專利名稱：黃花烏頭發(fā)根及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃花烏頭發(fā)根及其獲得方法。
背景技術(shù)：
關(guān)附甲素是一種治療心絞痛的特效藥品，用量極微就有很好的療效。目前，國(guó)內(nèi)主要是從黃花烏頭(Aconitum Coreanum(Levl.)Rapaics)根(關(guān)白附)內(nèi)提取關(guān)附甲素供藥用。但天然黃花烏頭常受氣候的影響，季節(jié)性強(qiáng)，病蟲害等也會(huì)嚴(yán)重影響黃花烏頭的產(chǎn)量和質(zhì)量；黃花烏頭生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需5年才能采收1次，受氣候及病蟲害影響大，質(zhì)量不穩(wěn)定；并且，其根頭小，單產(chǎn)低，嚴(yán)重制約黃花烏頭在生產(chǎn)上的應(yīng)用。擴(kuò)大黃花烏頭的種植，必定與糧食種植爭(zhēng)地，不符合我國(guó)土地資源的現(xiàn)狀。
發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar.)為根瘤菌科，革蘭氏陰性菌，根據(jù)來源不同，發(fā)根農(nóng)桿菌分為8196和A4兩大類，前者是從蘋果樹上分離得到的，致毒力較弱，后者是從玫瑰植株上分離得到的，致毒力較強(qiáng)。A4型菌株導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化組織合成各種農(nóng)桿堿(agropine)，因此，又通常稱之為農(nóng)桿堿型菌株。發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞后產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根(hairy root)，簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根。發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ri質(zhì)粒(root inducing plasmid)，其大小為200-800kb。Ri質(zhì)粒上含有T-DNA，其能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，表現(xiàn)發(fā)根性狀。Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點(diǎn)是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨(dú)立復(fù)制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，可自我復(fù)制并具有遺傳的穩(wěn)定性，在特殊環(huán)境中對(duì)細(xì)菌的生存起著重要的作用。它具有可轉(zhuǎn)移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黃花烏頭發(fā)根及其獲得方法。
本發(fā)明所提供的黃花烏頭發(fā)根，是以黃花烏頭器官為外植體材料，以發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)發(fā)根培養(yǎng)后得到的。
該黃花烏頭發(fā)根的獲得方法，包括如下步驟1)外植體的獲得將黃花烏頭器官經(jīng)消毒后轉(zhuǎn)移到1/2MS固體培養(yǎng)基上，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-7天；
2)轉(zhuǎn)化發(fā)根將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃花烏頭器官浸入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中感染5-20分鐘，吸凈菌液后再接種于含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在22℃-25℃下經(jīng)過30-50天培養(yǎng)，得到黃花烏頭發(fā)根。
為了能提高所獲得的黃花烏頭發(fā)根的產(chǎn)量與質(zhì)量，黃花烏頭發(fā)根還經(jīng)過去菌培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)；所述去菌培養(yǎng)是將發(fā)根從外植體上切割，在含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每3-5天繼代1次，進(jìn)行3-5次；所述擴(kuò)大培養(yǎng)是將經(jīng)過去菌培養(yǎng)的發(fā)根在1/2MS或1/2B5液體培養(yǎng)基中，于黑暗條件、22℃-25℃下進(jìn)行培養(yǎng)。
在培育轉(zhuǎn)染過程中，步驟1)發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中菌液濃度高于1×106個(gè)/mL；所用的抗生素通常有頭孢拉定、頭孢氨芐青霉素、羧芐青霉素等；濃度為200mg/L-500mg/L。
在本發(fā)明中，黃花烏頭的各種器官，如葉片、根、莖、葉柄、花絲或花瓣等，均可以作為外植體的材料。
本發(fā)明所獲得的黃化烏頭發(fā)根在普通的組織培養(yǎng)基中即能進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，可以通過液體培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)，繁殖速度快，生產(chǎn)周期短(約40天左右)，不受自然條件的影響，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)集約化生產(chǎn)，克服了人工種植黃花烏頭時(shí)所具有的繁殖速度慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、遺傳穩(wěn)定性差等缺陷；發(fā)根中藥用成分——關(guān)附甲素含量高，具有廣闊的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。


