專利名稱：：用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝及其用途。
背景技術(shù)：
：稗草是全球最難防除的雜草之一，目前主要依靠化學(xué)除草劑來(lái)防治。然而化學(xué)除草劑的長(zhǎng)期使用使稗草的抗(耐)藥性問(wèn)題及環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。開(kāi)發(fā)安全高效的生物除草劑符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求，雖然目前生物除草劑還不能完全替代化學(xué)除草劑，但它能有效減少化學(xué)除草劑的使用劑量，從而減少對(duì)環(huán)境的污染。另外，水稻紋枯病是由土壤真菌立枯絲核菌(Rhizoctoniasolanikuhn)引起的一類嚴(yán)重制約水稻生產(chǎn)的全球性水稻病害。發(fā)病嚴(yán)重的區(qū)域水稻減產(chǎn)可達(dá)50％。由于缺少抗紋枯病的供體，目前世界上尚未育出真正意義上的抗紋枯病的水稻品種，因此開(kāi)發(fā)高效安全的殺菌劑，尤其是天然來(lái)源的殺菌劑尤為重要。目前國(guó)內(nèi)防治水稻紋枯病主要利用井岡霉素，雖然井岡霉素是一種低毒的生物農(nóng)藥，但是往往需要多次用藥才能達(dá)到良好的防治效果，成本較高。國(guó)際上水稻紋枯病的生防菌主要有枯草芽孢桿菌屬和假單孢菌屬細(xì)菌及木霉菌屬真菌。利用植物病原菌，尤其是雜草生防菌蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolariseleusines)防治水稻紋枯病可以充分利用有限的植物病原菌資源，拓寬篩選殺菌劑菌種范圍，從而獲得高效安全的天然殺菌劑。蟋蟀草平臍蠕孢菌是澳大利亞的Alcorn&R.G.Shivas首次從感病蟋蟀草葉片上分離得到，并在Mycotaxon1990年39卷第366-370頁(yè)詳細(xì)描述其形態(tài)特征，并已將模式菌株保藏于全球生物多樣性信息機(jī)構(gòu)(GlobalBiodiversityInformationFacility，簡(jiǎn)稱GBIF)。但對(duì)它的應(yīng)用研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。蟋蟀草平臍蠕孢菌菌種可以直接從市場(chǎng)上購(gòu)買得到，也可以從感病蟋蟀草葉片上重復(fù)分離得到。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種從蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)物中提取真菌代謝物的工藝，并提供真菌代謝物在制備稗草除草劑和防治水稻紋枯病農(nóng)藥中的應(yīng)用。用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝，所述的代謝物包含3-脫水蛇孢菌素B(3-anhydroophiobolinB)，蛇孢菌素A(ophiobolinA)，3-脫水-6-表蛇孢菌素A(3-anhydro-6-epiophiobolinA)，3-脫水-6-表蛇孢菌素B(3-anhydro-6-epiophiobolinB)，以下分別簡(jiǎn)稱化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，其特征在于包括以下工藝步驟1)將蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolariseleusines)的PDB培養(yǎng)基上獲得的培養(yǎng)物經(jīng)四層紗布過(guò)濾，分離菌絲體和發(fā)酵液；2)菌絲體用乙酸乙酯浸提3次，合并浸提液并減壓濃縮，得到含化合物1的墨綠色油狀濃縮物；3)發(fā)酵液在40℃下減壓濃縮到原始體積的一半后用等體積乙酸乙酯分3次萃取，萃取相加入適量水洗滌后減壓濃縮得到含化合物2的棕褐色油狀物；4)將分離了化合物1和2的菌絲體浸提物和發(fā)酵液萃取物合并，上硅膠柱用體積比為6∶4的正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑洗脫，100mL分部收集洗脫液，根據(jù)薄層層析測(cè)定結(jié)果，含相同組分的洗脫液合并后分別得到含化合物3和化合物4的洗脫混合液。所述的用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝，其特征在于所述的化合物1、2、3、4分別按下列方法進(jìn)一步純化1)化合物1的純化菌絲體浸提、濃縮得到的含化合物1的墨綠色油狀濃縮物經(jīng)4℃冷藏后析出晶體，用布氏漏斗通過(guò)濾紙過(guò)濾分離晶體混合物。