專利名稱：：產(chǎn)量增加的植物及其制備方法產(chǎn)量增加的植物及其制備方法本發(fā)明通常涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及相對于在非脅迫條件下生長的對應(yīng)野生型植物，在相當(dāng)條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量的方法。更具體的，本發(fā)明涉及在非脅迫條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量的方法，包括在植物細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性。本發(fā)明還涉及在細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加了I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性的植物，當(dāng)該植物在非脅迫條件下生長時，相對于在相當(dāng)條件下生長的對應(yīng)的野生型植物，具有增加的產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了可用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。不斷增長的世界人口和農(nóng)業(yè)用地面積供應(yīng)的縮小,了對增加農(nóng)業(yè)效率的農(nóng)業(yè)研究。作物和園藝改良的常規(guī)手段利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，這種選育技術(shù)具有若干缺點，即這些技術(shù)一般是勞動密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳成分的植物，所述植物并非總是產(chǎn)生自親本植物傳遞過來的期望性狀。分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)允許人類操作動物和植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般是DNA或RNA的形式)，隨后把該遺傳物質(zhì)引入到植物中.此種技術(shù)能夠提供具有多種改良的經(jīng)濟學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝性狀的植物。產(chǎn)出了具有特殊經(jīng)濟利益的性狀。產(chǎn)量通常定義為作物產(chǎn)生的可衡量經(jīng),值。這可以從數(shù)量和/或質(zhì)量方面定義。產(chǎn)量直接取決于一些因素，例如，器官的數(shù)量和尺寸，植物結(jié)構(gòu)(例如，枝條的數(shù)量)，種子產(chǎn)量等等。根的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是確定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化上述因素之一可以因此提高作物產(chǎn)量，另外，植物種子是人和動物營養(yǎng)的重要來源。作物如玉米、稻、小麥、卡諾拉油菜和大豆為超過半數(shù)的總?cè)祟惖臒崃繑z取，不管是通過種子本身的直接消耗還是通過加工的種子飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消耗。它們還是糖、油和用在工業(yè)加工中的許多類代謝物的來源。種子包含在萌發(fā)后新枝條和根的來源一胚胎，以及在萌發(fā)和幼苗的早期生長過程中胚胎生長養(yǎng)料的來源——胚乳。種子發(fā)育包括許多基因，并且需要將來自根、葉和莖的代謝物轉(zhuǎn)移到生長的種子中。特別的，胚乳吸收糖類聚合物、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯藏大分子以灌漿谷粒。無論是通過增加的收獲指數(shù)、增加的千粒重、種子數(shù)量、種子生物量、種子發(fā)育、種子飽滿或任何其他種子相關(guān)性狀的增加植物種子產(chǎn)量的能力都在農(nóng)業(yè)并且甚至是許多非農(nóng)業(yè)用途(例如在物質(zhì)如藥物、抗體或疫苗的生物技術(shù)制備中)中具有許多應(yīng)用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽的活性物具有增加的產(chǎn)量。DnaJ是Hsp40(熱休克蛋白40)家族的分子輔陪伴分子。Hsp40與陪伴分子熱休克蛋白70(Hsp70，也稱作DnaK)和輔陪伴分子核苷酸交換因子GrpE協(xié)同作用來促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝的不同方面，包括核糖體裝配、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)解折疊、多肽集合的阻抑和細(xì)胞信號傳導(dǎo)(Walid(2001)CurrProteinPeptideSci2:227-244)。DnaJ刺激Hsp70水解ATP，這是底物與Hsp70穩(wěn)定結(jié)合的關(guān)鍵步驟。另外，由于已經(jīng)表明DnaJ在體外翻譯系統(tǒng)中結(jié)合到新生鏈上并且阻止變性多肽的聚集，DnaJ本身也具有分子陪伴分子功能(Laufen等人(2001)ProcNatlAcadSci美國96:5452-5457)。已經(jīng)在多種生物(在原核生物和真核生物中)中以及在多種細(xì)胞區(qū)室(如細(xì)胞溶膠、線粒體、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體基質(zhì))中鑒定了DnaJ家族的成員。在一種生物中，多個Hsp糾可以與單個Hsp70相互作用以生成Hsp70::Hsp40對，這促進(jìn)了在細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝中的多種反應(yīng)。所有的DnaJ蛋白質(zhì)是通過所謂的"J"結(jié)構(gòu)域的存在并且通過在J結(jié)構(gòu)域中間高度保守的HPD三肽的存在來定義的，所述"J"結(jié)構(gòu)域由大約70個氨基酸組成，通常位于該蛋白質(zhì)的氛基末端(InterPro參考IPR001623;Zdobnov等人，(2002)18(8):1149-50);由4個a螺旋組成的"J"結(jié)構(gòu)域與Hsp70蛋白質(zhì)相互作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組中，已經(jīng)鑒定了至少89種包含J-結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(Miernyk(2001)CellStress&Chaperones)。目前已經(jīng)鑒定了18種Hsp70蛋白質(zhì)。DnaJ蛋白質(zhì)被進(jìn)一步分成I型、II型和III型。I型DnaJ結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(或DnaJ蛋白質(zhì))(目前在擬南芥屬(Arabidopsis)中存在至少8種；Miernyk(2001)CellStress&Chaperone6(3):209-218)包含(從氨基末端到羧基末端)在原始型DnaJ蛋白質(zhì)(如在大腸桿菌(Eschrichiacoli)中首先鑒定的)中鑒定的結(jié)構(gòu)域1)大約30個氬基酸殘基的G/F結(jié)構(gòu)域區(qū)域，其富含甘氨酸(G)和苯丙氨酸(F)，其用來調(diào)節(jié)靶標(biāo)多肽特異性；2)包含4個重復(fù)CXXCXGXG的富含Cys的鋅指結(jié)構(gòu)域，其中X代表了帶電或極性殘基；這4個重復(fù)片段成對作用來形成鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域I和II(InterPro參考IPR001305;Linke等人(2003)JBiolChem278(45):44457-44466);認(rèn)為鋅指結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)直接的蛋白質(zhì):蛋白質(zhì)相互作用并且更特異性的結(jié)合待遞送到Hsp70的非天然多肽；3)^&末端結(jié)構(gòu)域(CTD;InterPro參考IPR002939),II型DnaJ結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(目前在擬南芥屬中存在至少35種)包含位于蛋白質(zhì)氨基末端的J結(jié)構(gòu)域、G/F結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域，以及CTD。III型DnaJ結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(目前在擬南芥屬中存在至少45種)僅包含J結(jié)構(gòu)域，其位于蛋白質(zhì)中的任何位置。在其天然形式中(可以是可溶的或膜結(jié)合的形式)，DnaJ蛋白質(zhì)可以乾向到多個亞細(xì)胞區(qū)室。在植物中此類亞細(xì)胞區(qū)室的實例包括線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、核、細(xì)胞質(zhì)和分泌途徑。通常位于核編碼的DnaJ蛋白質(zhì)的氨基末端的信號序列和轉(zhuǎn)運肽可用于將這些蛋白質(zhì)靶向到特異性的亞細(xì)胞區(qū)室中。在特異性環(huán)境下DnaJ蛋白質(zhì)所靶向的細(xì)胞膜實例包括線粒體外膜、葉綠體外膜、過氧化物酶體膜、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和細(xì)胞膜本身(Miernyk(2001)CellStress&Chaperone6(3):209-218)。DnaJ蛋白質(zhì)的一種類型的膜結(jié)合發(fā)生在蛋白質(zhì)的翻譯后修飾后(即在異戊二烯化后)。類異戊二烯基團連接到位于蛋白質(zhì)羧基末端末的法尼基化CaaX基序(其中C是Cys,a是脂族氨基酸殘基并且X是任何M酸)的半胱氨酸。已經(jīng)表明此法尼基化導(dǎo)致更高的生物學(xué)活性和DnaJ蛋白質(zhì)的膜結(jié)合，特別是在升高的溫度下(ZhuJ-K等人，(1993)ThePlantCell5:341-9)。已經(jīng)暗示DnaJ蛋白質(zhì)對賦予植物熱脅迫耐受性中發(fā)揮作用(與HSP70一起)。同時DnaJ在熱脅迫的植物中起到保護(hù)性作用，不明確在非熱脅迫的植物中增加DnaJ水平和/或活性是否存在其他任何的優(yōu)勢。因此令人驚訝的發(fā)現(xiàn)I型DnaJ樣多肽可以在非脅迫生長條件下使用，以使得植物相對于在相當(dāng)條件下生長的對應(yīng)野生型植物的產(chǎn)量具有增加的產(chǎn)量。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了在非脅迫條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量的方法，其包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其g末端包含CaaX基序。術(shù)語"細(xì)胞溶膠"是指用于本發(fā)明方法中的DnaJ蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置。DnaJ蛋白質(zhì)與線粒體、葉綠體、過氧化物酶體、核、ER的外表面或與細(xì)胞膜的瞬時或長久結(jié)合涵蓋在術(shù)語細(xì)胞溶膠中。蛋白質(zhì)的"g末端"可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易的鑒定出來。本文提及的"對應(yīng)野生型植物"意指任何適當(dāng)?shù)膶φ罩参铮溥x擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的，并且可以包括例如對應(yīng)的野生型植物或無目的基因的對應(yīng)植物。本文所用的"對照植物"不僅是指整林植物，還是指植物部分，包括種子和種子部分。本文提及的"非脅迫(生長)條件"意指在正常生長條件下生長/培育在其生活周期(從種子到成熟植物再到種子)任何階段的植物，所述正常生長條件包括每株植物都會遇到的每天的中等脅迫，但是不包括嚴(yán)重脅迫。