圖1為本發(fā)明黃花烏頭發(fā)根的照片。
具體實(shí)施例方式
以黃花烏頭葉片、根、莖、葉柄、花絲或花瓣等器官為外植體，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA整合到黃花烏頭外植體細(xì)胞核DNA中，表達(dá)形成毛狀根，又稱之為發(fā)根(hairy root)；每一個(gè)發(fā)根即為一個(gè)單克?。唤?jīng)過多次繼代培養(yǎng)及反復(fù)篩選，逐步建立起黃花烏頭發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性系。
實(shí)施例1、黃花烏頭發(fā)根的培育與鑒定一、黃花烏頭發(fā)根的培育1、材料盆栽黃花烏頭新鮮、健康的葉片，發(fā)根農(nóng)桿菌A4。
2、轉(zhuǎn)化
1)外植體的獲得取盆栽黃花烏頭新鮮、健康的葉片，洗凈；用0.1％的升汞滅菌10min，無菌水漂洗4次，每次不少于1min，然后吸干表面水分；再于超凈臺(tái)上將葉片切成0.5cm×1.0cm大小，轉(zhuǎn)移到已滅菌的1/2MS固體培養(yǎng)基上(每瓶5片)；于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天。
2)發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落，接種于5mL液體YEB內(nèi)，28℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)過夜，于次日接種到50ml液體YEB中繼培養(yǎng)4-6h后備用。
3)黃花烏頭葉片與發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃花烏頭葉片浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液(≥1×106個(gè)/mL)中，感染10min，然后，用無菌濾紙將菌液吸凈，再接種于含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基(所用的抗生素為頭孢拉定；濃度為200mg/L)上，約經(jīng)過30d培養(yǎng)即可生出發(fā)根。
3、培養(yǎng)1)去菌培養(yǎng)切割下由外植體上長(zhǎng)出的發(fā)根，置于含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基(所用的抗生素為頭孢氨芐青霉素；濃度為300mg/L)上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)，每3-5d轉(zhuǎn)繼代1次，進(jìn)行34次；2)擴(kuò)大培養(yǎng)將無菌的發(fā)根1.0g移入盛有50mL 1/2MS液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶?jī)?nèi)，于黑暗條件、22℃-25℃下，110rpm轉(zhuǎn)速下懸浮培養(yǎng)，每30天傳代一次，傳代4次得到黃花烏頭發(fā)根800g。
二、黃花烏頭發(fā)根的鑒定1、發(fā)根生長(zhǎng)形態(tài)所獲得的黃花烏頭發(fā)根照片如圖1所示，表明轉(zhuǎn)化的黃花烏頭發(fā)根無向地性，隨機(jī)交叉‘無序’生長(zhǎng)，多‘根毛’，多分枝，生長(zhǎng)快，具有典型的轉(zhuǎn)化發(fā)根特征。
2、黃花烏頭發(fā)根生長(zhǎng)曲線該黃花烏頭發(fā)根的生長(zhǎng)曲線為一典型的S形曲線，培養(yǎng)30天可增殖20倍。
3、黃花烏頭發(fā)根的次生代謝物質(zhì)經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明黃花烏頭發(fā)根中關(guān)附甲素含量為0.38％，與從植物上所采集的黃花烏頭根中關(guān)附甲素含量相當(dāng)。
4、黃花烏頭發(fā)根的培養(yǎng)基可以1/2MS或1/2B5液體培養(yǎng)基作為黃花烏頭發(fā)根的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，pH5.0-6.0。
在發(fā)根培養(yǎng)中，蔗糖的作用有二一是作為碳源和能源，二是調(diào)節(jié)培養(yǎng)液滲透壓。在培養(yǎng)基中，蔗糖濃度以1.0-3.0％(重量)為宜，低于1.0％或高于3.0％均對(duì)其生長(zhǎng)不利。
本黃花烏頭發(fā)根在無激素培養(yǎng)液內(nèi)可生長(zhǎng)，但在附加NAA等生長(zhǎng)素后，生長(zhǎng)更為快速，濃度以0.2mg/L為宜。
5、培養(yǎng)條件對(duì)黃花烏頭發(fā)根生長(zhǎng)的影響在室內(nèi)自然光下，光對(duì)黃花烏頭發(fā)根生長(zhǎng)表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，其生物量?jī)H為黑暗培養(yǎng)條件下的1/3。
培養(yǎng)溫度以在22-25℃為宜。
實(shí)施例2、黃花烏頭發(fā)根的培育取盆栽黃花烏頭新鮮、健康的莖，洗凈；用0.1％的升汞滅菌10min，無菌水漂洗4次，每次不少于1min，然后吸干表面水分；再于超凈臺(tái)上將葉片切成0.5cm×1.0cm大小，轉(zhuǎn)移到已滅菌的1/2MS固體培養(yǎng)基上(每瓶5片)；于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)6d。
挑取發(fā)根農(nóng)桿菌15834單菌落，接種于5mL液體YEB內(nèi)，28℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)過夜，于次日接種到50ml液體YEB中繼培養(yǎng)4-6h后備用。
將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃花烏頭莖浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，感染20min，然后，用無菌濾紙將菌液吸凈，再接種于含抗生素1/2MS固體培養(yǎng)基(所用的抗生素為羧芐青霉素；濃度為500mg/L)上，約經(jīng)過50d培養(yǎng)生出發(fā)根。
