專利名稱：一種含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物農(nóng)藥領(lǐng)域，涉及一種含有銀杏酸的高效低毒的殺螺制劑，主要用于殺滅血吸蟲病的唯一中間宿主—釘螺，防止血吸蟲病的傳播。
背景技術(shù)：
血吸蟲的毛蚴侵入螺體后可以發(fā)育成母胞蚴，從而在螺體中成千上萬倍地增殖，不斷產(chǎn)生出尾蚴于水中或潮濕土表，以至感染人和其他動物，如此周而復(fù)始促成了血吸蟲病的蔓延和擴(kuò)散。釘螺(Oncomelania hupensis，O.hupensis)是傳播我國廣為流行的血吸蟲病的唯一中間宿主。消滅釘螺可切斷血吸蟲的傳播途徑。所以，殺滅釘螺是國際公認(rèn)的防止血吸蟲病的重要措施。
血吸蟲病流行于溫帶、亞熱帶、熱帶地區(qū)。2001年WHO估計，全球感染血吸蟲病的人口約為2億人，有6億人口受到威脅，有76個國家受影響，其中絕大多數(shù)為發(fā)展中國家，該疾病已嚴(yán)重危害了這些國家人民的健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。我國曾經(jīng)對血吸蟲病進(jìn)行過大規(guī)模防治，使該病的流行得到有效控制。但近年來，由于某些原因，血吸蟲病開始反彈。2004年我國《全國預(yù)防控制血吸蟲病中長期規(guī)劃綱要》中指出，現(xiàn)仍有7個省、110個縣有血吸蟲病流行，血吸蟲病患者約為84.3萬人。流行區(qū)總?cè)丝诩s為一億人，有螺面積達(dá)3787km2。例如，湖南洞庭湖湖區(qū)幾乎均有釘螺，已禁止游泳，沿湖的岳陽、常德、益陽地區(qū)均是重災(zāi)區(qū)。因此，對血吸蟲病的防治成為國家可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略目標(biāo)之一。
化學(xué)滅螺仍然是消滅或減少血吸蟲病感染和傳播的最快捷而有效的方法之一。
迄今，使用化學(xué)合成殺螺劑是控制釘螺的主要手段。五氯酚鈉曾被許多國家使用，滅螺效果好，但對非靶生物，尤其是魚蝦養(yǎng)殖類具廣譜毒性，并造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，早已被國際社會列為禁用品。氯硝柳胺(Niclosamidum)滅螺效果很好，是世界衛(wèi)生組織唯一推薦使用的殺螺劑，但價格昂貴，在發(fā)展中國家大面積使用受到限制；它對魚類等水生生物毒性大，被禁止在有水生生物的養(yǎng)殖水域使用，從而在應(yīng)用范圍上受到限制。而且，它不能有效防止釘螺的上爬，以逃逸殺傷，并還可導(dǎo)致靶生物的抗藥性增高。
鑒于化學(xué)合成殺螺劑的弊端，國際社會對研發(fā)天然、植物來源的殺螺劑給予了極大關(guān)注。因此，研究開發(fā)滅螺效果好、成本較低、可生物降解的新型滅螺劑具有其必要性和緊迫性。中國科學(xué)院武漢植物研究曾從薯蕷植物根莖中提取制備了DZ植物殺螺劑，(中國專利號ZL97109214.1)。
銀杏(Ginkgo biloba L.)是我國的珍貴樹種，我國銀杏資源占世界總量的70％以上。銀杏葉、果均能入藥。銀杏葉中的銀杏黃酮類和銀杏內(nèi)酯類對心、腦血管系統(tǒng)疾病具有顯著的療效，以其為主要藥效成分開發(fā)成的銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)已成為國際市場上銷售量最大的植物藥。目前，我國對銀杏葉提取物的利用除了滿足國內(nèi)市場的需求外，還以浸膏原料出口國外以滿足國際市場的需求。
