專利名稱：一種人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人參果脫毒組培苗的病毒快速檢 測(cè)方法。
背景技術(shù)：
人參果(&tow朋mwn'o^ff^")又名香艷果，為茄科直立多年生草本或亞灌木，原產(chǎn)南 美洲的秘魯、厄瓜多爾地區(qū)。其性喜溫曖、涼爽、千燥氣候，生長(zhǎng)適溫18 2(TC。人參果以 漿果供食，低糖、低脂，可炒、燒、炸、做湯、鮮食等。據(jù)分析，其果實(shí)富含人體所需的維 生素及各種微量元素銅、鉀、鎂、硒等。食用人參果，對(duì)各種癌癥、高血壓、糖尿病、冠 心病等有較好的防治效果，被譽(yù)為抗癌之王、綠色保健珍品。近年來(lái)國(guó)內(nèi)引進(jìn)推廣種植，且 適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)，生產(chǎn)效益高，市場(chǎng)前景好。人參果常規(guī)栽培以莖段扦插繁殖為主，但 幼苗和成株極易感染煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和馬鈴薯M病毒等多種病毒，體內(nèi)病毒感 染嚴(yán)重，并逐代積累，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育，表現(xiàn)為葉片皺縮、變小，死亡率較高，坐果率 低，產(chǎn)量大幅度下降。通過(guò)植物莖尖脫毒培養(yǎng)進(jìn)行種苗脫毒和快速繁殖是生產(chǎn)無(wú)病毒種苗的 有效途徑。無(wú)毒苗生產(chǎn)需要快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法。指示植物檢測(cè)是一種準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè) 方法，至今人參果病毒病的檢測(cè)仍主要依靠于指示植物檢測(cè)，按照常規(guī)做法，首先必須將試 管苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，移栽成活后才能用指示植物進(jìn)行檢測(cè)，并以指示植物檢測(cè)的結(jié)果作為判 斷待檢植物是否帶毒的最終依據(jù)。但這種方法費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，需要l年的時(shí)間才能完成，并且病 毒病的癥狀表現(xiàn)易受環(huán)境因素的影響。因此需要尋找更好的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢 測(cè)方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)這種人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，按 如下步驟進(jìn)行1)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為-(1) 基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20 30g/L，瓊脂7 9 g/L， pH5.6 5.8;(2) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA0,5 2.0mg/L+IAA0.05 0.5mg/L;(3) 微扦插培養(yǎng)基MS+BA0.1 1.0mg/L+NAA0.05 0.5mg/L;(4) 壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.05 0.5mg/L+NAA0.01 0.1mg/L+PP333 0.1 0. 5mg/L;(5) 微嫁接培養(yǎng)基MS+BA0.05 0.5mg/L+IBA0.05 0.5mg/L;(6) 生根培養(yǎng)基l/2MS+NAA0.05 0.5mg/L;(7) 無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS。2) 、人參果莖尖脫毒培養(yǎng)(1) 外植體的選取與滅菌從盆栽植株或大田植株上剪取頂芽或帶腋芽莖段為外植體， 經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(2) 莖尖培養(yǎng)將滅菌處理后的頂芽或帶腋芽莖段在無(wú)菌條件下，在40倍的雙筒解剖 鏡下，摘出0.2 0.3111111大小的帶1 2個(gè)葉原基的莖尖，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件 下培養(yǎng)20 30天后，從莖尖誘導(dǎo)形成幼芽，再培養(yǎng)20 30天，莖不斷抽長(zhǎng)，培養(yǎng)成約3 5 節(jié)、高5 7cm的幼苗；G)微扦插培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上， 在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天每節(jié)又培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量 的需求，每隔30 45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)；(4)壯苗培養(yǎng)將微扦插培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5 節(jié)接種到壯苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天，幼苗約2 3節(jié)、高3 5cm、莖變粗；3) 、指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)(1) 外植體的選取與滅菌取番茄的種子，經(jīng)滅菌處理，作為無(wú)菌播種的外植體；(2) 無(wú)菌播種培養(yǎng)將滅菌處理后的種子接種在無(wú)菌播種培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20 30天后，從種子培育成高約5 7cm的幼苗；(3) 微扦插培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上， 在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天每節(jié)又培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量 的需求，每隔30 45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)。