專利名稱：一種采用根瘤菌防治大豆根部病害的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到用兩種內(nèi)生細(xì)菌協(xié)同作用控制植物寄生線蟲和病原真菌引起的根部病害的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆胞囊線蟲病(soybean cyst nematode，SCN)，又稱大豆黃萎病、火龍秧子，長期以來是制約大豆生產(chǎn)的重要病害。該病害一般使大豆減產(chǎn)10％～30％，嚴(yán)重地塊可達(dá)70％～90％，甚至造成絕產(chǎn)，比任何一種單一病害所造成的危害都大。此病害在我國東北三省、內(nèi)蒙古和黃淮海大豆主產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，是一種極難防治的土傳病害。從世界范圍來看，SCN的為害和蔓延有日益加重的趨勢。
大豆根腐病是一種世界性病害，分布范圍廣，在世界各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，我國主要分布在東北和黃淮海大豆主要產(chǎn)區(qū)。大豆根腐病造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，僅在黑龍江墾區(qū)發(fā)病率達(dá)到75％-90％，減產(chǎn)10％-20％左右。而且大豆根腐病的病原菌種類包括以鐮刀菌為主的多種病原菌，這個特點(diǎn)使這種病害的防治顯得尤為困難。
大豆根部的這兩種主要病害都是是典型的土傳病害，土壤條件的復(fù)雜性使得各種防治措施均有其局限性，不能很有效的控制該病的發(fā)生。目前在我國的各大豆主產(chǎn)區(qū)的大豆生產(chǎn)不僅不能重茬，迎茬的大豆根病更重。
大豆根病的生物防治越來越受到人們的重視。利用內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害已成為國內(nèi)外在生物防治研究中的一個熱點(diǎn)。植物內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，具有其他微生物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如占據(jù)有利的生態(tài)位、能經(jīng)受住植物的防御反應(yīng)、與病原微生物直接作用及促生作用等。大量研究表明，內(nèi)生細(xì)菌在生長發(fā)育和代謝過程中產(chǎn)生多種具有拮抗性、競爭性的次級代謝產(chǎn)物或酶類物質(zhì)，通過直接或間接作用，抑制或殺死病原菌。同時由于內(nèi)生細(xì)菌與植物之間建立了一種和諧的關(guān)系，接種后易于在植物體上定殖，生防效果比較穩(wěn)定。同時由于是兩種細(xì)菌共同活體接種大豆根系，在土壤中和根系內(nèi)能夠定殖、繁殖，長期緩慢釋放防治效力，克服化學(xué)藥劑短效期的問題。同時根瘤菌作為生物菌肥，可以大量固定土壤和空氣中的氮素，為作物的生長發(fā)育提供必須的營養(yǎng)物質(zhì)，減少氮肥的施用量，為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
本研究正是基于上述情況和理論，以大豆胞囊線蟲和大豆鐮刀根腐病菌為靶標(biāo)，從大豆根瘤和根內(nèi)篩選能夠控制兩種病原微生物的細(xì)菌菌株，旨在建立控制大豆根部病害的新方法，為研究開發(fā)控制大豆根部病害的新型生物藥劑奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要是采用組織分離法從大豆根瘤和根系內(nèi)分離大量內(nèi)生細(xì)菌，以大豆胞囊線蟲和大豆鐮刀根腐病菌為靶標(biāo)，篩選對兩種病原微生物有拮抗作用的根瘤菌和芽孢桿菌。
本發(fā)明中所涉及的細(xì)菌菌株分別是枯草芽孢桿菌Snb2(Bacillus subtilis)和L396中華根瘤菌屬(Sinorhizobium sp.)根瘤菌，它們對大豆胞囊線蟲胞囊的孵化和二齡幼蟲均具有不同程度的抑制和毒性作用，同時對大豆根部病原真菌的拮抗作用也較為明顯。鑒于此，將這兩株細(xì)菌Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)進(jìn)行了更為深入的研究。
本發(fā)明還涉及用于防治大豆胞囊線蟲和大豆根腐病菌的一種新方法，方法中利用的是在本發(fā)明中提到的細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)復(fù)配而形成的。
本發(fā)明的細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)是通過試管種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)來制備獲得。
其具體方法如下1.兩株細(xì)菌的分離均采用組織分離法從大豆根瘤和根內(nèi)分離獲得。根瘤和根系消毒、清洗后，分別用YMA和NA培養(yǎng)基培養(yǎng)其內(nèi)生細(xì)菌。