用少量CHCl3溶解晶體后上硅膠柱，用體積比為150∶1的氯仿和甲醇的混合溶劑洗脫分離，10mL分部收集洗脫液，洗脫液22-25合并后減壓濃縮，加氯仿溶解，再滴加乙醇析出無(wú)色不定形晶體，為化合物1。2)化合物2的純化發(fā)酵液濃縮萃取得到含化合物2的棕褐色油狀物，加入少量體積比為1∶1的正己烷和乙酸乙酯混合溶劑，析出化合物2的晶體。再用重結(jié)晶的方法純化得到無(wú)色針狀晶體。3)化合物3的純化含化合物3的洗脫混合液上硅膠柱，用體積比為250∶1的氯仿和甲醇混合溶劑洗脫分離，10mL分部收集洗脫液，洗脫液10-12部分合并濃縮后得到紅色膏狀的化合物3。4)化合物4的純化含化合物4的洗脫混合液上硅膠柱，用體積比為150∶1的氯仿和甲醇洗脫，洗脫液15-17部分合并濃縮后得到土黃色固體為化合物4。經(jīng)研究試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，從蟋蟀草平臍蠕孢菌培養(yǎng)物中分離純化的代謝產(chǎn)物化合物1、2、3、4可用于制備微生物除草劑，可以單獨(dú)使用，也可以與常用化學(xué)除草劑同時(shí)使用，從而減少化學(xué)除草劑使用劑量并且達(dá)到良好的除草效果。其中代謝產(chǎn)物化合物2還可用于制備防治水稻紋枯病的生物殺菌劑，控制水稻紋枯病菌。蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolariseleusines)從感病蟋蟀草中分離得到，該菌種和分離方法均為已有公知技術(shù)，并可重復(fù)分離獲得，其培養(yǎng)方法也屬已有公知技術(shù)，一般是將菌接種于PDB培養(yǎng)基，在溫度28±2℃下，液體發(fā)酵培養(yǎng)14天。上述代謝產(chǎn)物化合物的提取工藝簡(jiǎn)單易行，開(kāi)辟了新的微生物除草劑和殺菌劑品種，對(duì)人畜無(wú)毒，對(duì)水稻等多種作物安全，無(wú)殘留藥害發(fā)生，對(duì)環(huán)境友好。具體實(shí)施例方式化合物的分離提取工藝1)將蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolariseleusines)的PDB培養(yǎng)基上獲得的培養(yǎng)物經(jīng)四層紗布過(guò)濾，分離菌絲體和發(fā)酵液；2)菌絲體用乙酸乙酯浸提3次，合并浸提液并減壓濃縮，得到含化合物1的墨綠色油狀濃縮物；3)發(fā)酵液在40℃下減壓濃縮到原始體積的一半后用等體積乙酸乙酯分3次萃取，萃取相加入適量水洗滌后減壓濃縮得到含化合物2的棕褐色油狀物；4)將分離了化合物1和2的菌絲體浸提物和發(fā)酵液萃取物合并，上硅膠柱用體積比為6∶4的正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑洗脫，100mL分部收集洗脫液，根據(jù)薄層層析測(cè)定結(jié)果，洗脫液28-36合并后得到含化合物3的洗脫混合液，洗脫液37-50合并后得到含化合物4的洗脫混合液?；衔锏募兓に?)化合物1的純化菌絲體浸提、濃縮得到的含化合物1的墨綠色油狀濃縮物經(jīng)4℃冷藏后析出晶體，用布氏漏斗通過(guò)濾紙過(guò)濾分離晶體混合物。用少量CHCl3溶解晶體后上硅膠柱，用體積比為150∶1的氯仿和甲醇的混合溶劑洗脫分離，10mL分部收集洗脫液，洗脫液22-25合并后減壓濃縮，加氯仿溶解，再滴加乙醇析出無(wú)色不定形晶體，為化合物1。2)化合物2的純化發(fā)酵液濃縮萃取得到含化合物2的棕褐色油狀物，加入少量體積比為1∶1的正己烷和乙酸乙酯混合溶劑，析出化合物2的晶體。再用重結(jié)晶的方法純化得到無(wú)色針狀晶體。3)化合物3的純化含化合物3的洗脫混合液上硅膠柱，用體積比為250∶1的氯仿和甲醇混合溶劑洗脫分離，10mL分部收集洗脫液，洗脫液10-12部分合并濃縮后得到紅色膏狀的化合物3。4)化合物4的純化含化合物4的洗脫混合液上硅膠柱，用體積比為150∶1的氯仿和甲醇洗脫，洗脫液15-17部分合并濃縮后得到土黃色固體為化合物4。4種化合物的得率從16L發(fā)酵液和干重169.8g的菌絲體中分離得到55mg化合物1，157mg化合物2，48mg化合物3以及52mg化合物4?；衔锝Y(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)分析核磁共振波譜數(shù)據(jù)并結(jié)合現(xiàn)已知的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定化合物結(jié)構(gòu)。核磁共振實(shí)驗(yàn)主要包括1H-1HCOSY，HMQC，HMBC，DEPT和NOESY，所用核磁共振儀為AVANCE500，溶劑為氘代氯仿，TMS作為內(nèi)標(biāo)。TOF-ESI-MS所用質(zhì)譜儀為MicromassLCT，離子化能量為2140eV?；衔?、2、3、4的NMR分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表1所示。