5R ACATGGAGTAAGTTTCTACCTTCTTTFAD3_1B6F TTTCTCCTATTCTACAATCAATAATCCFAD3_1B6R AAAGTAAGTGCATTTCTAGCATAATTTFAD3_1C1F AAGATTTCATTCTTCCTCTTCTAGGFAD3_1C1R AATTGAGGAATGCAAGATGTGTCFAD3_1C2F ACACATCTTGCATTCCTCAATTCTFAD3_1C2R CTTTCTGGCTCACGGTAATACTCTFAD3_1C3F TTCTTGGAGAGTATTACCGTGAGCFAD3_1C3R CAATATTTATTAATTACCACCTTACFAD3_1C4F CTAGGTTATTACGCACCACCCAFAD3_1C4R GGAGGAGCACTGGGATCAAAAGCT
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表2.Fad3-1a基因座上的多態(tài)性
注釋括號中的數(shù)字表示給定系中的序列讀數(shù)的數(shù)目。
實施例3Fad3-1b上多態(tài)性的鑒定Fad3-1b的內(nèi)含子序列與Fad3-1a的相當(dāng)不同，其允許有效產(chǎn)生基因座特異性擴增子。除了小部分5′UTR區(qū)之外，來自大多數(shù)系的序列的質(zhì)量通常是高的。在所有系中檢測到2683bp的完整序列長度中2021位上的單核苷酸多態(tài)性(表3)。有趣的是，發(fā)現(xiàn)該SNP與低亞麻酸表型有關(guān)。發(fā)現(xiàn)低亞麻酸系6P248、T27111、T27190、T26767和T26830在該位置攜帶“C”等位基因，而所有其他系都攜帶“T”。對具有“C”等位基因的5個系測試了亞麻酸含量并且發(fā)現(xiàn)其都具有小于4％的亞麻酸。其他低亞麻酸系如A5、Soyola和N98-4445在該基因座攜帶野生型等位基因，從而表明一個或多個其他基因座促進這些系中的低亞麻酸表型。
為了確定2021位的SNP是否是有義突變，將ORF翻譯成蛋白質(zhì)。這表明在低亞麻酸系中的該突變將氨基酸殘基從組氨酸改變成酪氨酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該組氨酸殘基在對于涉及去飽和的多種基因是關(guān)鍵的。低亞麻酸系中所發(fā)現(xiàn)的SNP導(dǎo)致基序His-Val-Ile-His-His突變成His-Val-Ile-His-Tyr。該基序與低亞麻酸表型有關(guān)并且可能造成降低的亞麻酸。
表3.Fad3-1b基因座上的多態(tài)性
注釋括號中的數(shù)字表示給定系中的序列讀數(shù)的數(shù)目實施例4Fad3-1c上多態(tài)性的鑒定最初沒有得到Fad3-1c的基因組DNA。然而，cDNA在Fad3-1a和Fad3-1c之間在整個基因內(nèi)是高度保守的，具有高于90％的序列同一性。為了使用來自外顯子的引物擴增內(nèi)含子，手工挑選了靶定Fad3-1c特定區(qū)域的許多引物。一旦新序列是已知的，就從內(nèi)含子設(shè)計新的引物。使用該方法，成功得到了覆蓋所有內(nèi)含子的部分序列。序列分析表明Fad3-1c等位基因與Fad3-1a基因座甚至在內(nèi)含子中都是非常相似的。在兩個基因座之間接近外顯子/內(nèi)含子接點處觀察到非常高的序列相似性，但是相似性隨著序列進一步延長而降低。
從所得的序列，在Fad3-1c鑒定了四個SNP和一個插入/缺失(表4)。687、2316、3743位的SNP以及1129位的插入/缺失似乎處于連鎖平衡并且與低亞麻酸表型有關(guān)。低亞麻酸系Soyola和N98-4445在687和1129位都攜帶與所有其他系不同的等位基因。盡管沒有從所有系得到3360和3743位的序列，但是表明這些基因座與687和1129連鎖平衡。所有四個陽性SNPs/插入/缺失(Indel)位于內(nèi)含子中。
有趣的是注意到低亞麻酸系Soyola和N98-4445來自屬于成熟組4到5的種質(zhì)，而其他系屬于成熟組1到4。這些突變導(dǎo)致低亞麻酸表型的機制還不清楚。一種解釋是有另一種突變位于編碼區(qū)外，可能在啟動子區(qū)中，其導(dǎo)致該表型并且與在內(nèi)含子2中檢測的的標(biāo)記連鎖平衡。因此如下所述進行啟動子序列的分析。
重要的是從表4注意到突變系6P248、T27111、T27190、T26767、T26830和A5用幾乎所有Fad3-1c基因座特異性引物都不能擴增。這表明在這些系中Fad3-1c基因座上有大的缺失。缺失的長度在不同突變系中稍有不同。該結(jié)果與早期的研究一致，所述研究表明A5實際上在Fad3-1c上攜帶缺失。因為該完整基因的大部分都被缺失，所以可以預(yù)測催化亞油酸向亞麻酸轉(zhuǎn)化的酶不能正確地發(fā)揮功能。結(jié)果，攜帶該突變型的植物將產(chǎn)生較少的亞麻酸。
表4.Fad3-1c基因座上的多態(tài)性