嚴(yán)重脅迫的實例包括熱脅迫，其發(fā)生是本領(lǐng)域熟知的，并且取決于多種因素，如植物生長的區(qū)域并且取決于植物自身。有利的，實施本發(fā)明方法產(chǎn)生了具有增加的產(chǎn)量，特別是增加的種子產(chǎn)量的植物。本文所定義的術(shù)語"增加的產(chǎn)量"意指分別相對于對應(yīng)的野生型植物，如下任何一個或多個方面的增加(i)植物的一個或多個部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分、增加的根生物量或任何其他可收獲部分的增加的生物量；(ii)增加的種子產(chǎn)量，其包括種子的生物量(種子重量)增加，并且其可以是每g株或單粒種子基礎(chǔ)上的種子重量增加；(iii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(iv)增加的種子飽滿率(其是飽滿種子數(shù)除以總種子數(shù)并且乘以100的數(shù)量)；(v)增加的種子尺寸，其還可以影響種子組成；(vi)增加的種子體積，這也可影響種子的組成；(vii)增加的收獲指數(shù)，其表示為可收獲部分(例如種子)的產(chǎn)量與總生物量的比例；和(viii)增加的千粒重(TKW)，其從所計的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推論出來。增加的TKW可源于增加的種子尺寸和/或種子重量。以谷類為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種每公項或英畝植物數(shù)量增加、每抹植物穗數(shù)量的增加、畦數(shù)、每畦種子數(shù)、粒重、千粒重、穗的長度/直徑的增加等。以稻為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種的增加每公項或英畝植物數(shù)量、每林植物的圓錐花序數(shù)量、每個圓錐花序的小穗數(shù)量、每個圓錐花序花的數(shù)量，種子飽滿率的增加、千粒重的增加等。產(chǎn)量的增加還可產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以因為改變的構(gòu)造而發(fā)生。根據(jù)優(yōu)選的特征，實施本發(fā)明方法產(chǎn)生具有增加的種子產(chǎn)量的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了在非脅迫條件下生長的植物中增加植物種子產(chǎn)量的方法，該方法包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性，該I型DnaJ樣多肽在其羧基末端包含CaaX基序。另外優(yōu)選的，增加的種子產(chǎn)量表現(xiàn)為相對于對應(yīng)野生型植物的收獲指數(shù)的增加。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了在非脅迫條件下生長的植物中增加收獲指數(shù)的方法，該方法包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性，該I型DnaJ樣多肽在其羧基末端包含CaaX基序。由于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量，因此，相對于在其生活周期對應(yīng)階段的相應(yīng)野生型植物的生長速度，這些植物很可能表現(xiàn)出增加的生長速度(至少是在其生活周期的一部分)。生長速度增加可以是對植物的一個或多個部分(包括種子)特異性的，或者可以基本遍布整抹植物。具有增加的生長速度的植物甚至可以表現(xiàn)出早開花。生長速度的增加可以發(fā)生在植物生活周期的一個或多個階段或者基本遍布整個植物生活周期期間。在植物生活周期的早期階段增加的生長速度反映了增強的活力。生長速度的增加可以改變植物的收獲周期，這使得植物可以比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長速度充分增加，可以允許更多播種相同植物物種的種子(例如在播種和收獲稻植物后，接著播種和收獲更多的稻植物，所有這些都在一個常規(guī)生長期內(nèi))。類似的，如果生長速度充分增加，可以允許更多播種不同植物物種的種子(例如在播種和收獲稻植物后，例如接著播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適當(dāng)?shù)闹参镒魑?。在一些植物的情形下，從同一根狀莖收獲多次也是可能的。改變植物的收獲周期可以使得每英畝每年生物量的產(chǎn)出增加(由于任何特定植物可以生長和收獲次數(shù)(指在一年中)的增加)。生長速度的增加還使得轉(zhuǎn)基因植物可以比它們的野生型對應(yīng)物在更廣的地域栽培，這是因為生長作物的區(qū)域性限制通常決定于種植時(初期)或收獲時(晚期)的不利環(huán)境條件。如果收獲周期縮短，那么可以避免此類不利條件?？梢酝ㄟ^得自生長曲線的多個參數(shù)來確定生長速度，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大尺寸的50%時所用的時間)以及T-90(植物達(dá)到其最大尺寸的90%時所用的時間)等。本發(fā)明方法的實施提供了具有增加的生長速度的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了相對于在非脅迫條件下生長的野生型植物的生長速度，增加在相當(dāng)條件下生長的植物的生長速度的方法，該方法包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序。在任何植物中可以有利的修飾上述生長特性。本文所用的術(shù)語"植物"包括整林植物、植物的祖代和后代以及植物部分(包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官，其中前述每種包括目的基因/核酸。術(shù)語"植物"還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣的，其中前述每種包含目的基因/核酸。尤其可用于本發(fā)明方法中的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自下列的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木金合歡屬物種(Acaciaspp.)、槭樹屬物種(Acerspp.)、獼猴桃屬物種(Actinidiaspp,)、七葉樹屬物種(Aesculusspp.)、新西蘭貝殼杉(Agathisaustralis)、Albiziaamara、三色桫移(Alsophilatricolor),須芒草屬物種(Andropogonspp，)、落花生屬物種(Arachisspp)、檳榔(Arecacatechu)、Asteliafragrans、黃芪(Astragaluscicer)、Baikiaeaplurijuga、樺木屬物種(Betulaspp.)、蕓苔屬物種(Brassicaspp.)、木視(Bruguieragymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫鉚(Buteafrondosa)、Cadabafarinosa、朱纓花屬物種(Calliandraspp)、茶(Camelliasinensis),美人蕉(Cannaindica)、辣椒屬物種(Capsicumspp.)、決明屬物種(Cassiaspp.)、距瓣豆(Centroemapubescens)、木瓜屬物種(Chaenomelesspp.)、肉桂(Cinnamomumcassia)、小杲咖叫一(Coffeaarabica)、Colophospermummopane、變異小冠花(Coronilliavaria)、枸子(Cotoneasterserotina)、山楂屬物種(Crataegusspp.)、香瓜屬物種(Cucumisspp.)、柏木屬物種(Cupressusspp.)、Cyatheadealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、圓球柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅屬物種(Cymbopogonspp.)、Cyntheadealbata、木梨(Cydoniaoblonga)、Dalbergiamonetaria、大葉骨碎補(Davalliadivaricata)、山馬埴屬物種(Desmodiumspp.)、迪卡蘭(Dicksoniasquarosa)、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp、嫌扁豆屬物種(Dolichosspp.)、Dorycniumrectum、錐穗稗(Echinochloapyramidalis)、Ehrartiaspp.、糝子(Eleusinecoracana)、Eragrestisspp.、刺桐屬物種(Erythrinaspp.)、桉屬物種(Eucalyptusspp.)、Eucleaiischimperi、金茅(Eulaliavillosa)、蕎麥屬物種(Fagopyrumspp.)、費約羅(Feijoasellowiana)、草雷屬物種(Fragariaspp.)、千斤拔屬物種(Flemingiaspp)、Freycinetiabanksii、Geraniumthimbergii、銀杏(Ginkgobiloba)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、銀樺屬物種(Grevilleaspp.)、Guibourtiacoleosperma、巖黃芪屬物種(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthiaaltissima)、扭黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥(Hordeumvulgare)、Hyparrheniarufa、小連翅(Hypericumerectum)、Hypertheliadissoluta、白花庭藍(lán)(Indigoincarnata)、秀尾屬物種(Irisspp.)、Leptarrhenapyrolifolia、胡枝子屬物種(Lespedizaspp.)、Lettucaspp.、Leucaenaleucocephala、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、百樂M艮屬物種(Lotusspp.)、硬皮豆(Macrotylomaaxillare)、蘋果屬物種(Malusspp.)、Manihotesculenta、紫苜蓿(Medicagosativa)、7jC杉(Metasequoiaglyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、煙草屬物種(Nicotianumspp.)、驢食草屬物種(Onobrychisspp.)、Ornithopusspp.、稻屬物種(Oryzaspp.)、非洲雙翼豆(Peltophorumafricanum)、《良尾草屬物種(Pennisetumspp.)、跨梨(Perseagratissima)、碧冬茄屬物種(Petuniaspp.)、菜豆屬物種(Phaseolusspp.)、檳榔竹(Phoenixcanariensis)、Phormiumcookianum、石楠屬物種(Photiniaspp.)、白云杉(Piceaglauca)、；+^屬物種(Pinusspp.)、豌豆(Pisumsativum)、新西蘭羅漢松(Podocarpustotara)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、楊屬物種(Populusspp.)、牧豆樹(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyruscommunis)、櫟屬物種(Quercusspp.)、Rhaphiolepsisumbellata、美p未棒花棕(Rhopalostylissapida)、Rhusnatalensis、歐洲醋粟(Ribesgrossularia)、茶子屬物種(Ribesspp.)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosaspp.)、懸鉤子屬物種(Rubusspp.)、柳屬物種(Salixspp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitysverticillata)、北美紅杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、兩色蜀泰(Sorghumbicolor)、菠菜屬物種(Spinaciaspp.)