銀杏酸為一類烷基或烯基酚酸類化合物，是銀杏中除黃酮、內(nèi)酯之外的另一類活性成分，存在于銀杏葉和外種皮中。因銀杏酸在口服制劑中可對機(jī)體產(chǎn)生致敏和細(xì)胞毒作用，在標(biāo)準(zhǔn)制劑中受到嚴(yán)格控制，需在提取、制備過程中加以除去。因而，以往銀杏酸一直被作為廢棄物丟棄。
銀杏酸占銀杏葉干重的1～2％，占銀杏外種皮(干)的3～5％。我國年獲取銀杏葉浸膏量達(dá)200噸，在銀杏葉浸膏量中銀杏酸含量約為2.2％，即從銀杏葉浸膏中去除的銀杏酸總量約為4.4噸。而每年丟棄的銀杏果實(shí)外種皮(干)達(dá)1.2萬噸，其中含銀杏酸約420噸。由此可知，每年有相當(dāng)量(400余噸)的銀杏酸被丟棄。對銀杏酸研發(fā)，可對銀杏葉和外種皮進(jìn)行綜合利用、變廢為寶，產(chǎn)生巨大的社會與經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效低毒的含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑及其制備方法。本發(fā)明主要用于殺滅血吸蟲病的唯一中間宿主一釘螺，防止血吸蟲病的傳播。
本發(fā)明銀杏酸殺螺劑以銀杏酸為主藥，與氯硝柳胺、銅離子以及輔料按下述重量百分比的科學(xué)配伍組成復(fù)合殺螺劑，銀杏酸20～50％，氯硝柳胺0.1～10％，硫酸銅0.01～1％，余為輔料。
所述的銀杏酸為銀杏酸總提物；氯硝柳胺為WHO認(rèn)可的殺螺劑；銅離子為殺螺增效劑，其通過硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)產(chǎn)生。
本發(fā)明銀杏酸殺螺劑通過三種活性成分合適的制劑手段，可制成微乳劑。所述微乳劑，較為穩(wěn)定，便于生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸和使用。
包含本發(fā)明制劑配方的制劑，可以做成濃縮的液體制劑，如微乳劑、乳劑等，也可以是濃縮的固體制劑，如粉劑、顆粒劑、脂質(zhì)體等。
本發(fā)明通過下述方法制備，按下述重量百分比，先將定量銀杏酸總提物和氯硝柳胺用助溶劑-乙醇溶解，加入非離子型乳化劑-吐溫80；另將配置好的1當(dāng)量氫氧化鈉加入定量硫酸銅中，制備成氫氧化銅膠體；然后通過高速乳化器將兩者混合，并加入水制備成微乳劑；或，將定量氯硝柳胺可濕性粉劑直接溶于水，另用乙醇溶解定量銀杏酸總提物并加入吐溫80，然后通過高速乳化器將這兩者與氫氧化銅膠體混合，并加入水制備成微乳劑。
銀杏酸總提物20～50％，氯硝柳胺0.1～10％，硫酸銅 0.01～1％，氫氧化鈉0.002～0.2％，乙醇20～70％，吐溫80 1～5％，水 10～40％。
上述銀杏酸總提物從銀杏外種皮中提取，其中共有5個單體，其母核為水楊酸結(jié)構(gòu)，苯環(huán)上有一個13、15、17烷基或烯基的側(cè)鏈。
本發(fā)明按WHO“殺螺劑實(shí)驗(yàn)室終篩方法”中的浸泡法進(jìn)行殺螺試驗(yàn)。結(jié)果表明，其中銀杏酸殺滅釘螺的作用與氯硝柳胺相比有以下不同的特點(diǎn)(1)銀杏酸可有效抑制釘螺的上爬，防止其逃逸殺傷；(2)銀杏酸殺滅釘螺的作用起效較快，釘螺的死亡主要發(fā)生在24小時內(nèi)。