注釋1.NA指沒有檢測到擴增2.括號中的數(shù)字指出給定系中的序列讀數(shù)的數(shù)目實施例6Fad3-1c的啟動子區(qū)的分離為了確定有助于Soyola和N98-4445中低亞麻酸含量的因素，嘗試克隆Fad3-1c基因的上游區(qū)。設(shè)計了面向上游區(qū)的三種引物并且將該引物用于根據(jù)從CloneTech購買的Genome Walking試劑盒擴增未知的啟動子序列。從A3244系得到約1kb片段。PCR產(chǎn)物用外切核酸酶和蝦堿性磷酸酶處理后直接測序。為了鑒定與低亞麻酸含量有關(guān)的多態(tài)性，設(shè)計了三種新的引物來覆蓋整個啟動子和編碼區(qū)的5’末端，其然后用于擴增24種不同系。將來自這些擴增子的序列進行比對以鑒定SNP。在啟動子區(qū)中發(fā)現(xiàn)了7個SNP(表5)。Soyola在所有七個位置都攜帶與其他野生型系不同的等位基因。這些SNP可能是低亞麻酸表型的決定因素。為了證實該關(guān)聯(lián)，對亞麻酸含量分離的群體測試這些SNP。
表5.Fad3-1c啟動子區(qū)中的多態(tài)性
實施例7低亞麻酸標(biāo)記測定驗證從上面鑒定的4個SNP設(shè)計Taqman終點測定(表6)。測定按照給定基因座上共有序列中SNP位置來命名。例如，F(xiàn)D3A842指來自Fad3-1a的在共有序列上842位的SNP。新的標(biāo)記名NS0193117在后來分配給FD3A842并且用于生產(chǎn)。對用于再次測序的相同實驗組驗證測定。


圖1A顯示了NS0193117的allelogram。來自Taqman測定的等位基因模式與序列相一致。
從Fad3-1b設(shè)計了兩種測定FD3B2021A和FD3B2021B(NS0193115)。
圖1B顯示了測序?qū)嶒灲M上NS0193115的allelogram。具有低亞麻酸含量的所有四種系都具有與野生型不同的等位基因，從而與序列很好地對應(yīng)。
圖1C顯示了來自Fad3-1c位687的NS0193116的allelogram。系Soyola和N98-4445顯示了與其他系不同的等位基因。所有測定結(jié)果都對應(yīng)于序列數(shù)據(jù)。
對亞麻酸含量的8個分離群體進一步測試SNP標(biāo)記(表7)。已知與fanfan基因座連鎖的6個SNP也在相同的群體上進行基因分型。因為群體為F4，所以當(dāng)用于Mapmaker程序時，將它們作為RI群體處理。雜合等位基因被掩蔽掉了。
NS0131053是位于連鎖群B2/U26上的標(biāo)記，其中fanfan基因座位于該連鎖群上。表7表明NS0193116(Fad3-1c)通過約10cM距離與NS0131053連鎖。因此，如我們預(yù)期的，fad3c對應(yīng)于fanfan。因為發(fā)現(xiàn)NS0131053與NS0193116(fad3c)連鎖，所以NS0131053也可以作為低亞麻酸系選擇的參考標(biāo)記。可以基于在NS0193116上的無效等位基因和在NS0131053上的低亞麻酸等位基因進行選擇。來自這些群體的數(shù)據(jù)表明Fad3-1a、-1b和-1c等位基因都獨立地遺傳。
發(fā)現(xiàn)NS0193115和NS0193116標(biāo)記的組合提供了對亞麻酸含量的準(zhǔn)確診斷。從序列結(jié)果可以清楚地知道Fad3-1b和-1c兩者在控制大豆中亞麻酸水平中起作用。僅具有Fad3-1b(NS0193115)突變的突變系含有約4.2％亞麻酸而僅Fad3-1c(NS0193116)缺失的突變系含有約3.4％(表8)。因此，通過組合包含F(xiàn)ad3-1b和Fad3-1c基因座上雙重突變型標(biāo)記的植物的選擇，可以得到甚至更低水平的亞麻酸。圖2顯示了Fad3-1b和Fad3-1c的表型值。這清楚地表明雙重突變型“TT**”具有最低的亞麻酸含量而雙重野生型具有最高的亞麻酸含量。
表6.用于Taqman測定法的引物和探針(分別為SEQ ID NOs83-97)
表7.NS0193116和NS0131053之間的遺傳連鎖待測試的圖群體1(1-96)標(biāo)記 距離1N0131053 3.3cM5N0193116 7.6cM2N0129792 0.0cM3N0096899 ----------11.0cM 4標(biāo)記 對數(shù)似然＝-47.79群體2(97-192) 標(biāo)記 距離90個體 1N0131053 0.0cM3N0193116 ----------0.0cM 2標(biāo)記 對數(shù)似然＝-20.80群體4(289-384)標(biāo)記 距離66個體1N0131053 4.4cM3N0193116 ----------4.4cM 2標(biāo)記 對數(shù)似然＝-21.10群體6(481-576)標(biāo)記 距離94個體1N0131053 6.7cM3N0193116 ----------6.7cM 2標(biāo)記 對數(shù)似然＝-35.24群體7(577-672)標(biāo)記 距離94個體1N0131053 22.6cM3N0193116 ----------22.6cM 2標(biāo)記 對數(shù)似然＝-53.16群體8(673-768)標(biāo)記 距離67個體1N0131053 3.2cM2N0099767 10.0cM4N0193116 ----------13.2cM 3標(biāo)記 對數(shù)似然＝-36.80
表8.不同基因型中亞麻酸含量的百分?jǐn)?shù)
參考文獻在本文中具體引入下面的參考文獻作為參考，其程度為它們提供補充本文所給出的那些細節(jié)的示例性方法或者其他細節(jié)。