4) 、微嫁接培養(yǎng)(1) 微嫁接砧木準(zhǔn)備將步驟2)人參果莖尖脫毒培養(yǎng)的幼苗在無(wú)菌操作條件下切成一 個(gè)個(gè)帶腋芽的莖段，用解剖刀將腋芽小心的去掉，并在莖段的上部縱切一個(gè)長(zhǎng)約0.5cm的切 口，作為微嫁接砧木；(2) 微嫁接接穗準(zhǔn)備將步驟3)無(wú)菌苗培養(yǎng)的指示植物番茄的幼苗切成帶單芽的莖段， 芽上面的部分留0.3 0.5cm，芽下面的部分留0.5 1.0cm，并將其下部削成楔形，削面約長(zhǎng) 0.3cm，作為微嫁接接穗；(3) 微嫁接器準(zhǔn)備將步驟2)人參果莖尖脫毒培養(yǎng)的幼苗在無(wú)菌操作條件下切成一個(gè)個(gè)長(zhǎng)約1.5cm的不帶腋芽的莖段，用解剖刀在莖段中間縱切一個(gè)長(zhǎng)約0.5cm的開(kāi)口；(4) 微嫁接將微嫁接器套入微嫁接砧木的切口下方，然后將微嫁接接穗插入微嫁接砧 木上端的縱切口中，最后將微嫁接砧木的切口下方的微嫁接器往上移至微嫁接砧木的切口處， 將微嫁接砧木的切口和微嫁接接穗固定牢；(5) 微嫁接苗培養(yǎng)將嫁接苗接種到微嫁接培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下經(jīng)45 60天的培養(yǎng)，指示植物苗生長(zhǎng)正常、無(wú)病毒病的癥狀(葉片相對(duì)平展、翠綠、單葉面積較大) 的為脫病毒苗；指示植物表現(xiàn)出病毒病的癥狀(葉片稍皺縮、葉緣上巻、暗綠、單葉面積較 小)的為未脫除病毒苗。5)、脫病毒組培苗的增殖培養(yǎng)(1) 微扦插培養(yǎng)將步驟4)檢測(cè)出脫病毒的同一編號(hào)的組培苗切成一節(jié)一芽、約3 5 節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天每節(jié)又培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm 的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30 45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)；(2) 壯苗培養(yǎng)將微扦插培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5 節(jié)接種到壯苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天，幼苗約2 3節(jié)、高3 5cm、莖變粗；(3) 生根培養(yǎng)將培養(yǎng)的壯苗接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 20 30天后，幼苗長(zhǎng)高成約5 7cm、苗基部長(zhǎng)出5 10根細(xì)根；(4) 移栽將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育1 2個(gè)月至成苗。(5) 定植將移栽苗定植在大田中，培育6 10個(gè)月至植株。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本 培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1 )基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，瓊脂8 g/L， pH5.8;(2) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BAlmg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L;(3) 微扦插培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+白糖30g/L;(4) 壯苗培養(yǎng)基MS+ BA O.lmg /L+ NAA0.05mg/L +PP333 0.2mg /L+白糖30g/L;(5) 微嫁接培養(yǎng)基MS+BA0.1mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖40g/L;(6) 生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1mg/L+白糖20g/L;(7) 無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS+白糖20g/L。 所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的人參果莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)外植體的滅菌處理是經(jīng)75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌10 15min，最后用無(wú)菌水 沖洗3 5次。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)種子的滅菌處理是經(jīng)75。/。酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌20 30min，最后用無(wú) 菌水沖洗3 5次。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的人參果莖尖脫毒培養(yǎng)和脫病毒組 培培養(yǎng)時(shí)各組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25士2X:，光照光強(qiáng)為2500 3000Lx，光照 時(shí)間為12h/d。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)各 階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25士2'C，光照光強(qiáng)為2000 2500Lx，光照時(shí)間為10h/d。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的嫁接苗培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件是，培 養(yǎng)溫度為25士2。C，光照光強(qiáng)為3000 3500Lx，光照時(shí)間為16h/d。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的移栽基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按體積比2: h l配制而成。 本發(fā)明的有益效果是(1) 微嫁接材料(脫毒苗)易于在較小的空間和較短的時(shí)間內(nèi)大量繁殖，且不受季節(jié)和 外界氣候的影響。(2) 所用的培養(yǎng)基、組培條件和微嫁接器適于人參果脫毒苗的微嫁接培養(yǎng)，利于嫁接口 的愈合，平均嫁接成功率超過(guò)90 %，可完全滿足病毒檢測(cè)的要求。(3) 與傳統(tǒng)的田間指示植物檢測(cè)相比，大大縮短了檢測(cè)所需的時(shí)間，傳統(tǒng)的方法需要l 年的時(shí)間才能完成，本方法只需2個(gè)月就可檢測(cè)出結(jié)果。(4) 該種方法不受時(shí)間限制、環(huán)境因素的影響，可常年在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，非常實(shí)用， 可用于人參果脫毒苗的病毒快速檢測(cè)和脫毒苗的規(guī)?；a(chǎn)。