對各銀杏酸單體殺滅釘螺的LC50測定結(jié)果表明，其殺滅釘螺的強(qiáng)弱順序?yàn)镚A(13∶0)＞GA(15∶1)，GA(15∶0)＞GA(17∶1)＞GA(17∶2)。殺螺活性以前三者為主，其24小時的LC50分別為13.17mg/L，18.57mg/L，26.33mg/L，這三者在銀杏酸總提物中的含量達(dá)70％左右，各銀杏酸單體的協(xié)同作用，使銀杏酸總提物達(dá)到較好的殺螺效果。
上述研究結(jié)果表明，其中，銀杏酸主要單體化合物和銀杏酸總提物殺滅釘螺的LC50在WHO所要求的殺螺劑范圍內(nèi)(＜100mg/L)。本發(fā)明的殺螺劑量為1～100mg/L。所使用的劑量對人類和淡水魚類都不會產(chǎn)生傷害作用；其中，殺螺劑-氯硝柳胺可濕性粉劑與銀杏酸的配伍，可產(chǎn)生協(xié)同作用，大大降低了用量，所含的氯硝柳胺劑量為10～1000ug/L。所使用的劑量降低了它對淡水魚類的毒性，達(dá)到環(huán)保的要求，還降低了成本。
其中，殺螺增效劑-銅離子，通過與銀杏酸和氯硝柳胺的配伍，可增強(qiáng)抑制釘螺的上爬率，提高其殺滅作用，使用劑量為1～100ppm。所使用的劑量達(dá)到經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的要求。
本發(fā)明殺螺劑，按長江水產(chǎn)科學(xué)研究所制定的《魚類毒性試驗(yàn)暫行規(guī)定》方案進(jìn)行魚毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，對淡水魚類無明顯的毒性作用。
包含本發(fā)明殺螺劑配方的制劑，可臨用時用水稀釋至合適的濃度，噴灑于含有釘螺的水域或土壤上?？梢蚤g隔3～4天噴灑一次，以增強(qiáng)對釘螺的殺滅效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11).銀杏酸總提物及其單體的制備將100g干燥、粉碎的銀杏外種皮，按1∶5的比例加入石油醚(沸程60～90℃)萃取1h，過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并提取，揮去石油醚，得外種皮粗提物浸膏。
將浸膏用少量石油醚溶解，加樣于硅膠柱上(硅膠柱為Φ32×400mm的玻璃柱，濕法裝柱)，用石油醚∶乙醚∶甲酸＝89∶11∶1(V/V/V)洗脫，以薄層層析在254 nm處出現(xiàn)熒光為檢測指標(biāo)。收集銀杏酸總提物組分，濃縮至干；重復(fù)過柱一次，得到的銀杏酸總提物組分水洗至中性，濃縮至干，得銀杏酸總提物。
采用制備型C18 RP-HPLC柱與20cm載銀陽離子HPLC交換柱相連用，用甲醇∶水＝93∶7(用0.1％甲酸酸化)為流動相，紫外檢測波長為311nm，收集銀杏酸各組分，進(jìn)行冷凍干燥后，供鑒定和實(shí)驗(yàn)之用。
2).銀杏酸總提物及其單體的鑒定上述分離制備的銀杏酸總提物，經(jīng)C18 RP-HPLC柱，通過Waters HPLC分析，甲醇∶水＝93∶7(用0.1％甲酸酸化)為流動相，紫外檢測波長為311nm。檢測圖譜上無其它雜質(zhì)峰，5個銀杏酸單體的保留時間分別為9.6，10.4，12.0，15.5和16.5分鐘，分離效果與峰型良好。上述分離制備的銀杏酸單體經(jīng)Agilent 1100 Series LC/MSD液質(zhì)聯(lián)機(jī)測定分子量，確定其結(jié)構(gòu)分別為GA(13∶0)，GA(15∶1)，GA(15∶0)，GA(17∶1)，GA(17∶2)；同時，經(jīng)該液質(zhì)聯(lián)機(jī)測定，在銀杏酸總提物中各銀杏酸單體的含量比例分別為17.26％，52.59％，3.04％，24.02％和3.09％。