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<223>人工序列描述合成引物<400>98aaaaattgaa tcaataaaag aa 2權(quán)利要求
1.農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的大豆品種的植物，其具有商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量和低/中亞麻酸含量。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述亞麻酸含量還定義為選自總的種子脂肪酸重量的約1.2％到約3.0％、總的種子脂肪酸重量的約1.5％到約3.0％、總的種子脂肪酸重量的約2％到約2.6％、總的種子脂肪酸重量的約2％到約3％、總的種子脂肪酸重量的約1％到約2.6％、總的種子脂肪酸重量的約1％到約2.2％、總的種子脂肪酸重量的約1.6％到約2.6％和總的種子脂肪酸重量的約2％到約2.4％。
3.權(quán)利要求1的植物的植物部分。
4.權(quán)利要求3的植物部分，其還定義為花粉、胚珠、分生組織或者細胞。
5.權(quán)利要求1的植物的種子。
6.權(quán)利要求1的植物的可再生細胞的組織培養(yǎng)物，其中該組織培養(yǎng)物再生大豆植物，該大豆植物表達權(quán)利要求1的植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。
7.權(quán)利要求6的組織培養(yǎng)物，其中所述可再生的細胞為胚、分生細胞、花粉、葉、根、根尖或者花。
8.從權(quán)利要求6的組織培養(yǎng)物再生的大豆植物，其中所述再生的大豆植物表達權(quán)利要求1的植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。
9.權(quán)利要求1的大豆植物，其還定義為包含轉(zhuǎn)基因。
10.權(quán)利要求9的大豆植物，其中所述轉(zhuǎn)基因還定義為賦予選自除草劑耐受性；抗病性；昆蟲或者害蟲抗性；改變的脂肪酸、蛋白質(zhì)或者糖類代謝；增加的籽粒產(chǎn)量；改變的植物成熟期，和改變的形態(tài)學(xué)特征的性狀。
11.權(quán)利要求9的大豆植物，其中所述轉(zhuǎn)基因賦予對草甘膦除草劑的耐受性。
12.權(quán)利要求1的植物，其定義為通過包括下列步驟的方法制備a)將第一種和第二種大豆植物雜交，其中所述第一種和第二種植物一起包含每個都賦予降低的亞麻酸含量的Fad3-1b等位基因和Fad3-1c等位基因，其中所述第一種植物包含F(xiàn)ad3-1b或Fad3-1c等位基因的至少一種，并且其中所述第二種植物包含商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量；b)測定雜交所得后代大豆植物的產(chǎn)量和所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中多態(tài)性的存在；和c)選擇包含所述多態(tài)性和商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量的至少第一種后代植物以得到權(quán)利要求1的植物。
13.產(chǎn)生大豆種子的方法，其包括將權(quán)利要求1的植物自交或者與第二種大豆植物雜交。
14.權(quán)利要求13的方法，其還定義為制備雜種大豆種子的方法，其包括將權(quán)利要求1的植物與第二種不同的大豆植物雜交。
15.生產(chǎn)食物或飼料的方法，其包括(a)得到權(quán)利要求1的植物；(b)栽培所述植物至成熟；和(c)從所述植物制備食物或者飼料。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述食物是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、大豆外殼、粗粉或面粉。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述食物是油。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述食物包含飲料、泡制食物、沙司、調(diào)味品、色拉調(diào)料、果汁、糖漿、甜食、糖衣和餅餡、軟的冷凍產(chǎn)品、糖食或者半成品食物。
19.得到大豆種質(zhì)的方法，其包括步驟a)鑒定Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中賦予降低的亞麻酸含量的至少第一種多態(tài)性；b)測定大豆植物的所述多態(tài)性的存在；和c)選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物。