表1.化合物1、2、3、4的NMR分析數(shù)據(jù)a在氯仿溶液中125赫茲時(shí)的化學(xué)位移；b在500赫茲時(shí)的偶合常數(shù)和多重性。通過(guò)詳細(xì)分析NMR波譜數(shù)據(jù)和TOF-ESI-MS譜圖，確定了化合物1、2、3、4的結(jié)構(gòu)式分別為化合物13-脫水蛇孢菌素B，英文名稱3-anhydroophiobolinB(1)；化合物2蛇孢菌素A，英文名稱ophiobolinA(2)；化合物33-脫水-6-表蛇孢菌素A，英文名稱3-anhydro-6-epiophiobolinA(3)；化合物43-脫水-6-表蛇孢菌素B，英文名稱3-anhydro-6-epiophiobolinB(4)。1R＝βH，3-anhydroophiobolinB2OphiobolinA33-anhydro-6-epiophiobolinA4R＝αH，3-anhydro-6-epiophiobolinB化合物2(ophiobolinA)殺草活性及其對(duì)水稻安全性評(píng)價(jià)的生物測(cè)定選用同一批稗草種子及粳稻秀水11、早秈稻03-133和雜交稻187(分別代表粳稻、秈稻和雜交稻)，經(jīng)浸種催芽后，挑選10粒根長(zhǎng)2mm左右催芽種子放入加有被測(cè)物質(zhì)溶液(用微量DMSO溶解后加水稀釋到DMSO終濃度為0.1％)的直徑7cm培養(yǎng)皿(皿內(nèi)鋪一張濾紙)中，以0.1％DMSO為空白對(duì)照，置培養(yǎng)箱內(nèi)于27±1℃下培養(yǎng)2天，測(cè)量根長(zhǎng)并計(jì)算根生長(zhǎng)抑制率。所得結(jié)果進(jìn)行方差分析(p＜0.05)，根據(jù)測(cè)得的抑制率估計(jì)IC50值。被測(cè)物質(zhì)樣品選取3個(gè)濃度梯度，分別為10，100，1000μg/mL，選用2，4-D作為正對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果顯示化合物2(ophiobolinA)在培養(yǎng)皿生測(cè)法中對(duì)稗草種子胚根生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用，其IC50值為7.5μM。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)稗草比水稻對(duì)化合物2(opbiobolinA)更加敏感(見(jiàn)表2)。不同水稻品種對(duì)化合物2(ophiobolinA)的敏感度不一樣，但都沒(méi)有超過(guò)稗草。表明蟋蟀草平臍蠕孢菌及其代謝產(chǎn)物化合物2(ophiobolinA)具有開(kāi)發(fā)稗草生物除草劑的潛力。表2ophiobolinA對(duì)稗草和不同水稻品種根長(zhǎng)IC50值(μM)化合物1(3-anhydroophiobolinB)、化合物3(3-anhydro-6-epiophiobolinA)和化合物4(3-anhydro-6-epiophiobolinB)殺草活性的生物測(cè)定生物測(cè)定方法同化合物2，試驗(yàn)結(jié)果表明化合物1的IC50值為208μM，化合物3的IC50值為785μM，化合物4的IC50值為260μM，對(duì)稗草也有比較明顯的抑制活性?；衔?(ophiobolinA)殺菌活性檢測(cè)取化合物2(ophiobolinA)用微量DMSO溶解，加水調(diào)節(jié)其濃度為1mg/mL(含0.1％DMSO)，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾得無(wú)菌毒素溶液。用熔化并冷卻到45～50℃的PDA培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其毒素濃度分別為50，25，10，5和1μg/mL(2.5μM)。對(duì)照PDA培養(yǎng)基內(nèi)加入2.5mL0.1％DMSO水溶液。另設(shè)井岡霉素(5％)有效成分200，100，50，25，10μg/mL為殺菌劑對(duì)照。從培養(yǎng)2d的紋枯病菌落邊緣取直徑7mm菌塊接種于上述平板中央，28℃培養(yǎng)24h，用十字交叉法測(cè)菌落直徑，并按下式計(jì)算化合物2對(duì)紋枯病菌的抑制率。試驗(yàn)結(jié)果顯示化合物2(ophiobolinA)對(duì)紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用活性均比對(duì)照井岡霉素要強(qiáng)(見(jiàn)表3)，化合物2(ophiobolinA)則在25μg/mL濃度下就有100％抑制作用，而5％井岡霉素在有效成分濃度為200μg/mL時(shí)只能達(dá)到45.2％的抑制率?？