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthoshumilis、葫,茶屬物種(Tadehagispp)、落羽杉(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黃背草(Themedatriandra)、車軸草屬物種(Trifoliumspp.)、小麥屬物種(Triticumspp.)、異葉鐵杉(Tsugaheterophylla)、越桔屬物種(Vacciniumspp.)、野豌豆屬物種(Viciaspp.)、葡萄(Vitisvinifera)、錐穗沃森花(Watsoniapyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、玉米(Zeamays)、莧屬(amaranth)、菊芋(artichoke)、天門冬屬(asparagus)、青花椰菜(broccoli)、孢子甘藍(lán)(Brusselssprouts)、甘藍(lán)、卡諾拉油菜(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芽菜、羽衣甘藍(lán)(collardgreens)、亞麻、球莖甘藍(lán)(kale)、兵豆屬(lentil)、油菜(oilseedrape)、秋葵(okra)、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、西紅柿、南瓜(squash)、茶和藻類等。優(yōu)選的，植物為作物植物，諸如大豆、向日葵、卡諾拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草的作物植物。進(jìn)一步優(yōu)選地，植物為單子葉植物，例如甘蔗。更加優(yōu)選地，植物是谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、高粱或燕麥。I型DnaJ樣多肽的活性可以通過提高多肽的水平來增加?？蛇x的，當(dāng)I型DnaJ樣多肽的水平?jīng)]有改變，或者甚至是I型DnaJ樣多肽的水平降低時，也可以增加活性。這可以發(fā)生在當(dāng)多肽的內(nèi)在性質(zhì)改變時，例如通過制備比野生型多肽更活躍的突變體形式.本文提及的"優(yōu)先"增加活性意指在非脅迫條件下生長的植物細(xì)胞溶膠中I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性的乾向增加，該活性增加超過了在相當(dāng)條件下生長的野生型植物的細(xì)胞溶膠中發(fā)現(xiàn)的增加。本文所定義的術(shù)語"I型DnaJ樣多肽或其同源物"是指在其氯基末端包含CaaX基序的I型DnaJ樣多肽。所有DnaJ蛋白質(zhì)的共同點在于J結(jié)構(gòu)域的存在，其由大約70個#*酸組成(通常位于蛋白質(zhì)的氨基末端)并且在其中間包含高度保守的HPD三肽(InterPro參考IPR001623;Zdobnov等人，(2002)18(8):1149-50);由4個a螺旋組成的"J"結(jié)構(gòu)域與Hsp70蛋白質(zhì)相互作用。在擬南芥基因組中，已經(jīng)鑒定了至少89種包含J結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(Miernyk(2001)CellStress&Chaperones)。目前已經(jīng)鑒定了18種Hsp70蛋白質(zhì)。I型DnaJ結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(或DnaJ蛋白質(zhì))通過下列(從M末端到M末端)結(jié)構(gòu)域的存在來進(jìn)一步表征1)大約30個氨基酸殘基的G/F結(jié)構(gòu)域區(qū)域，其富含甘氨酸(G)和苯丙氨酸(F)，其用于調(diào)節(jié)靶標(biāo)多肽特異性；以及2)包含4個重復(fù)CXXCXGXG的富含Cys的鋅指結(jié)構(gòu)域，其中X代表了帶電或極性殘基；這4個重復(fù)片段成對作用來形成鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域I和II(InterPro參考IPR001305;Linke等人(2003)JBiolChem278(45):44457-44466);認(rèn)為鋅指結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)直接的蛋白質(zhì):蛋白質(zhì)相互作用并且更特異性的結(jié)合待遞送到Hsp70的非天然多肽；3)氯基末端結(jié)構(gòu)域(CTD;InterPro參考IPR002939)。在其天然形式(可以是可溶的或膜結(jié)合的形式)中，DnaJ蛋白質(zhì)可以耙向到多個亞細(xì)胞區(qū)室。用在本發(fā)明方法中的DnaJ蛋白質(zhì)是沒有信號序列或轉(zhuǎn)運肽的那些蛋白質(zhì)，并且因此主要位于植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中。用在本發(fā)明方法中的DnaJ蛋白質(zhì)是在其羧基末端包含CaaX基序的那些蛋白質(zhì)。此多肽因此以可溶的或膜結(jié)合的形式存在，每種形式的存在可以互換。使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)可以容易的鑒定"I型DnaJ樣多肽或其同源物，，。例如如在Zhou等人，(2000)，ProteinExpression&Purification19:253-258中描述的，可以容易的體外確定DnaJ對DnaK的ATP酶活性的刺激。DnaJ促進(jìn)DnaK和非天然多肽(如變性的熒光素酶)之間的復(fù)合物形成的能力可以通過ELISA確定(Fan等人，(2004)Molec.Biol.Cell15:761-773)。使用序列比對可以容易的鑒定出"I型DnaJ樣多肽或其同源物"。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:443-453)的算法來尋找兩個全序列的比對(使匹配數(shù)最大并且空位數(shù)最小)。BLAST算法(Altschul等人，(19卯)JMolBiol215:403-10)計算序列同一性百分比并且進(jìn)行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析。進(jìn)行BLAST分析的軟件是通過NationalCentreforBiotechnologyInformation公開可用的。I型DnaJ樣多肽的同源物和它們對SEQIDNO:2所代表的用在本發(fā)明方法中的I型DnaJ樣M酸序列的同一性百分比可以使用例如基于改良的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD，http:y7www.informaxinc.com)的VNTIAlignX多重對比程序(具有空位開放罰分以及空位延伸的缺省設(shè)置)來容易的鑒定。優(yōu)選的，在其氛基末端包含CaaX基序，并且在本發(fā)明方法中是有用的I型DnaJ樣多肽或其同源物與SEQIDNO:2具有一定的同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。術(shù)語"I型DnaJ樣多肽或其同源物"所包括的多肽實例列在表l中，為SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54和SEQIDNO:56。用來例示性說明本發(fā)明的I型DnaJ樣多肽序列由SEQIDNO:2所代表。表l:來自不同生物的編碼I型DnaJ樣多肽(蛋白質(zhì)SEQIDNO)的核酸(DNASEQID)實例__<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>Ceael—DNaJNM一07205SEQIDNO:47NP一50445SEQIDNO:48Caenorhabditisclcg肌sHomsa一HsJ2D13388SE(JIDNO:49P31689SE(JIDNO:50人(Homosapiens)Sacce一YDJlNC一001146SEQIDNO:51NP一01433SEQIDNO:52釀酒酵母(Saccharomycescereviseae)HomsaDNAJA2一NM005880SE(JIDNO:53NP一00587SE(JIDNO:54人MusmumDj3一固019794SEQIDNO:55Q9QYJ0SEQIDNO:56小鼠(Musmusculus)VT-有效翻譯；*具有小修正要理解落入"I型DnaJ樣多肽或其同源物"定義的序列不限于列在表1中的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54和SEQIDNO:56，而是在其^J^末端包含CaaX基序的任何I型DnaJ樣多肽均適合用于本發(fā)明方法中。因此，如本文定義的術(shù)語"I型DnaJ樣核酸/基因，，是編碼上述定義的I型DnaJ樣多肽或其同源物的任何核酸/基因。I型DnaJ樣核酸的實例包括列在表l中的那些，如SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53和SEQIDNO:55。I型DnaJ樣核^/基因及其變體適合用于本發(fā)明方法中。I型DnaJ樣核酸/基因的變體包括I型DnaJ樣核^/基因的部分，和/或能夠與I型DnaJ樣核酸/基因雜交的核酸。如本文定義的術(shù)語部分是指包含至少600個核苷酸的DNA片段，該部分編碼至少200個氨基酸的多肽，所述多肽從氨基末端到羧基末端包含DnaJ結(jié)構(gòu)域、富含G/F結(jié)構(gòu)域和富含Cys鋅指結(jié)構(gòu)域、CTD結(jié)構(gòu)域和CaaX基序。優(yōu)選的，該部分包含至少1050個核苷酸，編碼至少350個氨基酸的多肽，所述多肽從氨基末端到羧基末端包含DnaJ結(jié)構(gòu)域、富含G/F結(jié)構(gòu)域、富含Cys鋅指結(jié)構(gòu)域、CTD結(jié)構(gòu)域和CaaX基序。更優(yōu)選的，上述定義的部分是表1中SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53或SEQIDNO:55任一個所代表的核酸的部分。例如，通過對I型DnaJ樣核酸產(chǎn)生一個或多個缺失來制備部分。除去多核苷酸序列的一個實例包括編碼特異性亞細(xì)胞導(dǎo)向序列的序列，如線粒體或質(zhì)體導(dǎo)向序列。部分可以以分離的形式使用或它們可以融合到其他編碼(或非編碼)序列中，從而(例如)產(chǎn)生組合了一些活性的蛋白質(zhì)。當(dāng)融合到其他編碼序列時，翻譯產(chǎn)生的所得多肽可以大于為I型DnaJ樣片段所預(yù)測的。例如，可以將編碼法尼基化基序的寡核苷酸融合到編碼最初缺乏此基序的I型DnaJ樣多肽的I型DnaJ樣多核苷酸序列?？梢詫⒉糠秩诤系絀型DnaJ家族其他成員的編碼序列的其他部分，從而在2個最初I型DnaJ樣多肽之間互換結(jié)構(gòu)域。例如，一種I型DnaJ樣多肽的CTD結(jié)構(gòu)域可以與另一種i型DnaJ樣多肽的CTD結(jié)構(gòu)域交換。I型DnaJ樣核酸/基因的另一變體是能夠在降低的嚴(yán)格條件下(優(yōu)選在嚴(yán)格條件下)與本文上述定義的I型DnaJ樣核^/基因雜交的核酸，其中雜交序列至少編碼I型DnaJ樣多肽的J結(jié)構(gòu)域和富含Cys鋅指結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的，此類變體包含表現(xiàn)了I型DnaJ樣多肽特征的所有結(jié)構(gòu)域，從M末端到羧基末端的DnaJ結(jié)構(gòu)域、富含D/F結(jié)構(gòu)域、富含Cys鋅指結(jié)構(gòu)域和CTD結(jié)構(gòu)域，以及額外的CaaX基序。優(yōu)選的，雜交序列是能夠與下列代表的核酸，或者如本文上述定義的任何前述序列的部分雜交的序列表l的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53或SEQIDNO:55種任一個。本文所定義的術(shù)語"雜交"是基本同源的互補核苷酸序列相互退火的過程。雜交過程可以完全發(fā)生在溶液中，即互補核酸都在溶液中。雜交過程還可以如此進(jìn)行，即其中互補核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其他樹脂上。此外雜交過程還可以如此進(jìn)行，即其中互補核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術(shù)固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成等條件的影響。