實(shí)施例2將銀杏酸總提物先用少量無水乙醇溶解，加入適當(dāng)乳化劑，通過高速乳化，制備成乳劑，再用煮沸后冷卻的自來水稀釋至不同濃度40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、1.25mg/L(乙醇終濃度均＜0.1％)。同時，設(shè)用煮沸后冷卻的自來水為空白對照，并用氯硝柳胺可濕性粉劑溶于該自來水(250ug/l)為陽性對照藥。
按WHO“殺螺劑實(shí)驗(yàn)室終篩方法”中的浸泡法進(jìn)行滅螺試驗(yàn)。
釘螺采自湖南岳陽血吸蟲流行區(qū)。以群體逸蚴法除去陽性釘螺，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)72h。挑選螺齡為8～9旋的成螺備用。
在25ml燒杯中加30ml上述制備的不同藥液(即加滿至杯口)每一燒杯中放10只釘螺，杯口覆蓋尼龍網(wǎng)，以防釘螺爬出。
對浸泡于對應(yīng)液體中、盛放于水平桌面上燒杯中的釘螺，在室溫(22+1℃)下，分別于5、10、15、30、60、120分鐘觀察并記錄釘螺的上爬率和觀察，并記錄24h和48h時觀察釘螺的死亡情況。以針刺法結(jié)合敲擊法觀察其活動情況，判定其是否死亡。經(jīng)上述觀察發(fā)現(xiàn)，釘螺的上爬率以1小時最有代表性，因而實(shí)驗(yàn)中均以1小時(1h)上爬率為觀察指標(biāo)。表1為銀杏酸總提物浸殺釘螺和抑制釘螺上爬作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表1

銀杏酸總提物浸殺釘螺和抑制釘螺上爬的作用經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果基本一致。上述結(jié)果顯示，空白對照組中釘螺上爬明顯，銀杏酸總提物可引起釘螺上爬率呈劑量依賴性下降，與釘螺24小時的死亡率明顯相關(guān)。銀杏酸引起釘螺死亡的主要作用時間在24小時內(nèi)。
實(shí)施例3
銀杏酸總提物用少量無水乙醇溶解，加入適當(dāng)乳化劑，通過高速乳化，制備成乳劑，再用煮沸后冷卻的自來水稀釋至不同濃度40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、1.25mg/L(乙醇終濃度均＜0.1％)。氯硝柳胺可濕性粉劑用煮沸后冷卻的自來水稀釋至不同濃度100ug/L、50ug/L、25ug/L、12.5ug/L、6.25ug/L、3.13ug/L。同時，用煮沸后冷卻的自來水為空白對照。
按WHO“殺螺劑實(shí)驗(yàn)室終篩方法”中的浸泡法進(jìn)行滅螺試驗(yàn)。
釘螺采自湖南岳陽血吸蟲流行區(qū)。以群體逸蚴法除去陽性釘螺，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)72h。挑選螺齡為8～9旋的成螺備用。
在25ml燒杯中加30ml上述制備的不同藥液(即加滿至杯口)每一燒杯中放10只釘螺，杯口覆蓋尼龍網(wǎng)，以防釘螺爬出。
對浸泡于對應(yīng)的液體中、盛放于水平桌面上燒杯中的釘螺，在室溫(22+1℃)下，觀察并記錄釘螺1小時的上爬率和觀察并記錄24h和48h時釘螺的死亡情況。以針刺法結(jié)合敲擊法觀察其活動情況，判定其是否死亡。表2為氯硝柳胺與銀杏酸的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表2.