2.試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基，即牛肉膏5g；蛋白胨5g；瓊脂17g；水1000mL，pH7.0-7.2。
3.液體發(fā)酵培養(yǎng)兩株細(xì)菌的液體發(fā)酵液分別采用以下配方L396的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有甘露醇0.5％-1.0％，酵母浸出汁0.02％-0.06％，K2HPO40.02％-0.07％，MgSO4.7H2O 0.007％-0.03％，Nacl 0.01％-0.03％，pH 7.0-7.2。
Snb2使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有蔗糖1.5％-2％、K2HPO40.05％-0.15％、MgSO4·7H2O 0.1％-0.5％、KCl 0.03％-4.5％、FeCl30.002-0.04％，CaCO30.1％-0.6％，pH為7.2。
將兩株菌株的試管種分別接種到250mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養(yǎng)基中，25℃～28℃下，搖床轉(zhuǎn)速以150r·min-1～200r·min-1、發(fā)酵240h。
本發(fā)明還涉及一種殺大豆胞囊線蟲制劑，其包含有效量的本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌Snb2(Bacillus subtilis)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium sp.)根瘤菌L396本身或其代謝物作為有效活性成分。
本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Snb2(Bacillus subtilis)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobium sp.)根瘤菌L396或其代謝物具有殺線蟲及抗菌活性物質(zhì)，可用于植物寄生線蟲和作物根部病害的生物防治，特別是大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)和大豆根腐病的防治。
具體實(shí)施例方式為了更詳細(xì)地進(jìn)一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實(shí)施例。
實(shí)施例1根瘤菌的分離純化保存的根瘤在95％酒精中浸泡15min，再置于0.1％HgCl2中處理3～5min，具體時間視根瘤大小的不同有變化，用無菌水清洗3次，取0.2ml最后一次無菌水沖洗液涂布接種于分離培養(yǎng)基上，觀察有無菌落產(chǎn)生，以此方法驗(yàn)證消毒方法是否能全部殺死供試樣品表面微生物。用無菌濾紙吸干表面水分，用無菌解剖刀在無菌濾紙上切開，放在YMA培養(yǎng)基上，2-3天后，從根瘤周圍取少量菌體在培養(yǎng)基上接種，28℃培養(yǎng)48h，取單個菌落在YMA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，直至得到純培養(yǎng)，挑取單菌落編號，用15％的甘油-牛肉蛋白胨培養(yǎng)液于4℃冰箱中保存。
實(shí)施例2大豆根瘤內(nèi)生芽孢桿菌的分離取大豆根瘤5g，無菌紗布包裹，浸入0.1％的Hgcl2中表面消毒10min，再用無菌水沖洗3-5次。驗(yàn)證消毒是否徹底方法同上。供試材料轉(zhuǎn)入無菌研缽中研磨成勻漿，加入5ml無菌水?dāng)噭颉?mL組織勻漿液置于80℃條件下水浴20min后，取0.2ml與NA分離培養(yǎng)基混和均勻，進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)1～2d，待平板長出菌落后，挑取菌落形態(tài)相異的單個菌落，經(jīng)2～3次純化，挑取單菌落編號，用15％的甘油-牛肉蛋白胨培養(yǎng)液于4℃冰箱中保存。
實(shí)施例3細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培養(yǎng)將兩株細(xì)菌采用劃線法接種到試管瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為NA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d，獲得試管種。
再將試管種分別接種到250mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養(yǎng)基中，25℃～28℃下，搖床轉(zhuǎn)速以150r·min-1～200r·min-1、發(fā)酵168h-200h。將發(fā)酵液按照不同的配比關(guān)系復(fù)配，測定殺線蟲及抗菌藥效試驗(yàn)。