在諸如Southern雜交和Northern雜交的核酸雜交實驗中，"嚴(yán)格雜交條件"和"嚴(yán)格雜交洗滌條件"是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在雜交和洗滌中可以改變多種#，并且所述改變將保持或改變嚴(yán)格條件。Tm是在確定的離子強度和pH下，50%的目的序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。Tm依賴于溶液條件、威基組成以及探針的長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異雜交。雜交的最大速率是在Tm低于大約16'C到32匸下得到的。雜交溶液中一價陽離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥，從而促進(jìn)雜交體的形成；對于高達(dá)0.4M的鈉濃度，這個作用是明顯的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酰胺降低0.6至0.7。C，加入50%的甲酰胺雖然使雜交速率降低，但使雜交在30至45匸進(jìn)行。M對錯配降低了雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。一般對于大探針，每。/。g錯配使Tm降低大約rC。取決于雜交體的類型，1\可以使用下列公式計算1.DNA-DNA雜交體(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.,138:267-284，1984):Tm=81.5。C+16.6xlog[Na+r+0.41xo/o[G/Cb-500x[LT1-0.61x%甲酰胺2.DNA-RNA或RNA-RNA雜交體Tm=79.8+18.5(log10[NaY)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2畫820/Lc3.寡-DNA或寡-RNAd雜交體對于<20個核苷酸Tm=2(ln)對于20-35個核苷酸Tm=22+1.46(ln)a或?qū)τ谄渌粌r陽離子，但是僅僅在0.01"0.4M的范圍精確。b僅僅對30%至75%范圍的％GC精確。cL-雙鏈體中g(shù)對的長度。d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效長度=2乂(0/<:數(shù)目)+(~1數(shù)目)。注解對于每1%甲酰胺，Tm降低大約0.6至0.7匸，而6M尿素的存在降低Tm大約30匸。雜交的特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)。為了除去非特異性雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終^fc滌溶液的離子強度和溫度鹽濃度越低以及洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件一般在雜交嚴(yán)格性或低于雜交嚴(yán)格性下進(jìn)行。一般而言，用于核酸雜交試驗或基因擴增檢測方法的合適的嚴(yán)格條件如上所述。也可以選擇更高或更低的嚴(yán)格條件。一般而言，低嚴(yán)格條件選擇為比在確定的離子強度和pH下特異性序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約50匸。中等嚴(yán)格條件是當(dāng)溫度比Tm低20"C時，而高嚴(yán)格條件是當(dāng)溫度比Tm低10X:時。例如，嚴(yán)格條件是那些至少，例如條件A-L的嚴(yán)格性；并且簡化的嚴(yán)格條件是至少，例如條件M-R的嚴(yán)格性。非特異性的結(jié)合可以使用一些已知技術(shù)中的任一種(例如用含有蛋白質(zhì)的溶液將膜封閉，添加異源RNA、DNA和SDS到雜交緩沖液中，以及用RNA酶處理)來調(diào)控。雜交和洗滌條件的實例列在下列表2中。表2:雜交和洗滌條件的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>$"雜交體長度"是雜交核酸的預(yù)期長度。當(dāng)已知序列的核酸雜交時，可以通過比對序列和鑒別本文所述的保守區(qū)來確定雜交體長度。卞在雜交和洗脫緩沖液中可以用SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl、10mMNaH;jP04和1.25mMEDTA，pH7.4)代替SSC(lxSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后洗脫15分鐘。雜交和洗脫可以另外地包括5xDenhardt試劑、0.5-1.0%SDS、100jig/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉和高達(dá)50%甲酰胺。*Tb-Tr:對于預(yù)期長度少于50個g對的雜交體，雜交溫度應(yīng)該比雜交體的熔解溫度Tm低5-10'C,才艮據(jù)上述公式確定Tm。士本發(fā)明還包括用PNA或修飾的核酸取代任意一個或多個DNA或RNA雜交體配偶體。為了定義嚴(yán)格性水平的目的，通常參考Sambrook等人(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork或CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。I型DnaJ樣核酸或其變體可以來自任何天然或人工來源?？梢酝ㄟ^考慮周到的人為操作，從在組合物和/或基因組環(huán)境中的此核酸的天然形式修飾它。核酸是原核或真核來源的，來自^L生物來源如酵母或真菌，或來自植物、藻類或動物(包括人)來源。優(yōu)選的，核酸是真核來源的。核酸另外優(yōu)選是植物來源的，既可以來自相同的植物物種(例如與其要被引入的物種相同)又可來自不同的植物物種。核酸可以分離自單子葉植物物種，優(yōu)選來自禾本科(Poaceae)，更優(yōu)選來自稻。更優(yōu)選的，分離自稻的I型DnaJ樣核酸是由SEQIDNO:1所代表的并且I型DnaJ樣猛紗列是由SEQIDNO:2所代表的。I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性可以通過引入遺傳修飾(優(yōu)選在I型DnaJ樣基因的基因座中)來增加。本文中所定義的基因的基因座意指包括目的基因和編碼區(qū)上游或下游10kb的基因組區(qū)域。例如，遺傳修飾可以通過以下的任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點誘變、定向進(jìn)化和同源重組，或通過在植物細(xì)胞細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸，該I型DnaJ樣多肽在其J^末端包含CaaX基序。在引入遺傳修飾后，接下來的步驟是選擇在植物細(xì)胞溶膠中I型DnaJ樣多肽增加的活性，這種活性的增加使得植物在非脅迫條件下具有增加的植物產(chǎn)量。T-DNA激活標(biāo)簽(Hayashi等人，Science(1992),1350-1353)涉及在目的基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域上游或下游10KB中插入通常包含啟動子(也可以是翻譯增強子或內(nèi)含子)的T-DNA,如此構(gòu)型以便啟動子指引靼基因表達(dá)。通常，破壞靶基因天然啟動子對其的表達(dá)調(diào)控，而使該基因處于新引入的啟動子的控制之下。該啟動子一般嵌入到T-DNA中。例如，該T-DNA通過農(nóng)桿菌屬感染隨機插入到植物基因組中，并導(dǎo)致靠近該插入T-DNA的基因過量表達(dá)。由于接近引入的啟動子的基因過量表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動子可以是能指導(dǎo)基因在所需的生物體(在本案中為植物)中表達(dá)的任何啟動子。例如，組成型、組織偏好的、細(xì)胞類型特異性的以及誘導(dǎo)型啟動子都適合用于T-DNA激活。優(yōu)選的，啟動子是能夠在植物種子組織中推動基因表達(dá)的啟動子。也可以使用TILLING技術(shù)(靶向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù))，把遺傳修飾引入到I型DnaJ樣基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，可用于產(chǎn)生和/或鑒定，并最終分離能顯示DnaJ樣活性的I型DnaJ樣核酸誘變變體。TILLING還能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現(xiàn)出比該基因的天然形式所表現(xiàn)出的更高的DnaJ樣活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)合起來。TILLING—般遵循的步驟是:(a)EMS誘變(RedeiGP和KonczC(1992)InMethodsinArabidopsisResearch,KonczC，ChuaNH，SchellJ編著，新加坡，WorldScientificPublishingCo,第16~82頁；Feldmann等人，(1994)InMeyerowitzEM，SomervilkCR編著，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，第137-172頁；LightnerJ和CasparT(1998)InJMartinez曙Zapater,JSalinas編著,MethodsonMolecularBiology,第82巻.HumanaPress,Totowa，NJ，第91-104頁)；(b)DNA制備和個體合并；(c)目標(biāo)區(qū)域的PCR擴增；(d)變性和退火以允許形成異源雙^^體；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈體的存在檢測為色鐠圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個體；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測序。TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallum等人，(2000)NatBiotechnol18:455-457;Stemple(2004)NatRevGenet5(2):145-50綜述)。定點誘變可用于產(chǎn)生I型DnaJ樣核酸或其部分的變體。一些方法可用來實現(xiàn)定點誘變，最常用方法是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology，Wiley編著http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。由基因DNA改組的重復(fù)、隨后是適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇組成的定向進(jìn)化也可以用來生成下列的變體編碼具有增加的生物學(xué)活性的I型DnaJ樣多肽、或其同源物、或其部分的I型DnaJ樣核酸或其部分(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;美國專利5,811,238和6,395,547)。T-DNA激活、TILLING、定點誘變和定向進(jìn)化是能夠產(chǎn)生新的等位基因和I型DnaJ樣變體的技術(shù)實例。同源重組能夠在基因組的指定選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中通常使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于較低等的生物如酵母或苔蘚physcomitrella。用于在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等人，19卯EMBOJ.9(10):3077-84)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002)NatBiotech20(10):1030-4;Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2):132-8)。例如，待乾向的核酸(其可以是如上文所定義的I型DnaJ樣核酸或其變體)靶向到I型DnaJ樣基因的基因座。