專利名稱：：嗎啉化合物在防止細菌污染中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及防止在醫(yī)療設備和含流體的儲存產(chǎn)品上形成生物被膜。
背景技術：
：生物被膜被簡單描述為"包埋于有機聚合物基質中、附著于表面的樣i生物群落"(Carpentier,1993.J.Appl.Bacteriol.75:499—511)。所有生物被膜均含有三種基本成分微生物、糖萼和表面。若除去這其中的一個組分，則生物被膜不能進一步發(fā)展。生物被膜可由一種細菌菌種形成，但通常生物被膜由多種細菌菌種與真菌、藻類、原生動物、碎片和腐蝕產(chǎn)物組成。生物被膜可在幾乎任何暴露于細菌和一定量水的表面上形成。細菌附著于合適的(生物或非生物)表面和隨后發(fā)展生物被膜的過程由W.MichaelDunneJr，ClinMicrobiolRev.2002Apr;15(2):155-66所綜述。細菌的附著由多個參數(shù)決定，包括細菌菌種、表面組成、環(huán)境因子和主要的基因產(chǎn)物。簡而言之，生物被膜在細菌附著于水環(huán)境中的表面并且開始分泌帶有粘性的膠狀物質時形成，該膠狀物質可將其錨定在一系列物質如金屬、塑料、土壤顆粒、醫(yī)療植入物材料和組織等上。初始粘附通過符合條件的表面(conditionedsurface)和浮游微:生物的偶然相遇而出現(xiàn)。更進一步概括，細菌和非生物表面的初始粘附受非特異性(如疏水性)相互作用介導，而與活組織或失活組織的粘附卻通過特異性分子(凝集素、配體或粘附素)對接機制完成。這個階段是可逆的，由限定細菌細胞表面和符合條件的所研究表面之間的相互作用的物理化學參數(shù)所決定。初始粘附之后，會出現(xiàn)錨定階段，其中結合松散的生物通過產(chǎn)生與表面結合的表多糖鞏固附著，由此不可逆轉地附著至該表面。一旦細菌不可逆地附著，則開始進入生物被膜的成熟期。由于表面結合的生物活躍地復制(和死亡)，并且(由附著細菌產(chǎn)生的)胞外組分與鄰近環(huán)境中的有機和無機分子相互作用形成了糖萼，所以生物4皮膜的總體密度和復雜性升高。表多糖形成了糖萼(除水之外)的主要組分，大部分菌種中的糖萼主要是陰離子性的，還能捕獲養(yǎng)分并且保護細菌免于環(huán)境傷害。就被感染的生物醫(yī)療植入物而言，糖萼可包括附著于植入物的、來源于宿主的炎癥應答蛋白或基質蛋白如補體、血纖蛋白原和葡胺聚糖等。生物被膜的生長潛力受限于鄰近環(huán)境中養(yǎng)分的可用性、這些養(yǎng)分向生物被膜內(nèi)細胞的灌注以及廢物的除去。流過生物被膜的具有最佳水動力學的流體有助于最外層的生長和灌注而非侵蝕。調控生物,皮膜成熟的其它因素包括內(nèi)部pH、氧灌注、碳源和滲透性。在臨界質量時達到動態(tài)平衡，此時，生長的最外層(距離表面最遠)形成了浮游生物。這些生物可自由地脫離生物被膜并在其它表面定居。由于缺乏養(yǎng)分或灌注、pH下降、p02下降或有毒代謝副產(chǎn)物的累積，距離表面最近的細胞開始休眠或死亡。一旦錨定至表面，生物被膜微生物根據(jù)周圍的環(huán)境條件進行多種有害或有益反應(根據(jù)人類的標準)。表面微生物生物被膜每年在設備損壞、產(chǎn)品污染、能量損耗和醫(yī)學感染方面耗費掉數(shù)十億美元。殺傷細菌的常規(guī)方法(如抗生素和消毒)通常對于生物被膜細菌無效，這部分是由于糖萼的保護性。除去生物被膜細菌系統(tǒng)所需的大量抗^:生物劑并不環(huán)保(并且可能不受環(huán)境法規(guī)允許)和在醫(yī)學上并不實用(原因在于殺傷生物被膜細菌所需的量也對患者有副作用)。