梢?jiàn)稗草平臍蠕孢菌代謝產(chǎn)物化合物2(ophiobolinA)對(duì)水稻紋枯病菌有極好的抑菌作用，其抑菌效果明顯優(yōu)于目前常用的井岡霉素，可以開(kāi)發(fā)作為生物殺菌劑。表3化合物2(ophiobolinA)對(duì)紋枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="843">抑菌劑抑制率(％)200a1005025101OphiobolinA井岡霉素-c45.2-29.410022.610011.385.97.970.2-</table></tables>a抑菌劑濃度單位是μg/mL；b所示抑制率為兩次重復(fù)結(jié)果的平均值，方差分析p＜0.05；c“-”表示未檢測(cè)。權(quán)利要求1.用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝，所述的代謝物包含3-脫水蛇孢菌素B(3-anhydroophiobolinB)，蛇孢菌素A(ophiobolinA)，3-脫水6-表蛇孢菌素A(3-anhydro-6-epiophiobolinA)，3-脫水-6-表蛇孢菌素B(3-anhydro-6-epiophiobolinB)，以下分別簡(jiǎn)稱化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，其特征在于包括以下工藝步驟1)將蟋蟀草平臍蠕孢菌(Bipolariseleusines)在PDB培養(yǎng)基上獲得的培養(yǎng)物經(jīng)四層紗布過(guò)濾，分離菌絲體和發(fā)酵液；2)菌絲體用乙酸乙酯浸提3次，合并浸提液并減壓濃縮，得到含化合物1的墨綠色油狀濃縮物；3)發(fā)酵液在40℃下減壓濃縮到原始體積的一半后用等體積乙酸乙酯分3次萃取，萃取相加入適量水洗滌后減壓濃縮得到含化合物2的棕褐色油狀物；4)將分離了化合物1和2的菌絲體浸提物和發(fā)酵液萃取物合并，上硅膠柱用體積比為6∶4的正己烷和乙酸乙酯的混合溶劑洗脫，100mL分部收集洗脫液，根據(jù)薄層層析測(cè)定結(jié)果，含相同組分的洗脫液合并后分別得到含化合物3和化合物4的洗脫混合液。2.如權(quán)利要求1所述的用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝，其特征在于所述的化合物1、2、3、4分別按下列方法進(jìn)一步純化1)化合物1的純化菌絲體浸提、濃縮得到的含化合物1的墨綠色油狀濃縮物經(jīng)4℃冷藏后析出晶體，用布氏漏斗通過(guò)濾紙過(guò)濾分離晶體混合物。用少量CHCl3溶解晶體后上硅膠柱，用體積比為150∶1的氯仿和甲醇的混合溶劑洗脫分離，10mL分部收集洗脫液，洗脫液22-25合并后減壓濃縮，加氯仿溶解，再滴加乙醇析出無(wú)色不定形晶體，為化合物1。2)化合物2的純化發(fā)酵液濃縮萃取得到含化合物2的棕褐色油狀物，加入少量體積比為1∶1的正己烷和乙酸乙酯混合溶劑，析出化合物2的晶體。再用重結(jié)晶的方法純化得到無(wú)色針狀晶體。3)化合物3的純化含化合物3的洗脫混合液上薄層層析硅膠柱H用體積比為250∶1的氯仿和甲醇混合溶劑洗脫分離，10mL分部收集洗脫液，洗脫液10-12部分合并濃縮后得到紅色膏狀的化合物3。4)化合物4的純化含化合物4的洗脫混合液上薄層層析硅膠柱H用體積比為150∶1的氯仿和甲醇洗脫，洗脫液15-17部分合并濃縮后得到土黃色固體為化合物4。3.如權(quán)利要求1或2所述的真菌代謝物在制備稗草除草劑中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求1或2所述的真菌代謝物在制備防治水稻紋枯病農(nóng)藥中的應(yīng)用。全文摘要用于防治雜草和水稻病害的真菌代謝物提取工藝及其用途，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。所述的代謝物包含3－脫水蛇孢菌素B，蛇孢菌素A，3－脫水－6－表蛇孢菌素A，3－脫水－6－表蛇孢菌素B，分別簡(jiǎn)稱化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，包括以下工藝步驟將蟋蟀草平臍蠕孢菌的培養(yǎng)物過(guò)濾，分離菌絲體和發(fā)酵液；菌絲體的浸提液減壓濃縮，得到含化合物1的濃縮物；發(fā)酵液減壓濃縮、萃取，萃取相加入適量水洗滌后減壓濃縮得到含化合物2的油狀物；將分離了化合物1和2的菌絲體浸提物和發(fā)酵液萃取物合并，用混合溶劑洗脫，含相同組分的洗脫液合并后分別得到含化合物3和化合物4的洗脫混合液。該真菌代謝物在制備稗草除草劑中應(yīng)用。文檔編號(hào)A01P13/00GK1857079SQ20061005183公開(kāi)日2006年11月8日申請(qǐng)日期2006年6月6日優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日發(fā)明者張建萍,余柳青,段桂芳申請(qǐng)人:中國(guó)水稻研究所