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替換內(nèi)源基因，或另外引入到內(nèi)源基因中。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，可以通過在植物細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸來增加植物產(chǎn)量，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序。引入遺傳修飾(在本案中不需要在I型DnaJ樣基因的基因座中)的優(yōu)選的方法是在植物細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的外源核酸，該外源I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序。待引入到植物中的核酸可以是如前文所定義的全長核酸，或可以是如前文所定義的部分或雜交序列。本文定義的術(shù)語"外源"是指分離的基因/核酸，其可以是來自相同或不同的植物物種，例如根據(jù)上述定義，在稻植物中引入和/或表達(dá)的分離的稻基因/核酸是"外源的"。蛋白質(zhì)的"同源物"包含相對所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有^J^酸取代、缺失和/或插入，并且具有與它們所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)類似的生物學(xué)和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。要產(chǎn)生此類同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以用其他具有相似性質(zhì)(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或斷裂cc-螺旋結(jié)構(gòu)或P-片層結(jié)構(gòu)的傾向性)的氨基酸代替。保守取代表為本領(lǐng)域眾所周知(例如見Creighton(1984)Proteins,W.H.FreemanandCompany),下表3給出了保守M酸取代的實例。表3:保守性M酸取代的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>同源物包括直系同源物和旁系同源物，它們涉及用于描迷基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。旁系同源物是在相同物種中通過祖先基因復(fù)制產(chǎn)生的基因，而直系同源物是不同生物體中因物種形成所致的基因。例如，單子葉植物物種中的直系同源物可以通過實施所謂的交互blast搜索很容易地找到。這可以通過第一次blast完成，其包括在任何序列數(shù)據(jù)庫，如可在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可用的NCBI數(shù)據(jù)庫中，對所討論的序列(例如，SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)進(jìn)行blast。當(dāng)起始于核苷酸序列時可以使用BLASTN或TBLASTX(使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值)，并且當(dāng)起始于蛋白質(zhì)序列時可以使用BLASTP或TBLASTN(使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值)。可選的過濾blast結(jié)果。之后將過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長序列對所討論的序列來源的生物序列進(jìn)行反向BLAST(第二次BLAST)(其中所討論序列是SEQIDNO:l或SEQIDNO:2，則第二次blast應(yīng)當(dāng)針對稻序列)。然后對第一次和第二次BLAST的結(jié)果進(jìn)行比較。如果第二次blast的高級別目標(biāo)(hit)是來自與所討論序列來源物種相同的物種，則鑒定了旁系同源物；如果高級別目標(biāo)不是來自與所討論序列來源物種相同的物種，則鑒定了直系同源物。高級別目標(biāo)是具有低E值的那些。E值越低，分?jǐn)?shù)越顯著(或者換句話說，偶然發(fā)現(xiàn)目標(biāo)的機會越低)。E值的計算是本領(lǐng)域熟知的。在大家族的情況下，使用ClustalW，接著使用相鄰連接樹以幫助觀察相關(guān)基因的聚類并且鑒定直系同源物和旁系同源物。同源物可以是蛋白質(zhì)"取代變體"的形式，即其中^JJ^列中的至少一個殘基已經(jīng)被除去，并且不同的殘基插入到它的位置上。M酸取代一般是單殘基的，但是取決于對多肽構(gòu)成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約1到10個M酸殘基。優(yōu)選的，M酸取代包括保守性M酸取代。同源物還可以是蛋白質(zhì)的"插入變體"的形式，即將其中一個或多個氨基酸殘基引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點。插入可包括氨基末端和/或氯基末端的融合，以及單個或多個Jl基酸的序列內(nèi)插入。通常，M酸序列內(nèi)的插入將小于氬基末端或羧基末端的融合，約為1到10個殘基的數(shù)量。M末端或羧基末端融合蛋白質(zhì)或肽的實例包括如用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(釣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的同源物的特征在于從該蛋白質(zhì)除去一個或多個氨基酸。此類缺失變體的一個實例是從I型DnaJ樣蛋白質(zhì)中移除線粒體或質(zhì)體的導(dǎo)向序列，否則其會靶向到這些器官。使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以很容易的制備蛋白質(zhì)的氨基酸變體。對DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)、快速變換的定點誘變(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點誘變或其他定點誘變方案。I型DnaJ樣多肽或其同源物可以是衍生物。"衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與蛋白質(zhì)天然存在形式的M酸序列相比，例如，如SEQIDNO:2所示的，其可以包括天然和非天然存在氨基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質(zhì)的"衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與多肽天然存在形式的M酸序列相比，其可以包括天然存在的改變的、糖基化的、?；?、異戊二烯化的氨基酸殘基或非天然存在的氛基酸殘基。與其所;時生自的M酸序列相比，衍生物還可包括一個或多個非M酸取代基，例如與M酸序列共價或非共價結(jié)合的報道分子或其他配體，如結(jié)合以便于其檢測的報道分子，以;M目對于天然存在蛋白質(zhì)的M酸序列而言非天然存在的氛基酸殘基。I型DnaJ樣多肽或其同源物可以是I型DnaJ樣核^/基因的可變的剪接變體所編碼的。本文所用的術(shù)語"可選擇的剪接變體"涵蓋這樣的核酸序列變體，即其中選定的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)切除、置換或添加，或者其中內(nèi)含子已經(jīng)縮短或延長。這類變體是其中蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性保持的那些變體，其可以通過選擇性的保留蛋白質(zhì)的功能片段來獲得。此類剪接變體可以是天然發(fā)現(xiàn)的或可以是剪接變體，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序，特別是SEQIDNO:1的剪接變體。同源物還可以是由編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸的等位變體所編碼的，所述等位變體優(yōu)選是SEQIDNO:1所代表的核酸的等位變體。更優(yōu)選的，等位變體編碼的多肽是I型DnaJ樣多肽或其同源物，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序。等位變體天然存在，并且包括在本發(fā)明方法中的是這些天然等位基因的用途。等位變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)性品系中SNP和INDEL形成了最大的一類序列變體。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，設(shè)想了I型DnaJ樣核酸或其變體的增強或增加的表達(dá)。得到基因或基因產(chǎn)物增強或增加的表達(dá)的方法詳細(xì)記錄在本領(lǐng)域中并且包括例如適當(dāng)啟動子驅(qū)動的過量表達(dá)，轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子的使用?？梢詫⒆饔脼閱幼踊蛟鰪娮釉姆蛛x的核酸引入至多核苷酸非異源形式的適當(dāng)位置上(一般為上游)，從而上調(diào)I型DnaJ樣核酸或其變體的表達(dá)。例如，可以通過突變、缺失和/或取代來體內(nèi)改變內(nèi)源啟動子(參見Kmiec，美國專利5,565,350號；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以將分離的啟動子以適當(dāng)?shù)姆较蚝团c本發(fā)明基因的距離引入植物細(xì)胞中，從而調(diào)控基因的表達(dá)。如果希望多肽表達(dá)，通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3，-端包含聚腺苷酸化區(qū)域。聚腺苷酸化區(qū)域可以來自天然基因、來自多種其他植物基因或來自T-DNA。待添加的3，端序列可以來自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因，或可選的來自其他植物基因，或較小優(yōu)選的來自任何其他真核基因。還可以將內(nèi)含子序列添加到部分編碼序列的5，非翻譯區(qū)或編碼序列以增加在細(xì)胞溶膠中聚集的成熟信息的量。已經(jīng)表明在植物和動物表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接的內(nèi)含子，能在mRNA和蛋白質(zhì)水平上^^因表達(dá)增加達(dá)1000倍，Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8，4395-4405(1988);Callis等人，GenesDev.1，1183-1200(1987))。當(dāng)將內(nèi)含子置于轉(zhuǎn)錄單位的5，端附近時，基因表達(dá)的此類內(nèi)含子增強通常是最大的。本領(lǐng)域已知玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6,Bronze-l內(nèi)含子的用途?？傮w上參見TheMaizeHandbook,116章，F(xiàn)reeling和Walbot編著，Springer,N.Y.(1994)。本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體和載體以便于引入和/或表達(dá)用在本發(fā)明方法中的核苷酸序列。因此，提供了基因構(gòu)建體，其包含(i)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序；以及(ii)一種或多種能夠驅(qū)動(i)的核酸序列表達(dá)的調(diào)控序列；以及任選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明還提供了如本文所定義的構(gòu)建體的用途，其用于在非脅迫條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量的方法中?？捎糜诒景l(fā)明方法的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建?