從上述結(jié)果可見，隨著氯硝柳胺濃度增大、銀杏酸濃度減小，釘螺的上爬率未受影響；而隨著氯硝柳胺濃度減小、銀杏酸濃度增大，釘螺的上爬率明顯降低；同時，銀杏酸呈劑量依賴性提高對釘螺的死亡率。
實(shí)施例4銀杏酸總提物用少量無水乙醇溶解，加入適當(dāng)乳化劑，通過高速乳化，制備成微乳劑，再用煮沸后冷卻的自來水稀釋至不同濃度5mg/L、1.25mg/L，0.625mg/L，0.31mg/L(乙醇終濃度均＜0.1％)。氯硝柳胺可濕性粉劑用煮沸后冷卻的自來水配制成10ug/L。同時，設(shè)用煮沸后冷卻的自來水為空白對照。銅離子的配制采用硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)，形成氫氧化銅膠體溶液，再經(jīng)稀釋后加入銀杏酸與氯硝柳胺的混合液中，制成微乳劑，備用。
按WHO“殺螺劑實(shí)驗(yàn)室終篩方法”中的浸泡法進(jìn)行滅螺試驗(yàn)。
釘螺采自湖南岳陽血吸蟲流行區(qū)。以群體逸蚴法除去陽性釘螺，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)72h。
挑選螺齡為8～9旋的成螺備用。
在25ml燒杯中加30ml上述制備的不同藥液(即加滿至杯口)每一燒杯中放10只釘螺，杯口覆蓋尼龍網(wǎng)，以防釘螺爬出。
對浸泡于對應(yīng)的液體中、盛放于水平桌面上燒杯中的釘螺，在室溫(22+1℃)下，觀察并記錄釘螺1小時的上爬率和觀察并記錄12h釘螺的死亡情況。以針刺法結(jié)合敲擊法觀察其活動情況，判定其是否死亡。表3本發(fā)明制劑中銅離子對銀杏酸與氯硝柳胺殺滅釘螺作用的增效作用。
表3

從上述結(jié)果可見，銅離子的加入可有效減低釘螺的上爬率和提高釘螺12小時內(nèi)的死亡率，起到很好的增效作用。
實(shí)施例5將定量銀杏酸總提物和氯硝柳胺用助溶劑-乙醇溶解，用量為銀杏酸總提物和氯硝柳胺的兩倍，加入非離子型乳化劑-吐溫80(乙醇用量的1/10)；另將配置好的1當(dāng)量氫氧化鈉加入定量硫酸銅中，制備成氫氧化銅膠體并稀釋成不同的濃度；然后通過高速乳化器將兩者混合，并加入水制備成微乳劑。
同時，設(shè)用煮沸后冷卻的自來水為空白對照。
按WHO“殺螺劑實(shí)驗(yàn)室終篩方法”中的浸泡法進(jìn)行滅螺試驗(yàn)。
釘螺采自湖南岳陽血吸蟲流行區(qū)。以群體逸蚴法除去陽性釘螺，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)72h。
挑選螺齡為8～9旋的成螺備用。
在25ml燒杯中加30ml上述制備的不同藥液(即加滿至杯口)每一燒杯中放10只釘螺，杯口覆蓋尼龍網(wǎng)，以防釘螺爬出。
對浸泡于對應(yīng)的液體中、盛放于水平桌面上燒杯中的釘螺，在室溫(22+1℃)下，觀察并記錄釘螺1小時的上爬率和觀察并記錄12h釘螺的死亡情況。以針刺法結(jié)合敲擊法觀察其活動情況，判定其是否死亡。表4顯示本發(fā)明制劑中銅離子對銀杏酸與氯硝柳胺殺滅釘螺作用的增效作用。
表4

從上述結(jié)果可見，銅離子的加入可有效減低釘螺的上爬率和提高釘螺12小時內(nèi)的死亡率，起到很好的增效作用。
實(shí)施例6按上法配制含有銀杏酸(5mg/L)、氯硝柳胺(50ug/L)、銅離子(6ppm)的微乳劑4000mL。從中取50mL供培養(yǎng)釘螺之用。其余用于養(yǎng)殖淡水魚-紅鯉魚(觀賞用)。按長江水產(chǎn)科學(xué)研究所制定的《魚類毒性試驗(yàn)暫行規(guī)定》方案進(jìn)行魚毒試驗(yàn)。
釘螺采自湖南岳陽血吸蟲流行區(qū)。以群體逸蚴法除去陽性釘螺，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)72h。挑選螺齡為8～9旋的成螺備用。在25ml燒杯中加30ml上述藥液(即加滿至杯口)，放入10只釘螺，杯口覆蓋尼龍網(wǎng)，以防釘螺爬出。對浸泡于對應(yīng)的液體中、盛放于水平桌面上燒杯中的釘螺，在室溫(22+1℃)下，觀察并記錄24h釘螺的死亡情況。以針刺法結(jié)合敲擊法觀察其活動情況，判定其是否死亡。