具體實(shí)施方式
通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例l:1)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1) 基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，瓊月旨8g/L， pH5.8;(2) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BAlmg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L;(3) 微扦插培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+白糖30g/L;(4) 壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+PP333 0.2mg/L+白糖30g/L;(5) 微嫁接培養(yǎng)基MS+BA0.1mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖40g/L;(6) 生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1mg/L+白糖20g/L;(7)無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS+白糖20g/L。2) 、人參果莖尖脫毒培養(yǎng)(1) 外植體的選取與滅菌從盆栽植株或大田植株上剪取頂芽為外植體，經(jīng)滅菌處理， 作為脫毒組培用的外植體；(2) 莖尖培養(yǎng)將滅菌處理后的頂芽或帶腋芽莖段在無(wú)菌條件下，在40倍的雙筒解剖 鏡下，摘出0.2 0.3皿大小的帶1 2個(gè)葉原基的莖尖，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件 下培養(yǎng)20 30天后，從莖尖誘導(dǎo)形成幼芽，再培養(yǎng)20 30天，莖不斷抽長(zhǎng)，培養(yǎng)成約3 5 節(jié)、高5 7cm的幼苗；(3) 微扦插培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上， 在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天每節(jié)又培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量 的需求，每隔30 45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)；(4) 壯苗培養(yǎng)將微扦插培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5 節(jié)接種到壯苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天，幼苗約2 3節(jié)、高3 5cm、莖變粗；3) 、指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)(1) 外植體的選取與滅菌取番茄的種子，經(jīng)滅菌處理，作為無(wú)菌播種的外植體；(2) 無(wú)菌播種培養(yǎng)將滅菌處理后的種子接種在無(wú)菌播種培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20 30天后，從種子培育成高約5 7cm的幼苗；(3) 微扦插培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上， 在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天每節(jié)又培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量 的需求，每隔30 45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)。4) 、微嫁接培養(yǎng)(1) 微嫁接砧木準(zhǔn)備將步驟2)人參果莖尖脫毒培養(yǎng)的幼苗在無(wú)菌操作條件下切成一 個(gè)個(gè)帶腋芽的莖段，用解剖刀將腋芽小心的去掉，并在莖段的上部縱切一個(gè)長(zhǎng)約0.5cm的切 口，作為微嫁接砧木；(2) 微嫁接接穗準(zhǔn)備將步驟3)無(wú)菌苗培養(yǎng)的指示植物番茄的幼苗切成帶單芽的莖段， 芽上面的部分留0.3 0.5cm，芽下面的部分留0.5 1.0cm，并將其下部削成楔形，削面約長(zhǎng) 0.3cm，作為微嫁接接穗；(3) 微嫁接器準(zhǔn)備將步驟2)人參果莖尖脫毒培養(yǎng)的幼苗在無(wú)菌操作條件下切成一個(gè) 個(gè)長(zhǎng)約1.5cm的不帶腋芽的莖段，用解剖刀在莖段中間縱切一個(gè)長(zhǎng)約0.5cm的開(kāi)口；(4) 微嫁接將微嫁接器套入微嫁接砧木的切口下方，然后將微嫁接接穗插入微嫁接砧 木上端的縱切口中，最后將微嫁接砧木的切口下方的微嫁接器往上移至微嫁接砧木的切口處，將微嫁接砧木的切口和微嫁接接穗固定牢；(5)微嫁接苗培養(yǎng)將嫁接苗接種到微嫁接培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下經(jīng)45 60天的培養(yǎng)，指示植物苗生長(zhǎng)正常、無(wú)病毒病的癥狀(葉片相對(duì)平展、翠綠、單葉面積較大) 的為脫病毒苗；指示植物表現(xiàn)出病毒病的癥狀(葉片稍皺縮、葉緣上巻、暗綠、單葉面積較 小)的為未脫除病毒苗。5)、脫病毒組培苗的增殖培養(yǎng)(1) 微扦插培養(yǎng)將步驟4)檢測(cè)出脫病毒的同一編號(hào)的組培苗切成一節(jié)一芽、約3 5 節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天每節(jié)又培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm 的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30 45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再增殖；(2) 壯苗培養(yǎng)將微扦插培養(yǎng)成約3 5節(jié)、高5 7cm的幼苗切成一節(jié)一芽、約3 5 節(jié)接種到壯苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30 45天，幼苗約2 3節(jié)、高3 5cm、莖變粗；(3) 生根培養(yǎng)將培養(yǎng)的壯苗接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 20 30天后，幼苗長(zhǎng)高成約5 7cm、苗基部長(zhǎng)出5 10根細(xì)根；(4) 移栽將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育1 2個(gè)月至成苗。