切割下由外植體上長(zhǎng)出的發(fā)根，置于含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基(所用的抗生素為頭孢拉定；濃度為400mg/L)上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)，每4d轉(zhuǎn)繼代1次，進(jìn)行4次；將無菌的發(fā)根1.0g移入盛有50mL 1/2B5液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶?jī)?nèi)，于黑暗條件下，室溫22℃-25℃，110rpm轉(zhuǎn)速下懸浮培養(yǎng)，每30天傳代一次，傳代4次得到黃花烏頭發(fā)根800g。
黃花烏頭的其他器官可以采用與之相同的方法經(jīng)過轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)得到黃花烏頭發(fā)根。
權(quán)利要求
1.一種黃花烏頭發(fā)根，是以黃花烏頭器官為外植體材料，以發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)發(fā)根培養(yǎng)后得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花烏頭發(fā)根，其特征在于所述黃花烏頭葉片在轉(zhuǎn)染前還在1/2MS固體培養(yǎng)基上于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-7天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃花烏頭發(fā)根，其特征在于所述抗生素選自頭孢拉定、頭孢氨芐青霉素或羧芐青霉素；濃度為200mg/L-500mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃花烏頭發(fā)根，其特征在于所述發(fā)根培養(yǎng)是在含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基上于22℃-25℃下經(jīng)過30-50天培養(yǎng)生出發(fā)根。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的黃花烏頭發(fā)根，其特征在于所述黃花烏頭器官為葉片、根、莖、葉柄、花絲或花瓣。
6.一種獲得黃花烏頭發(fā)根的方法，包括如下步驟1)外植體的獲得將黃花烏頭器官經(jīng)消毒后轉(zhuǎn)移到1/2MS固體培養(yǎng)基上，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2-7天；2)轉(zhuǎn)化發(fā)根將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的黃花烏頭器官浸入發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中感染5-20分鐘，吸凈菌液后再接種于含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，在22℃-25℃下經(jīng)過30-50天培養(yǎng)，得到黃花烏頭發(fā)根。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述黃花烏頭發(fā)根還經(jīng)過去菌培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)；所述去菌培養(yǎng)是將發(fā)根從外植體上切割，在含抗生素的1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每3-5天繼代1次，進(jìn)行3-5次；所述擴(kuò)大培養(yǎng)是將經(jīng)過去菌培養(yǎng)的發(fā)根在1/2MS或1/2B5液體培養(yǎng)基中，于黑暗條件、22℃-25℃下進(jìn)行培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的獲得方法，其特征在于所述抗生素選自頭孢拉定、頭孢氨芐青霉素或羧芐青霉素；濃度為200mg/L-500mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述黃花烏頭器官為葉片、根、莖、葉柄、花絲或花瓣。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于步驟2)所述發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中菌液濃度高于1×106個(gè)/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃花烏頭發(fā)根及其獲得方法。本發(fā)明所提供的黃花烏頭發(fā)根，是以黃花烏頭器官為外植體材料，以發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)發(fā)根培養(yǎng)后得到的。本發(fā)明所獲得的黃化烏頭發(fā)根可以通過液體培養(yǎng)的方式進(jìn)行繁殖，繁殖速度快，生產(chǎn)周期短(約40天左右)，不受自然條件的影響，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)集約化生產(chǎn)，克服了人工種植黃花烏頭時(shí)所具有的繁殖速度慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、遺傳穩(wěn)定性差等缺陷；發(fā)根中藥用成分——關(guān)附甲素含量高，具有廣闊的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G7/00GK1884490SQ20061008952
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者李昌禹, 王英平, 楊福合, 盧淑波, 臧埔, 孫長(zhǎng)偉, 孔祥義 申請(qǐng)人:李昌禹