；驑?gòu)建體可插入到載體中，該載體可以是商購的，適于轉(zhuǎn)化到植物中并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因.植物使用包含目的序列(即編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，所述多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序)的載體轉(zhuǎn)化。目的序列與一個或多個調(diào)控序列(至少與啟動子)有效連接。術(shù)語"調(diào)節(jié)元件"、"調(diào)控序列"和"啟動子"在文中都可以互換^f吏用，且應(yīng)當(dāng)取其廣義，是指能影響與它們連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。上述術(shù)語包括來TATA框，帶或不帶CCAAT框序列)以及根據(jù)發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強子和沉默子)。該術(shù)語還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在這種情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列.術(shù)語"調(diào)節(jié)元件"也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)，激活或增強這種表達(dá)。本文所用的術(shù)語"有效連接"指啟動子序列與目的基因之間的功能性連接，使得啟動子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。有利的，任何類型的啟動子(無論天然或合成)可以用于驅(qū)動核酸序列的表達(dá)。優(yōu)選的，啟動子是組織特異性啟動子，即能夠在某些組織(如葉、根、種子組織等)中優(yōu)先啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子。來自植物的啟動子是特別優(yōu)選的，特別是來自植物的組織特異性啟動子。如本文定義的術(shù)語"組織特異性"是指在至少一種植物組織或器官中優(yōu)勢表達(dá)的啟動子，但是由于滲漏啟動子表達(dá)，其在植物的別處也具有殘余表達(dá)。更優(yōu)選的，組織特異性啟動子是種子特異性啟動子，更特別是分離自編碼種子貯藏蛋白質(zhì)的基因的啟動子，特別是胚乳特異性啟動子。最優(yōu)選的，胚乳特異性啟動子分離自谷醇溶蛋白基因，如SEQIDNO:57所代表的稻谷醇溶蛋白RP6(Wen等人，(1993)PlantPhysiol101(3):1115-6)啟動子，或類似強度的啟動子和/或具有與稻谷醇溶蛋白啟動子類似表達(dá)模式的啟動子。例如，通過將啟動子與報il&因結(jié)合并且檢測報it^因在植物組織中的功能來分析類似強度和/或類似表達(dá)模式。一個熟知的報道基因是p-葡糖醛酸糖苷酶，并且比色的GUS染色用來觀察植物細(xì)胞中的p-葡糖醛酸糖苷酶。要明確本發(fā)明的應(yīng)用不限于SEQIDNO:1所代表的I型DnaJ樣核酸，本發(fā)明的應(yīng)用也不限于當(dāng)谷醇溶蛋白啟動子驅(qū)動時I型DnaJ樣核酸的表達(dá)。種子特異性啟動子的實例示于表4，該啟動子或其衍生物可以用于實施本發(fā)明方法。要理解下列實例不是窮舉的。表4:用于本、發(fā)明中的種子特異性啟動子的實例<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>任選的，一個或多個終止子序列也可用在引入植物的構(gòu)建體中。術(shù)語"終止子"包括調(diào)控序列，其是位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，標(biāo)志初級轉(zhuǎn)錄物的3'加工和聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。其他調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強子以及翻譯增強子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉適合用于實施本發(fā)明的終止子和增強子序列。此類序列是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易的獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需要的復(fù)制起點序列。一個實例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為附加型基因元件(如質(zhì)?；蛭塘７肿?維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點包括但不局限于fl-ori和colEl。遺傳構(gòu)建體任選地可包含選擇標(biāo)記基因。本文所用的術(shù)語"選擇性標(biāo)記基因，，包括賦予表達(dá)該基因的細(xì)胞以表型，以便于鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何基因。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的新陳代謝性狀或允許可視選擇。選擇標(biāo)記基因的實例包括能賦予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的叩tll,或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)。可視標(biāo)記基因?qū)е骂伾男纬?例如P-葡糖苷酸酶，GUS)、發(fā)光(如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。本發(fā)明還包括通過本發(fā)明方法獲得的植物和植物部分。本發(fā)明因此提供了可通過本發(fā)明方法獲得的植物或植物部分，該植物已經(jīng)在其中引入了編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其M末端包含CaaX基序。本發(fā)明還提供了制備在非脅迫條件下生長時具有增加的植物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其氛基末端包含CaaX基序。更具體的，本發(fā)明提供了制備具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包4舌(i)在植物、植物部分或植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其M末端包含CaaX基序；以及(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的非脅迫條件下栽培植物、植物部分或植物細(xì)胞。核酸可以直接引入到植物細(xì)胞或植物本身中(包括引入到植物的組織、器官或任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，核酸優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化引入植物中。本文所涉及的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括把外源多核苷酸向宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，而不管轉(zhuǎn)移所用的方法如何。無論是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠l^克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并從其再生出整林植物。選擇的特定組織將基于可用且最適于待轉(zhuǎn)化的特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而不同。例示性的靶標(biāo)組織包括葉圓盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、胼胝體組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋芽和才艮分生組織)以及i秀導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時或穩(wěn)定的被引入到宿主細(xì)胞中，并可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒?？蛇x擇的，它可以整合到宿主基因組中。以本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方式，之后所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可用來再生轉(zhuǎn)化植物。植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利的，任何轉(zhuǎn)化方法都可用于將目的基因引入到合適的祖細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的鉀/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn)A等人，(1982)Nature296，72-74;Negrutiul等人，(1987)，PlantMol.Biol.8，363-373);原生質(zhì)體的電穿孔(ShillitoRD等人，1985Bio/Technol3，1099-1102);顯微注射到植物材料中(CrosswayA.等人，(1986)，Mol.Gen.Genet.202，179-185);DNA或RNA包被顆粒轟擊(KleinTM等人，(1987)，Nature327，70);用(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何用于稻轉(zhuǎn)化的已知方法，通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生表達(dá)I型DnaJ樣核^/基因的轉(zhuǎn)基因稻植物，所迷的方法例如在任何以下文獻(xiàn)中描述的方法公開的歐洲專利申請EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta199，612-617，1996);Chan等人(PlantMolBiol22(3):491-506，1993)，Hiei等人(PlantJ.6(2):271-282，1994)，其/>開的內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。在谷類轉(zhuǎn)化情形下，優(yōu)選的方法如Ishida等人(NatBiotechnol14(6):745-50，1996)或Frame等人(PlantPhysiol129(1):13-22，2002)所述，其公開的內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。通常在轉(zhuǎn)化以后，選擇存在有與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因所編碼的一個或多個標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，接著將轉(zhuǎn)化的材料再生成整林植物。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評價推定轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)，例如使用Southern分析?？蛇x的或另外的，新引入DNA的表達(dá)水平可使用Northern和/或Western分析進(jìn)行監(jiān)控，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可通過多種方法進(jìn)行繁殖，如通過無性繁殖或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自花授精以產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物可進(jìn)一步通過經(jīng)典的育種技術(shù)進(jìn)行繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以是多種形式的。