(5) 定植將移栽苗定植在大田中，培育6 10個(gè)月至植株。 所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的人參果莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)外植體的滅菌處理是經(jīng)75M酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌12min，最后用無(wú)菌水沖洗 3 5次。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)種 子的滅菌處理是經(jīng)75Q/。酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌25min，最后用無(wú)菌水 沖洗3 5次。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的人參果莖尖脫毒培養(yǎng)和脫病毒組 培培養(yǎng)時(shí)各組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25士2'C，光照光強(qiáng)為2500 3000Lx，光照 時(shí)間為12h/d。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)各 階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25士2。C，光照光強(qiáng)為2000 2500Lx，光照時(shí)間為10h/d。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的嫁接苗培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件是，培 養(yǎng)溫度為25土2。C，光照光強(qiáng)為3000 3500Lx，光照時(shí)間為16h/d。所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，所述的移栽基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按體積比2: 1: l配制而成。 實(shí)施例2:本例中，其基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，瓊脂7g/L， pH5.6;誘導(dǎo)培 養(yǎng)基MS+ BA 0.5mg /L+IAA 0.05mg/L +蔗糖30g/L;微扦插培養(yǎng)基MS+ BA O.lmg /L+ NAA 0.05 mg /L +白糖30g/L;壯苗培養(yǎng)基MS+ BA 0.05mg /L+ NAA 0.01mg/L+PP333 O.lmg /L +白 糖30g/L;微嫁接培養(yǎng)基MS+ BA 0.05mg /L+ IBA 0.05mg/L +蔗糖40g/L;生根培養(yǎng)基1/2MS+ NAA0.05mg/L+白糖20g/L;無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS+蔗糖20g/L。人參果莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)取 頂芽為外植體，經(jīng)75。/。酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌10min，最后用無(wú)菌水 沖洗3 5次。指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)種子的滅菌處理是經(jīng)75%酒精浸泡0.5 1.0min， 再用0.1%升汞溶液滅菌30min,最后用無(wú)菌水沖洗3 5次。其余步驟，條件均同于實(shí)施例1。實(shí)施例3:本例中，其基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，瓊脂9g/L， pH5.7;誘導(dǎo)培 養(yǎng)基MS+ BA 2.0mg /L+ IAA 0.5mg/L +蔗糖；微扦插培養(yǎng)基MS+ BA 1 .Omg /L+ NAA 0.5 mg /L+白糖30g/L;壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+PP333 0 . 5mg/L +白糖30g/L; 微嫁接培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖40g/L;生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.5mg/L+白糖20g/L;無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS+白糖20g/L。人參果莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)取帶腋 芽莖段為外植體，經(jīng)75。/。酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌15min，最后用無(wú)菌 水沖洗3 5次。指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)種子的滅菌處理是經(jīng)75%酒精浸泡0.5 l.Omin，再用0.1。/。升汞溶液滅菌20min，最后用無(wú)菌水沖洗3 5次。其余步驟，條件均同于 實(shí)施例1。實(shí)施例4:本例中，其基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20 40g/L，瓊 月旨7 9g/L， pH5.6 5.8;誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA0.5 2.0mg/L+IAA0.05 0.5mg/L; 微扦 插培養(yǎng)基MS+BA0.1 1.0mg/L+NAA0.05 0.5mg/L;壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.05 0.5mg /L+NAA0.01 0.1mg/L+PP333 0.1 0. 5mg/L;微嫁接培養(yǎng)基MS+BA0.05 0.5mg/L+IBA 0.05 0.5mg/L;生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.05 0.5mg/L;無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS。人參 果莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)取頂芽或帶腋芽莖段為外植體，經(jīng)75n/。酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1% 升汞溶液滅菌10 15min，最后用無(wú)菌水沖洗3 5次。