20.權(quán)利要求19的方法，其包括鑒定所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因兩者的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中的多態(tài)性并測定所述多態(tài)性的存在。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1b基因序列的對應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸2021的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c基因序列的對應(yīng)于SEQ ID NO2的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c基因序列中的缺失。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c啟動子中對應(yīng)于SEQ ID NO3的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
25.權(quán)利要求19的方法，其中測定大豆植物的所述第一種多態(tài)性的存在包括PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳、裂解片段長度多態(tài)性分析和/或DNA測序。
26.植物育種方法，其包括步驟a)測定大豆植物的Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中賦予降低的亞麻酸含量的至少第一種多態(tài)性的存在；b)選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物；和c)將該第一種大豆植物與第二種大豆植物雜交，以產(chǎn)生包含所述多態(tài)性的子代植物。
27.權(quán)利要求26的方法，其還包括步驟d)選擇包含所述多態(tài)性的子代植物并將所述子代植物與第三種大豆植物雜交以產(chǎn)生另外的子代植物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述第二種和第三種植物是相同的品種。
29.權(quán)利要求27的方法，其還包括重復(fù)步驟d)約2-10次。
30.權(quán)利要求26的方法，其包括測定大豆植物的所述Fad3-1b和Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)中多態(tài)性的存在。
31.權(quán)利要求30的方法，其包括基于所述多態(tài)性的存在選擇所述第一種大豆植物。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1b基因序列中對應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸2021的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
33.權(quán)利要求26的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c基因序列中對應(yīng)于SEQ ID NO2的核苷酸687、1129、1203、2316、3292、3360或3743的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
34.權(quán)利要求26的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c基因序列中的缺失。
35.權(quán)利要求26的方法，其中所述第一種多態(tài)性包含F(xiàn)ad3-1c啟動子中對應(yīng)于SEQ ID NO3的核苷酸334、364、385、387、393、729或747的位置上的單核苷酸多態(tài)性。
36.權(quán)利要求26的方法，其中選擇包含所述多態(tài)性的至少第一種大豆植物包括PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性梯度凝膠電泳、裂解片段長度多態(tài)性分析和/或DNA測序。
37.在嚴(yán)格條件下與Fad3-1b或Fad3-1c等位基因的50cM內(nèi)的大豆植物基因組區(qū)域雜交的探針或引物，其中該探針或引物包含選自SEQ ID NO4到SEQ ID NO98的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明通過提供用于標(biāo)記輔助的選擇的方法以產(chǎn)生顯示出具有商業(yè)上重要意義的產(chǎn)量的中/低亞麻酸含量和農(nóng)學(xué)上優(yōu)良表型的大豆品種的植物，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明還提供了這些植物的衍生物和植物部分。本發(fā)明還提供了這些植物的使用方法。本發(fā)明的重要之處在于具有降低的亞麻酸的油顯示出多種有益的特征，而具有降低的亞麻酸的現(xiàn)有技術(shù)品種也顯示出降低的產(chǎn)量和差的農(nóng)學(xué)品質(zhì)。
文檔編號A01H5/00GK101090970SQ200580040822
公開日2007年12月19日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者吳坤生, P·麥萊爾德, J·R·拜倫, R·賴特, M·埃里克森 申請人:孟山都技術(shù)有限公司