盡管對阻礙細菌附著的表面或表面包被物已有描述(例如Shengetal，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.38:1-5),但是并5殳有開發(fā)出防止這種附著的表面或表面包被物(pl-ll，Lappin-ScottandCosterton:MicrobialBiofilms1995.CambridgeUniversityPress)。因此，需要新的方法來控制生物被膜形成。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于這樣一個認識地莫匹醇(delmopinol)及其衍生物可用來防止或減少生物被膜的形成或確保生物被膜處于非病原性(非活性)狀態(tài)。這可應用到工業(yè)上，包括防止生物被膜在外科手術設備或水儲存或送遞設備上形成。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，具有式(I)的化合物或其鹽可用來防止或減少生物被膜在表面形成，或者防止或減少活微生物在表面生長，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(I)其中l(wèi)是位于嗎啉環(huán)2-或3-位的含8至16個碳原子的直鏈或支鏈烷基，！U是含2至1()個碳原子的直鏈或支鏈烷基，在除a位以外的位置被羥基取代，基團Ri和R2的碳原子數(shù)總和至少為10,優(yōu)選為10至20。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，上述化合物用于在外科手術之間處理手術器具的用途。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，被上述化合物浸漬的藥簽。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，涂覆有上述化合物的醫(yī)療設備。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，涂覆有上述化合物的濾器、輸水管或流體儲存槽。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，包含上述化合物的容器用于處理表面以防止或減少在所述表面上形成生物被膜，或防止或減少活微生物在所述表面上生長。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，容器含有多個獨立的密封包裝，每個包裝含有單位劑型液體形式的上述化合物。具體實施例方式本發(fā)明基于這樣一個令人驚喜的發(fā)現(xiàn)地莫匹醇及其衍生物可防止或減少生物被膜形成并且/或者可確保任何細菌生物被膜無活性，即處于非存活狀態(tài)。本文所使用的術語"生物被膜"指的是本領域中該術語公認的含義，即附著于表面的微生物群落以及相關糖萼。本領域存在多個定義，這其中的每個定義均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，Carpentier(參見上文)將生物被膜描述為"包埋于有機聚合物基質中、附著于表面的樣i生物群落，，；Costerton(1999Science284:1318-1322)將生物被膜描述為"被自身產(chǎn)生的聚合基質包圍并粘附于惰性或活性表面的結構化細菌細胞群落，，；Elder(1995Eye9:102-109)以更為協(xié)作的術i吾將生物被膜描述為"聚集在大量胞外聚合物(exopolymer)基質內(nèi)的微生物的功能性聚生體"。用于本發(fā)明的化合物具有上述通式(I),其中IU是位于嗎啉環(huán)2-或3-位的含8至16個碳原子的直鏈或支鏈烷基，Rz是含2至10個^Lf、子的直鏈或支鏈烷基，在除a位以外的位置被鞋基取代，基團Ri和R2的碳原子數(shù)總和至少為10，優(yōu)選為10至20。