實(shí)施例4細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培養(yǎng)基本同實(shí)施例3，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為L396的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有甘露醇0.7％，酵母浸出汁0.5％，K2HPO40.4％，MgSO4.7H2O 0.024％，Nacl 0.3％，pH 7.0。
Snb2使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有蔗糖1.6％、K2HPO40.12％、MgSO4·7H2O 0.36％、KCl 2.7％、FeCl30.028％，CaCO30.45％，pH為7.2。
實(shí)施例5細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培養(yǎng)基本同實(shí)施例3，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為液體培養(yǎng)基配方為蔗糖(6％)、硫酸銨(3％)、K2HPO4(2％)、MgSO4·7H2O(0.5％)、KCl(5.2％)、FeSO4(0.04％)，pH 6。
實(shí)施例6細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的培養(yǎng)基本同實(shí)施例3，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為液體培養(yǎng)基配方為蔗糖(5％)、硫酸銨(7％)、K2HPO4(1.5％)、MgSO4·7H2O(0.3％)、KCl(4.5％)、FeSO4(0.01％)，pH 6.8。
實(shí)施例5細(xì)菌菌株Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的殺線蟲及抗菌活性將兩株細(xì)菌Snb2和L396的發(fā)酵原液以5-9∶2-4的濃度混合，作為生防藥劑，分別測定對大豆胞囊線蟲和大豆根腐病菌的作用效果。
實(shí)施例6基本同實(shí)施例5，不同之處在于兩株細(xì)菌發(fā)酵液使用配比，其濃度配比為將細(xì)菌Snb2(Bacillus subtilis)和L396(Sinorhizobium sp.)的發(fā)酵原液以5∶2、5∶4、7∶2；7∶3和8∶3的濃度混合，測定對大豆胞囊線蟲的毒殺作用和對大豆根腐病菌的拮抗效果。
實(shí)施例7以不同濃度比例混合的兩細(xì)菌菌株代謝物制備為水劑、粉劑或膠懸劑，可以采用拌種、種子包衣、灌根和土壤處理等各種方法施用到田間，以便更好的發(fā)揮防病控病的作用。
1供試材料1.1大豆胞囊線蟲胞囊3號生理小種的獲得分離自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲學(xué)研究室試驗(yàn)田土樣。采用改良的淘洗過篩法從土壤中收集大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)，將土壤放入適量水中，攪拌均勻，靜置2-3min后，上層懸液過篩(40目和60目)，重復(fù)三次。棄去上層40目篩上的殘余物，收集60目網(wǎng)篩上的剩余物于燒杯中。用漏斗過濾燒杯中的液體，過濾的雜質(zhì)和胞囊一并轉(zhuǎn)移到表面皿里，在解剖鏡下用挑針挑出新鮮飽滿的胞囊，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 1.2大豆胞囊線蟲二齡幼蟲(J2)的準(zhǔn)備將大豆胞囊線蟲3號生理小種的胞囊在0.5％NaClO中消毒5min，無菌水沖洗3次，放在含有少量無菌水的培養(yǎng)皿里，在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，5d后收集孵化出的J2。
1.3大豆根腐病病原菌以尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)為主要代表，包括茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、腐霉菌(Pythium sp.)，均由本研究室分離、保存。
2試驗(yàn)方法2.1細(xì)菌Snb2和L396的代謝物混合物對線蟲的作用用移液槍吸取按照一定配比關(guān)系的細(xì)菌發(fā)酵液1mL菌懸液加入到已滅菌的小皿中，再加入約含40條大豆胞囊線蟲二齡幼蟲懸液0.1mL，置于28℃恒溫箱中，以無菌水作為對照，分別在48h、96h觀察線蟲的死亡情況(以身體僵直，觸而不動者為死蟲態(tài))，記算線蟲的死亡率，。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。