取10條紅鯉魚(身長7～8cm)放入上述配制的溶液中，按常規(guī)飼養(yǎng)，水溫20℃，觀察72小時，記錄紅鯉魚的死亡情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在本發(fā)明殺螺劑的溶液中，24小時釘螺全部死亡，而所養(yǎng)殖的紅鯉魚全部存活。表明本殺螺劑高效低毒。
權(quán)利要求
1.一種含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑，其特征是以銀杏酸為主藥，與氯硝柳胺、銅離子以及輔料，按下述重量百分比組成銀杏酸20～50％，氯硝柳胺0.1～10％，硫酸銅0.01～1％，余為輔料。
2.按權(quán)利要求1所述的含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑，其特征是所述的銀杏酸為銀杏酸總提物，其中有5個單體，其母核為水楊酸結(jié)構(gòu)，苯環(huán)上有一個13、15、17烷基或烯基的側(cè)鏈；所述的銅離子通過硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)產(chǎn)生。
3.按權(quán)利要求1或2所述的含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑，其特征是所述的復(fù)合殺螺劑制成濃縮的液體制劑，包括微乳劑或乳劑。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑的制備方法，其特征是包括下述步驟按下述重量百分比，先將定量銀杏酸總提物和氯硝柳胺用助溶劑-乙醇溶解，加入非離子型乳化劑-吐溫80；將配置好的1當(dāng)量氫氧化鈉加入定量硫酸銅中，制備成氫氧化銅膠體；然后通過高速乳化器將兩者混合，并加入水制備成微乳劑；或，將定量氯硝柳胺可濕性粉劑直接溶于水，另用乙醇溶解定量銀杏酸總提物并加入吐溫80，然后通過高速乳化器將這兩者與氫氧化銅膠體混合，并加入水制備成微乳劑，銀杏酸總提物20～50％氯硝柳胺0.1～10％硫酸銅0.01～1％氫氧化鈉0.002～0.2％乙醇20～70％吐溫801～5％水10～40％。
5.按權(quán)利要求1或2所述的含銀杏酸的復(fù)合殺螺劑，其特征是所述的復(fù)合殺螺劑還制成濃縮的固體制劑，包括粉劑、顆粒劑或脂質(zhì)體。
全文摘要
本發(fā)明屬生物農(nóng)藥領(lǐng)域，涉及一種含有銀杏酸的高效低毒的殺螺制劑，本發(fā)明以銀杏酸為主藥，與氯硝柳胺、銅離子以及輔料科學(xué)配伍組成復(fù)合殺螺劑，用于殺滅血吸蟲病的唯一中間宿主—釘螺，防止血吸蟲病的傳播。經(jīng)殺螺試驗(yàn)，結(jié)果表明，可有效抑制釘螺上爬，防止其逃逸殺傷；殺滅作用起效較快，釘螺在24小時內(nèi)死亡，所使用劑量對人類不產(chǎn)生傷害作用；對淡水魚類無明顯的毒性作用，在高效殺滅釘螺的同時，降低了毒性及成本，實(shí)現(xiàn)了“高效、低毒、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)”的要求。本發(fā)明可制成濃縮的液體制劑或固體制劑，便于生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸和使用。
文檔編號A01N37/06GK101088339SQ20061002760
公開日2007年12月19日 申請日期2006年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者潘家祜, 毛佐華, 俞培忠 申請人:復(fù)旦大學(xué)