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述化合物為地莫匹醇，即3-(4-丙基-庚基)-4-(2-羥乙基)嗎啉，一種已知的化合物。用于本發(fā)明的化合物的制備方法描述于US4894221，其內(nèi)容通過援引納入本文。在下面的描述中提及"防止或減少生物被膜形成"。但是，本發(fā)明還包括處理表面以防止或減少"活性"生物被膜的形成?；钚陨餅橐曰钗⑸餅樘卣鞯纳锉荒?。因此，提及防止生物被膜形成時，包括防止或減少活微生物復合物或集落的形成或減少這類復合物或集落的形成。"減少"可通過與未處理表面相比較而測量。該化合物可用來處理任何表面。事實上，任何表面——動物、礦物質或植物(即生物的或非生物的)一一均可能適合細菌定居和生物被膜形成，包括接觸鏡、船體、奶制品和石油管道以及全部類別的生物醫(yī)療植入物和經(jīng)皮設備；因此，該化合物可用來防止生物被膜在這其中的任何一種表面上形成。該化合物在防止在醫(yī)療設備上形成生物被膜方面特別有益，所述醫(yī)療設備例如外科手術植入物，包括人工關節(jié)如髖關節(jié)、矯形手術器具如針、盤和線、人工肢體/假肢、心瓣膜、支架、接觸鏡和用于送遞流體、養(yǎng)分和藥物或用于除去流體和廢物的設備，如導管。為避免分歧，本文所使用術語"醫(yī)療設備"包括美容方法所使用的設備和植入物。該化合物還可用來防止在植入受試者的識別標簽和信息標簽或電子芯片上形成生物^皮膜。本發(fā)明的化合物還可用來處理手術器具如外科手術刀、鋸、解剖刀、鑷子等，或用于侵入性外科手術的任何其它器具。醫(yī)療設備可為植入物，即插入受試者體內(nèi)的i殳備。在一個優(yōu)選的實施方案中，該設備為外科手術植入物，該植入物需要對身體進行切口來植入。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，待處理裝置為牙植入物，如固定牙齒的牙針或牙螺釘。或者，醫(yī)療設備與身體相接觸但不i^v身體，如假肢、管形石膏、接觸鏡或外用助聽器。就接觸鏡而言，本發(fā)明的化合物可浸漬到該接觸鏡的表面。或者，就水凝膠型接觸鏡而言，該化合物可浸漬到水凝g質中?；蛘?，該化合物可存在于用來保存或清洗接觸鏡的溶液中。植入設備(或與"M目接觸)的受試者可為人或動物，即獸醫(yī)學應用也在本發(fā)明范圍內(nèi)。該化合物通常涂覆于待處理的表面或設備上。有很多方法可將該化合物涂覆于合適的物質上，包括噴灑涂覆、輻射和紫外固化。用生物材料涂覆醫(yī)療設備的技術現(xiàn)已有所改進，并且這些技術可應用到本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括被涂覆的材料，特別是涂覆有式I的化合物的醫(yī)療設備。由于涂覆有式I化合物的濾器或輸水管是經(jīng)涂覆的流體儲存或流體送遞設備，因此也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。待涂覆材料可為金屬、塑料、陶瓷、聚苯乙烯或玻璃。優(yōu)選地，待涂覆材料為金屬如不銹鋼。本發(fā)明的化合物可以通過共價鍵或非共價鍵連接與被處理表面相結合。若以共價方式結合，則使用連接分子來將該化合物連接至該表面。例如，聚乙二醇(PEG)為可用于本發(fā)明的有用連接底物。氨基化也可用來提供有效的連接分子?；蛘?，該化合物可浸漬至基質如聚合物基質中。常規(guī)生物相容聚合物基質可用來將該化合物保留在該表面上。例如，poly(organo)phophazene、親水性水凝膠(如甲基丙烯酸-2-羥乙酯、HEMA)或珪基涂覆物(如氟硅酮)均用作醫(yī)療設備上的常規(guī)涂覆物，并且可用來保留本發(fā)明的化合物。合適的涂覆方法公開于US2005/0187611，其內(nèi)容通過援引納入本文。