2.2細(xì)菌Snb2和L396的代謝物混合物對對胞囊孵化的影響取新鮮、成熟度一致的胞囊，用1.2描述的消毒方法消毒后，放入由夾無菌濾紙的雙層套管制成的孵化池中。孵化池放在無菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)盛以7∶3濃度混合的細(xì)菌代謝物混合物，無菌水處理為對照，，28℃下孵化每個處理設(shè)置3次重復(fù)。7d后鏡檢計(jì)算孵化出的二齡幼蟲數(shù)量。
2.3細(xì)菌Snb2和L396的代謝物混合物對大豆根腐病病原菌的拮抗活性測定采用對峙培養(yǎng)方法。先將供試的4種病原菌先活化7d，用直徑為5mm的打孔器在菌落邊緣處制成菌碟，將菌碟轉(zhuǎn)移至PDA平板中央，在距菌碟25mm、靠近平板邊緣均勻放置牛津杯，內(nèi)盛以7∶3濃度混合的細(xì)菌代謝物，放置在25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d。為觀察病原菌生長的變化、病菌菌落的半徑、抑菌圈直徑。
2.4細(xì)菌Snb2和L396的代謝物制劑對大豆胞囊線蟲病防效按Snb2和L396代謝物以8∶3比例混合的發(fā)酵液制備成水劑，大豆種子用該水劑包衣后播種在大豆胞囊線蟲嚴(yán)重發(fā)生的地塊，以空白為對照。大豆出苗后常規(guī)管理，不施用任何肥料和其它農(nóng)藥，在30～35天期間，每天監(jiān)測對照中白色雌蟲發(fā)育情況，到達(dá)最適宜時期，將苗從營養(yǎng)缽中扣出，檢測根系胞囊數(shù)量。
3試驗(yàn)結(jié)果
3.1細(xì)菌Snb2和L396的混合發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲2齡幼蟲的毒殺效果(見表1)結(jié)果表明，兩株細(xì)菌的各配比發(fā)酵液和無菌水對照之間差異顯著，8∶3、7∶2、7∶3對線蟲的相對致死率都達(dá)到了85％以上，其中8∶3、7∶2之間差異不顯著。
3.2細(xì)菌Snb2和L396的混合發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲胞囊孵化的影響(見表2)結(jié)果表明，兩株細(xì)菌的各配比發(fā)酵液和無菌水對照處理的卵囊之間，對線蟲孵化影響差異顯著，特別是配比為8∶3和7∶2的混合發(fā)酵液幾乎不能使胞囊孵化，其相對抑制率都達(dá)到95％以上。
表1細(xì)菌Snb2和L396的混合發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲2齡幼蟲的影響

表2細(xì)菌Snb2和L396的混合發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲胞囊孵化的影響

3.3細(xì)菌Snb2和L396的混合發(fā)酵液對大豆根腐病病原菌的拮抗活性測定(見表3)通過對峙培養(yǎng)法測定對根部病原菌的拮抗作用表明，兩株細(xì)菌的各配比發(fā)酵液和對照之間差異顯著，8∶3、7∶2、7∶3對抑菌圈半徑均在10mm以上，三者之間差異不顯著。
表3細(xì)菌Snb2和L396的混合發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的抑菌效果

3.4細(xì)菌Snb2和L396的代謝物制劑對大豆胞囊線蟲病防效通過用代謝物制劑對大豆種子進(jìn)行包衣處理后發(fā)現(xiàn)，該制劑對大豆種子萌發(fā)率影響不大，出苗比較整齊。與對照相比較，處理的大豆根部胞囊數(shù)量明顯減少，對胞囊有明顯的抑制作用，對照根部平均胞囊量為63個，最多達(dá)89個，而經(jīng)過混合代謝物包衣處理的大豆根部平均胞囊量為13.5個，防治效果達(dá)到78.6％。
兩株菌株保藏于中國.北京.中關(guān)村，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2006年10月27日，保藏編號CGMCC No.1850(分類命名枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis)，CGMCC No.1851(分類命名中華根瘤菌屬Sinorhizobium sp.)。
通過采用不同的方法測定了根瘤菌L396和枯草芽孢桿菌Snb2不同配比濃度的混合代謝物對大豆根部主要病原微生物的致死、拮抗作用，結(jié)果顯示根瘤菌L396和枯草芽孢桿菌Snb2的代謝物混合液能夠明顯表現(xiàn)出對大豆根部病原微生物的防治效果，表明兩株來自于大豆根系的根瘤菌和芽孢桿菌，能夠協(xié)同防治大豆根部病害，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明為利用根瘤菌和芽孢桿菌的活菌劑來控制大豆根病的一種新方法。該方法采用兩株具有拮抗大豆根部病原真菌和殺線蟲活性的細(xì)菌菌株，其特征在于，根瘤菌和芽孢桿菌分別為中華根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)菌株L396和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株Snb2，其特征為具有拮抗大豆根部病原真菌和殺線蟲活性，來自大豆根瘤中。這兩株細(xì)菌已于2006年10月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號如下中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)菌株L396保藏號為CGMCC No.1851；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株Snb2保藏號為CGMCC No.1850；