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有的細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖被嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中)。本發(fā)明顯然延及由文中描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明還延及嚢括由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整林植物的后代，唯一的要求是該一種或多種基因型和/或表型特征。本發(fā)明還包括含有分離的I型DnaJ樣核酸或其變體的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞.本發(fā)明還延及植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實、花、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和鱗莖。本發(fā)明另外涉及(優(yōu)選直接)來自此類植物的可收獲部分的產(chǎn)物，此類產(chǎn)物包括干的顆粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涵蓋I型DnaJ樣核酸或其突變體的用途，以及I型DnaJ樣多肽或其變體的用途，該I型DnaJ樣多肽或其同源物在其^&末端包含CaaX。一種此類用途涉及增加植物產(chǎn)量，特別是如上所定義的增加產(chǎn)量。I型DnaJ樣核酸或其變體，或I型DnaJ樣多肽或其同源物可以用在育種方案中，其中鑒定了與I型DnaJ樣基因或其變體遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。I型DnaJ樣核酸基因或其變體，或I型DnaJ樣多肽或其同源物可以用來定義分子標(biāo)記。之后可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記用在育種方案中以選擇具有增加的植物產(chǎn)量的植物，I型DnaJ樣基因或其變體可以是例如由表l的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53或SEQIDNO:55中任一個所代表的核酸。還發(fā)現(xiàn)I型DnaJ樣核^/基因的等位變體在標(biāo)記輔助的育種方案中的用途。此類育種方案有時需要通過植物的誘變處理引入等位變異，例如使用EMS誘變；可選的，該方案可以開始于收集無意引起所謂"天然"來源的等位變體。之后通過例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。接著是選擇步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，并且其提供植物的增加產(chǎn)量。通常通過監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體的植物的產(chǎn)量特性來進(jìn)行選擇，所述的所討論序列的等位變體如表1的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53或SEQIDNO:55中任一個的不同等位變體。監(jiān)控生長特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外任選的步驟包括使已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一種植物雜交。例如，這可用于產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合.I型DnaJ樣核酸或其變體還可用作探針，以對基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的一部分性狀和標(biāo)志.此類信息可用于植物育種，以開發(fā)具有所需表型的品系。I型DimJ樣核酸或其變體的此類用途僅需要長度至少為15個核苷酸的核酸序列。I型DnaJ樣核酸或其變體可用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF和ManiatisT(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual)可使用I型DnaJ樣核酸或其變體進(jìn)行探測。然后可以使用計算機程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1:174-181)對所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖鐠。此外，該核酸可用于探測Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和確定的遺傳雜交后代的一組個體的限制酶處理的基因組DNA。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用來計算I型DnaJ樣核酸或其變體在之前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中植物基因來源的探針的制備和用途在Bematzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4:37-41中描述。眾多出版物描述了使用上述方法或其變通形式對特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，F(xiàn)2雜交群體、回交群體、隨機交配群體、近親同基因系及其他的個體組可用于作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。核酸探針也可用于物理作圖(即，序列置于物理圖上；參見Hoheisd等人,在Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個實施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。雖然現(xiàn)在的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾kb到幾百kb;參見Laan等人(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖?；诤怂釘U增的多種遺傳和物理作圖方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR擴增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等人(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實施這些方法，使用核M列設(shè)計和制備引物對，以用于擴增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。此類引物的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在采用基于PCR的遺傳作圖方法中，有必要鑒定跨越了對應(yīng)于此核酸序列區(qū)域作圖的親代之間的DNA序列差異。但是，這對作圖方法通常不是必要的。實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生如上所述，具有在非脅迫條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量的植物。此增加的植物產(chǎn)量還可與其他經(jīng)濟學(xué)上有利的性狀組合，如進(jìn)一步增產(chǎn)性狀、對多種脅迫的耐受性、修飾多種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀。本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中圖l顯示了I型DnaJ樣多肽的典型結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。J結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的氛基末端并且編碼包含高度保守的HPD三肽的HSP70結(jié)合結(jié)構(gòu)域。富含甘氨酸和苯丙氨酸的G/F結(jié)構(gòu)域是Hsp陪伴分子活性的特異性靶標(biāo)蛋白質(zhì)。四個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域參與鋅的配位，每個I型DnaJ單體與2個鋅離子。CTD結(jié)構(gòu)域是定義的四個結(jié)構(gòu)域中較不保守的，并且可以包含法尼基化基序CaaX。圖2顯示了表1的一些I型DnaJ樣蛋白質(zhì)的多重比對，其使用基于改良的ClustalW算法(InforMax，Bethesda，MD，http:〃www.informaxiiic.com)的VNTIAlignX多重對比程序(具有空位開放罰分10以及空位延伸0.05的缺省設(shè)置)。J結(jié)構(gòu)域是雙下劃線的，其四個螺旋是灰色框表示的并且其保守的HPD三肽是框起來的。G/F結(jié)構(gòu)域是用有點的下劃線的。兩個鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域I和II以及它們保守的CxxCxGxG是框起來的。在CTD結(jié)構(gòu)域中，法尼基化基序是框起來的。圖3顯示了下表中公開的擬南芥I型DnaJ樣多肽的比對。J結(jié)構(gòu)域是雙下劃線的，G/F結(jié)構(gòu)域是黑體下劃線的，兩個鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域I和II以及它們保守的CxxCxGxG是框起來的，并且CTD是單下劃線的。蛋白質(zhì)羧基末端的法尼基化基序CaaX當(dāng)存在時是黑體表示的。在J結(jié)構(gòu)域前的氨基酸序列(由括號分開，大約位置)代表亞細(xì)胞導(dǎo)向序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>圖4顯示了用于在稻中表達(dá)受到谷醇溶蛋白啟動子(內(nèi)在參考PROOO卯)調(diào)控的稻I型DnaJ樣(內(nèi)在參考CDS1877)的二元載體。圖5詳述了用于實施本發(fā)明方法的多核苷酸(從起點到終點)和多肽序列的實例。實施例本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下實施例進(jìn)行描述，其僅僅是為了例證說明，DNA操作除非另外說明，否則重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols的巻1和2中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.DCroy的PlantMolecularBiologyLabfase(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版，實施例l:基因克隆使用稻幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley,UK)作為模板，PCR擴增稻I型DnaJ樣基因(CDS1877)。反轉(zhuǎn)錄從幼苗提取的RNA后，把cDNA克隆到pCMVSport6.0中。文庫的平均插入大小為1.6kb，并且克隆的原始數(shù)為1.67x107cfu。原始滴度確定為3.34x106cfu/ml，并且在笫一輪擴增以后變成6xl010cfu/ml。質(zhì)粒提取以后，200ng的模板用于50jilPCR混合物中。包含用于Gateway重組的AttB位點的引物prm04266(SEQIDNO:58;有義，起始密碼子為黑體，AttBl位點是斜體5，GGGG^C^4GnTC7^C4A4A^GC4CGCTTCACAATGTACGGACGCATGCC3，)和prm04267(SEQIDNO:59;反向互補，終止密碼子是黑體，AttB2位點為斜體5，GGGGL4CC4C7TrG7^CA40^J(CrGGGrCCATCGAATTGTTCTTACTGC3，)用于PCR擴增。使用HifiTagDNA聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。同樣使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴增和純化1340bp的PCR片段(包括attB位點)。