在一個優(yōu)選的實施方案中，醫(yī)療設備在被插入待放置植入物的受試者體內(nèi)或與受試者(體表)相接觸之前或期間與式I化合物相接觸。更優(yōu)選地，該設備在與受試者相接觸之前或期間裙J亥化合物沖洗。更優(yōu)選地，沖洗之后立即與受試者相接觸，隨后進行干燥使得該化合物涂覆于該i殳備上。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括包含于容器內(nèi)的一定量的適合一次施用至醫(yī)療設備或其它表面的式I化合物。優(yōu)選地，容器內(nèi)表面、其內(nèi)環(huán)境和內(nèi)含物(如地莫匹醇)是無菌的，即滅菌的，并且基本不含病原體，因此適合用于醫(yī)學(或美容)手術如外科手術。更優(yōu)選地，外表面也是無菌的。任何適合容納液體的容器均可使用，優(yōu)選容器可被密封。優(yōu)選的容器為生產(chǎn)時可無菌密封并且在需要時可剪開或撕開的小袋或小包。優(yōu)選地，小袋可由軟塑料或金屬材料制備；合適的小袋為本領域所熟知。其它合適的容器包括任何材料的瓶、罐和管，所述材料優(yōu)選為玻璃或塑料。在一個優(yōu)選的實施方案中，容器為儲存或清洗接觸鏡的容器。適合不同應用的容器大小(由此預先決定儲存在其中的化合物的劑量)對于本領域的技術人員而言是顯而易見的，例如，髖關節(jié)植入物比(標準)導管需要更大量的地莫匹醇。優(yōu)選每個容器均"一次性使用"，即一旦將容器打開并使用了內(nèi)含物，則不管是否使用了所有內(nèi)含物均將其棄去。這具有將任何可能的污染最小化的優(yōu)點。本發(fā)明的化合物可以任何合適濃度存在于容器中。一般而言，化合物的濃度為0.01%(w/v)至10y。(w/v)，優(yōu)選O.1%(w/v)至50/。(w/v)，并且最優(yōu)選1%(w/v)至3。/。(w/v)如2。/。(w/v)。該化合物一般存在于水溶液中，但也可使用包括醇在內(nèi)的其它任何合適的溶劑。式I化合物可浸漬于用來與防止生物被膜在其上形成的表面相接觸的材料之上。該材料可以為紡織品或非紡織品。紡織材料一般用來擦拭表面；合適的紡織材料的非限制性實例包括藥簽、布料、抹布或墩布。紡織材料可包含天然纖維(如棉花)或合成纖維(如尼龍)，或兩者的組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，浸漬材料可為適合用于醫(yī)療環(huán)境的無菌/滅菌"一次性使用"材料，如繃帶。最舞選地，該材料在上述容器中提供；該容器可僅含有該浸漬材料，或含有該浸漬材料和過量適合沖洗表面的化合物(除了將表面與浸漬材料相接觸，或者不將表面與浸漬材料相接觸)。式I化合物還可用于其它工業(yè)應用，此時流體如水將與表面相接觸。在一個優(yōu)選的實施方案中，該化合物用來防止在包括水純化或運輸系統(tǒng)(包括輸水管和蓄水池)在內(nèi)的水或流體送遞或儲存系統(tǒng)內(nèi)形成生物被膜。在另一個優(yōu)選的實施方案中，表面自身由本發(fā)明的化合物涂覆或浸漬。該實施方案特別適用于將在固定位置停留較長一段時間的表面，例如上述醫(yī)療i殳備和水或流體送遞系統(tǒng)。化合物可以常規(guī)方式與待處理表面相接觸。例如，可將化合物制備為'溶液并將該溶液與表面相接觸?；衔锟捎脕頉_洗或擦拭上述表面。在一個更優(yōu)選的實施方案中，該化合物被噴灑至所述表面。在該實施方案中，化合物可在適合產(chǎn)生含所述化合物的滴霧的氣溶膠罐、噴霧瓶或其它相似設備中配制。這種方法可以有效地使該化合物與很大的表面相接觸。這種方法對于與形狀不好處理的表面或精細表面如接觸鏡相接觸而言也特別有效?；衔锟梢砸阅塬@得所需效果的任何合適形式送遞。該化合物可包含在控釋制劑內(nèi)或儲存于可控釋該化合物的裝置內(nèi)?？