2.權(quán)利要求1所述的豆科作物根病是指大豆由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐鐮刀菌(Fusarium solani)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、腐霉菌(Pythium sp.)和大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)所引起的病害。
3.兩種用于防治大豆胞囊線蟲和大豆根腐病的細(xì)菌本身及其代謝物，其特征在于，是由權(quán)利要求1所述的兩株細(xì)菌經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵制備的，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方分別為L396的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有甘露醇0.5％-1.0％，酵母浸出汁0.02％-0.06％，K2HPO40.02％-0.07％，MgSO4·7H2O 0.007％-0.03％，NaCl 0.01％-0.03％，pH 7.0-7.2。Snb2使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，含有蔗糖1.5％-2％、K2HPO40.05％-0.15％、MgSO4·7H2O 0.1％-0.5％、KCl 0.03％-4.5％、FeCl30.002-0.04％，CaCO30.1％-0.6％，pH為7.2。
4.一種殺線蟲、抗真菌制劑，其特征在于，包含有效量的權(quán)利要求1所述的細(xì)菌或權(quán)利要求2所述的細(xì)菌代謝物作為活性成分。
5.一種殺線蟲、抗真菌的制劑，其特征在于，包含權(quán)利要求2所述的細(xì)菌液體代謝物以不同配比關(guān)系混合的發(fā)酵液。
6.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌或權(quán)利要求3所述的細(xì)菌代謝物或權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的殺線蟲、抗真菌制劑在植物寄生線蟲和病原真菌生物防治中的應(yīng)用。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法形成的產(chǎn)品可以是水利、粉劑或膠懸劑，施用方法可以采用拌種、種子包衣、灌根和土壤處理等各種方法。
全文摘要
本發(fā)明中采用的方法是利用大豆根瘤和根內(nèi)生細(xì)菌防治以大豆胞囊線蟲和大豆根腐病菌為主要病原微生物的大豆根部病害，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中具體涉及的細(xì)菌菌株已于2006年10月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號如下中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)菌株L396保藏號為CGMCC No.1851；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株Snb2保藏號為CGMCC No.1850；通過常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，以其本身或其代謝物作為有效活性成分，將發(fā)酵原液按照不同配比濃度混合，對大豆胞囊線蟲和大豆根部病原真菌的具有明顯的抑制作用，Snb2和L396發(fā)酵液濃度配比為8∶3時，使二齡幼蟲的死亡率達(dá)到98.92％，對胞囊孵化的相對抑制率達(dá)到99.66％，且防效穩(wěn)定持久，將8∶3比例混合的代謝物制備為水劑，田間對大豆胞囊線蟲的防效達(dá)到78.6％。同時根瘤菌具有固氮促生的作用，使該制劑具有固氮防病的協(xié)同功能，用于防治大豆根部病害，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號A01P5/00GK1951197SQ200610137800
公開日2007年4月25日 申請日期2006年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月1日
發(fā)明者段玉璽, 王媛媛, 陳立杰 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)