然后進(jìn)行Gateway方法的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間，PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生"iiA克隆(entryclone)"p04452(才艮據(jù)Gateway術(shù)語)。質(zhì)粒pDONR201作為Gatewaytechnology的一部分購自Invitrogen。實施例2:載體構(gòu)建繼之在LR反應(yīng)中使用進(jìn)入克隆p04452和用于稻轉(zhuǎn)化的指定載體p00830。該載體包含位于T-DNA邊界內(nèi)的以下部分作為功能性元件植物選擇性標(biāo)記；可篩選標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到進(jìn)入克隆中的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于胚乳特異性表達(dá)的稻RP6谷醇溶蛋白啟動子(PR00090)(SEQIDNO:57;Wen等人，(1993)PlantPhysiol101(3):1115-6)位于該Gateway盒的上游。LR重組步驟之后，將得到的表達(dá)載體p072(圖4)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌屬菌林LBA4404中，并且隨后轉(zhuǎn)化稻植抹。使轉(zhuǎn)化的稻植林生長，然后檢驗實施例3中所述的參數(shù)。實施例3:受到稻RP6啟動子調(diào)控的I型DnaJ樣的評估和結(jié)果產(chǎn)生了大約15到20個獨立的TO稻轉(zhuǎn)化體。將初級轉(zhuǎn)化體從癥且織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到溫室中生長，并收獲T1種子。5個事件得以保留，其中T1后代發(fā)生3:1的轉(zhuǎn)基因存在/缺乏分離。對于這些事件中的每一個，通it監(jiān)控可視標(biāo)記表達(dá)，選擇了大約10個包含轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(雜合子和純合子)，以及大約10個缺乏轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(失效合子)。將4個Tl事件在T2代中使用與Tl代相同的評價方法進(jìn)行進(jìn)一步評估，但是不必是每個事件更多個體。統(tǒng)計學(xué)分析F-檢驗兩因子的ANOVA(可變性分析)用作統(tǒng)計模型，用于植物表型特征的綜合評價。對用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植抹的所有測量參數(shù)進(jìn)行F檢驗。進(jìn)行F檢驗以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的作用，并檢驗基因的總效應(yīng)，亦稱之為整體基因效應(yīng)。真實整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F檢驗的5。/。概率水平。顯著的F檢驗值顯示基因效應(yīng)，意味著不僅僅U因的存在或位置引起表型的差異。由于進(jìn)行了具有重疊事件的兩個實驗，除分析上述外還進(jìn)行組合分析。這可用于檢查兩個實驗中作用的一致性，如果在這種情形下，其可用于從兩個實驗中收集證據(jù)，則增加結(jié)論的可信性。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多級結(jié)構(gòu)(即實驗-事件-分離子)的混合模型方法。通過對比卡方分布的似然比值檢驗得到p值。3.1種子相關(guān)的^L測量收獲成熟的初級圓錐花序、裝袋并貼上條碼標(biāo)簽，然后在37'C烤箱中干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒，收集所有的種子并且計數(shù)。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿外殼和空外殼分開。丟棄空外殼，并對保留的部份再次計數(shù)。在分析天平上稱量飽滿的外殼。通過計數(shù)分離步驟之后保留的飽滿外殼的數(shù)目確定飽滿的種子數(shù)。通過稱量從植物收獲的所有飽滿外殼來測量總種子產(chǎn)量。每林植林的總種子數(shù)是通過計數(shù)收獲自植物的外殼數(shù)來測量的。將本發(fā)明的收獲指數(shù)定義為總種子產(chǎn)量和地上面積(mm、的比乘以因子106。3.2地上面積植物地上面積通過計數(shù)排除背景后地上植物部分圖像的像素總數(shù)測定。這個值為在同一時間點從不同角度拍攝的圖像的平均數(shù)，并通過校準(zhǔn)將其轉(zhuǎn)化為以平方毫米表示的物理表面值。實驗顯示，這種方式測定的地上植物面積與植物的生物量相關(guān)。下列結(jié)果的表(表5)顯示了轉(zhuǎn)基因與相應(yīng)的失效合子的收獲指數(shù)之間的百分比差異。進(jìn)行組合分析證實了兩個實驗作用的一致性，并且因此增加了結(jié)論的可信性。表5:收獲指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>權(quán)利要求1.相對于在非脅迫條件下生長的對應(yīng)野生型植物的產(chǎn)量，增加在相當(dāng)條件下生長的植物的植物產(chǎn)量的方法，其包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性，以及任選的選擇具有增加的產(chǎn)量的植物，其中所述I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述增加的活性通過優(yōu)選在編碼所述I型DnaJ樣多肽或其同源物的基因的基因座中引入遺傳修飾實現(xiàn)。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾通過定點誘變、定向進(jìn)化、同源重組、TILLING和T-DNA激活之一實現(xiàn)。4.相對于在非脅迫條件下生長的對應(yīng)野生型植物的產(chǎn)量，增加在相當(dāng)條件下生長的植物的植物產(chǎn)量的方法，其包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)外源I型'DnaJ樣核酸或其變體，所述核酸編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物，所述多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述I型DnaJ樣核酸或其變體是原核或真核來源的，優(yōu)選是真核來源的，更優(yōu)選所述I型DnaJ樣核酸或其變體是植物來源的，如單子葉植物，所述核酸優(yōu)選來自禾本科，更優(yōu)選來自稻。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中所述I型DnaJ樣核酸或其變體與種子特異性啟動子有效連接。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述種子特異性啟動子是胚乳特異性啟動子。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胚乳特異性啟動子是稻谷醇溶蛋白RP6啟動子。9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項的方法，其中所述增加的植物產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量，優(yōu)選是增加的收獲指數(shù)。10.通過權(quán)利要求1到9中任一項的方法得到的植物。11.構(gòu)建體，其包含(i)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，所述I型DnaJ樣多肽或其同源物在其羧基末端包含CaaX基序；以及(ii)一種或多種驅(qū)動(i)的核酸序列表達(dá)的調(diào)控序列；以及任選的(m)轉(zhuǎn)錄終止序列。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列是種子特異性啟動子。13.根據(jù)權(quán)利要求12的構(gòu)建體，其中所述種子特異性啟動子是胚乳特異性啟動子。14.根據(jù)權(quán)利要求13的構(gòu)建體，其中所述胚乳特異性啟動子是稻谷醇溶蛋白RP6啟動子。15.用權(quán)利要求11到14中任一項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。16.產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物、植物部分或植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中引入和/或表達(dá)編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物的核酸或其變體，所述I型DnaJ樣多肽或其同源物在其氣基末端包含CaaX基序；以及(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的非脅迫生長條件下栽培植物、植物部分或植物細(xì)胞。17.在非脅迫生長條件下具有增加的產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，所述增加的產(chǎn)量通過在所述植物中引入和/或表達(dá)I型DnaJ樣核酸或其變體產(chǎn)生，其中所述I型DnaJ樣核酸編碼I型DnaJ樣多肽或其同源物，所述I型DnaJ樣多肽或其同源物在其g末端包含CaaX基序。18.根據(jù)權(quán)利要求10、15或17的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或者其中植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、小米、黑麥、燕麥或高粱。19.才艮據(jù)權(quán)利要求10、15、17或18中任一項的植物的可收獲部分。20.產(chǎn)物，其來自，優(yōu)選直接來自權(quán)利要求18的植物和/或權(quán)利要求19的植物可收獲部分。21.根據(jù)權(quán)利要求19的可收獲部分，和/或根據(jù)權(quán)利要求20的來自或直接來自植物的產(chǎn)物，其中所述可收獲部分是種子。22.I型DnaJ樣核^/基因或其變體的用途，或者I型DnaJ樣多肽或其同源物的用途，其用于在非脅迫生長條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量。23.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述植物產(chǎn)量是增加的種子產(chǎn)量，優(yōu)選是增加的收獲指數(shù)。24.根據(jù)權(quán)利要求11到14中任一項的構(gòu)建體的用途，其用于在非脅迫生長條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量。25.I型DnaJ樣核^/基因或其變體的用途，或I型DnaJ樣多肽或其同源物的用途，其用作分子標(biāo)記。全文摘要本發(fā)明涉及相對于在非脅迫生長條件下生長的對應(yīng)野生型植物，在相當(dāng)條件下生長的植物中增加植物產(chǎn)量的方法，該方法包括在植物細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中優(yōu)先增加I型DnaJ樣多肽或其同源物的活性。此類方法中的一種包括在植物、植物部分或植物細(xì)胞中引入和/或表達(dá)I型DnaJ樣核酸或其變體。本發(fā)明還涉及在非脅迫條件下生長已經(jīng)在其中引入和/或表達(dá)了I型DnaJ樣核酸或其變體的轉(zhuǎn)基因植物，該植物相對于在相當(dāng)條件下生長的對應(yīng)野生型植物具有增加的植物產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及可用在本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。文檔編號A01H5/00GK101128590SQ200580048634公開日2008年2月20日申請日期2005年12月23日優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司