蒯屩苿┛膳c上述任何其它實施方案一起使用，例如控釋制劑可浸漬至表面內(nèi)或通過噴灑送遞。本發(fā)明化合物可以其鹽的任何形式使用。具體而言，該化合物可為其酸鹽形式(如鹽酸地莫匹醇)或其在水溶液中的較低溶解度形式。這樣即便是在沖洗之后，該化合物依然可保留在處理設備的表面。有效防止生物被膜形成的量對于本領域的技術人員而言是顯而易見的，并且可以基于待處理表面而確定。下列非限制性實施例將對本發(fā)明進行進一步描述。實施例本研究包括下列測試材料外科用不銹鋼316(用于例如心瓣膜)鈦(用于例如髖關節(jié)植入物)可獲得圓片形式的不同材料，圓片的直徑約為30mm，厚度約為l咖。然后將這些圓片置于Petri培#底部。滿'必合錄將鹽酸地莫匹醇溶解于UHQ級水中，使其濃度為20mg/mL(2%w/v)。室溫下避光保存該溶液，直至使用。^^^^寧義理^y試4面方法A:用2raL2%的鹽酸地莫匹醇水溶液處理測試表面，并在室溫下靜置15分鐘。用移液管除去全部地莫匹醇溶液。然后用4mL磷酸鉀緩沖液(10mM，pH7.2)將孔徹底沖洗三次。由于地莫匹醇的pKa為7.1，大部分的化合物都會轉化成堿，該堿在水溶液中溶解度非常低，因此在沖洗期間將會停留在表面且不會被完全洗掉。方法B:用2mL2%的鹽酸地莫匹醇水溶液處理測試表面，并過夜干燥。録參從皮膚分離到表皮葡萄球菌("a/7At7ococcmep/VerizwW/s)的新鮮菌林并在-80'C于奶粉中保存。進行實驗前一天，將細菌轉移至血瓊脂并在95%h2和5%c02氣體中于371c過夜培養(yǎng)。從血瓊脂收集集落形成單位并將其懸浮于IOmM磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，使其光密度在600nm為0.4,這對應約1()8個細胞/mL。才艮據(jù)制造商的^兌明書《吏用活/死細菌活力(Live/DeadBacterialViability)方法(MolecularProbes,Inc.Eugene,0R，USA),通過熒光顯微鏡估算細菌懸浮液的細菌活力(表示為活力百分比)。因此，將SYT09(1.5pL)和^^f匕丙啶(1.5pL)與1mL10mM磷酸緩沖液(pH7.2)混合。將等分為10的一份混合液加入10mL細胞懸浮液，并在1000x熒光顯微鏡(LeitzAristoplan顯微鏡，配有鹵素燈和470-490nm激光濾光片)下分析，綠色代表活細胞，紅色代表死細胞。所有情況下，細胞培養(yǎng)物的活力均大于95%。餘粉浙法將4mL細菌懸浮液加至置于Petri培#^中的涂覆和非涂覆測試表面上。讓細胞在37X:附著60分鐘。通過用4mL緩沖溶液將表面沖洗三次除去未附著細胞。除去表面上的全部液體并使用上述染料SYTO9和碘化丙啶顯現(xiàn)粘附細菌。將10pL的等分混合液加至表面并在避光孵育10分鐘后分析。每個圓片取10個視野對附著細胞的顯微成像進行分析。用與顯微鏡連接的數(shù)碼相機捕獲圖像并將其用來對各個視野中的附著細胞數(shù)目進行平均。使用數(shù)學程序MATLAB對附著細胞的數(shù)目以及活細胞百分比進行估算。脫離分析法如上所述在涂覆地莫匹醇的表面上制備附著細胞群。為測試細胞是否從具有地莫匹醇的表面脫離，可用溶于水的2%地莫匹醇將表面沖洗三次，隨后用熒光顯微鏡進行分析。I.地莫匹醇包被物對附著的影響使用了三次平行的細菌茵林培養(yǎng)物，并給出不同次數(shù)的平均值。附著細胞的總數(shù)(活細胞數(shù)和非活細胞數(shù))示于表l。比較對地莫匹醇涂覆或未涂覆表面的附著情況。圖示出2%鹽酸地莫匹醇溶液預處理或未預處理的給定表面上的細胞數(shù)目/咖2。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>n.地莫匹醇包4皮物對細菌活力的影響如上所述用三次平行的細菌菌林進行處理并在表2示出不同次數(shù)的平均值。比較地莫匹醇涂覆或未涂覆表面上的細菌活力情況。圖示出給定測試表面上的活細胞百分比。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>m.處理和未處理表面的附著細菌的生長情況通過將4mLTrypticYeastExtract培養(yǎng)基加至每個孑L內(nèi)，并在37'C培養(yǎng)，以確定細菌在涂覆和未涂覆表面上生長的能力。結果表明在固體表面上的生長受到地莫匹醇涂覆物抑制(表3)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>總之，地莫匹醇涂覆表面顯著降低了附著細胞的活力，并且地莫匹醇顯著抑制了表面相關細菌的生長。權利要求1.具有式(I)的化合物或其鹽用于防止或減少在表面形成生物被膜或防止或減少活微生物在表面生長的用途，其中R1是位于嗎啉環(huán)2-或3-位的含8至16個碳原子的直鏈或支鏈烷基，R2是含2至10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，在除α位以外的位置由羥基取代，基團R1和R2的碳原子數(shù)總和至少為10，優(yōu)選為10至20。2.權利要求l的用途，其中所述化合物為地莫匹醇。3.權利要求1或權利要求2的用途，其中所述表面為醫(yī)療設備或形成醫(yī)療設備的一部分。4.權利要求3的用途，其中所述醫(yī)療設備為外科手術植入物。5.權利要求1或權利要求2的用途，其中所述表面為接觸鏡或形成接觸鏡的一部分。6.權利要求1或權利要求2的用途，其中所逸表面為流體儲存或送遞裝置。7.權利要求6的用途，其中所述表面為濾器或輸水管。8.上述權利要求任一項的用途，其中所述表面由所述化合物浸漬或涂覆。9.上述權利要求任一項的用途，其中所述化合物為控釋制劑形式，或包含在可控釋所述化合物的設備內(nèi)。10.含有具有式(I)的化合物或其鹽的材料用于防止在表面形成生物被膜的用途。11.權利要求10的用途，其中所述材料為紡織品。12.權利要求1的化合物用于在外科手術之前處理手術器具的用途。13.由權利要求1的化合物浸漬的藥簽。14.一種醫(yī)療設備，其中所述設備由權利要求l的化合物涂覆。15.權利要求14的醫(yī)療設備，其中所述化合物為地莫匹醇。16.權利要求14或權利要求15的醫(yī)療設備，其中所述醫(yī)療設備為外科手術植入物。17.權利要求14或15任一項的醫(yī)療設備，其中所述設備為接觸鏡。18.權利要求14或15的醫(yī)療設備，其中所述設備為牙;tt^物、導管、支架、導線或整形假體。19.由權利要求1的化合物涂覆的濾器或輸水管。20.—種流體儲存或流體送遞裝置，由權利要求1的化合物涂覆。21.含有權利要求1或權利要求2的化合物的容器，用于處理表面以防止或減少生物被膜在所述表面形成，或防止或減少活微生物在所述表面生長。22.含有多個封閉包裝的容器，每個包裝含有液體形式的單位劑型的權利要求1或權利要求2的化合物。全文摘要一種式I的化合物用于防止生物被膜在表面形成，其中R₁是位于嗎啉環(huán)2-或3-位的含8至16個碳原子的直鏈或支鏈烷基，R₂是含2至10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，在除α位以外的位置由羥基取代，基團R₁和R₂的碳原子數(shù)的總和至少為10，優(yōu)選為10至20。該化合物作為包括支架、導管和線材導板在內(nèi)的醫(yī)療設備的涂覆物或處理物特別有用。文檔編號A01N33/08GK101111221SQ200680003714公開日2008年1月23日申請日期2006年2月1日優(yōu)先權日2005年2月1日發(fā)明者J·萊恩,O·T·斯喬丁申請人:辛克萊藥物有限公司