指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)種子的 滅菌處理是經(jīng)75。/。酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶液滅菌20 30min，最后用無(wú)菌水 沖洗3 5次。其余步驟，條件均同于實(shí)施例l。除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技 術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行1)、培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為(1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20～40g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 0.5～2.0mg/L+IAA 0.05～0.5mg/L；(3)微扦插培養(yǎng)基MS+BA 0.1～1.0mg/L+NAA 0.05～0.5mg/L；(4)壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.05～0.5mg/L+NAA0.01～0.1mg/L+PP3330.1～0.5mg/L；(5)微嫁接培養(yǎng)基MS+BA 0.05～0.5mg/L+IBA 0.05～0.5mg/L；(6)生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.05～0.5mg/L；(7)無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS；2)、人參果莖尖脫毒培養(yǎng)(1)外植體的選取與滅菌剪取頂芽或帶腋芽莖段為外植體，經(jīng)滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；(2)莖尖培養(yǎng)將滅菌處理后的頂芽或帶腋芽莖段在無(wú)菌條件下，在雙筒解剖鏡下，摘出0.2～0.3mm大小的帶1～2個(gè)葉原基的莖尖，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20～30天后，從莖尖誘導(dǎo)形成幼芽，再培養(yǎng)20～30天，培養(yǎng)成3～5節(jié)、高5～7cm的幼苗；(3)微扦插培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的幼苗切成一節(jié)一芽、3～5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天每節(jié)又培養(yǎng)成3～5節(jié)、高5～7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30～45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)；(4)壯苗培養(yǎng)將微扦插培養(yǎng)成3～5節(jié)、高5～7cm的幼苗切成一節(jié)一芽、3～5節(jié)接種到壯苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天，幼苗2～3節(jié)、高3～5cm、莖變粗；3)、指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)(1)外植體的選取與滅菌取番茄的種子，經(jīng)滅菌處理，作為無(wú)菌播種的外植體；(2)無(wú)菌播種培養(yǎng)將滅菌處理后的種子接種在無(wú)菌播種培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20～30天后，從種子培育成高5～7cm的幼苗；(3)微扦插培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的幼苗切成一節(jié)一芽、3～5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天每節(jié)又培養(yǎng)成3～5節(jié)、高5～7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30～45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)；4)、微嫁接培養(yǎng)(1)微嫁接砧木準(zhǔn)備將步驟2)人參果莖尖脫毒培養(yǎng)的幼苗在無(wú)菌操作條件下切成一個(gè)個(gè)帶腋芽的莖段，將腋芽去掉并在莖段的上部縱切一個(gè)長(zhǎng)0.5cm的切口，作為微嫁接砧木；(2)微嫁接接穗準(zhǔn)備將步驟3)無(wú)菌苗培養(yǎng)的指示植物番茄的幼苗切成帶單芽的莖段，芽上面的部分留0.3～0.5cm，芽下面的部分留0.5～1.0cm，并將其下部削成楔形，削面長(zhǎng)0.3cm，作為微嫁接接穗；(3)微嫁接器準(zhǔn)備將步驟2)人參果莖尖脫毒培養(yǎng)的幼苗在無(wú)菌操作條件下切成一個(gè)個(gè)長(zhǎng)1.5cm的不帶腋芽的莖段，用解剖刀在莖段中間縱切一個(gè)長(zhǎng)0.5cm的開(kāi)口；(4)微嫁接將微嫁接器套入微嫁接砧木的切口下方，然后將微嫁接接穗插入微嫁接砧木上端的縱切口中，最后將微嫁接砧木的切口下方的微嫁接器往上移至微嫁接砧木的切口處，將微嫁接砧木的切口和微嫁接接穗固定牢；(5)微嫁接苗培養(yǎng)將嫁接苗接種到微嫁接培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下經(jīng)45～60天的培養(yǎng)，指示植物苗生長(zhǎng)正常、無(wú)病毒病的癥狀的為脫病毒苗；指示植物表現(xiàn)出病毒病的癥狀的為未脫除病毒苗；5)、脫病毒組培苗的增殖培養(yǎng)(1)微扦插培養(yǎng)將步驟4)檢測(cè)出脫病毒的同一編號(hào)的組培苗切成一節(jié)一芽、3～5節(jié)轉(zhuǎn)接到微扦插培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天每節(jié)又培養(yǎng)成3～5節(jié)、高5～7cm的幼苗；根據(jù)對(duì)幼苗數(shù)量的需求，每隔30～45天按同樣方法進(jìn)行幼苗再微扦插培養(yǎng)；(2)壯苗培養(yǎng)將微扦插培養(yǎng)成約3～5節(jié)、高5～7cm的幼苗切成一節(jié)一芽、約3～5節(jié)接種到壯苗培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30～45天，幼苗約2～3節(jié)、高3～5cm、莖變粗；(3)生根培養(yǎng)將培養(yǎng)的壯苗接種在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20～30天后，幼苗長(zhǎng)高成5～7cm、苗基部長(zhǎng)出5～10根細(xì)根；(4)移栽將生根組培苗移栽于基質(zhì)中，培育1～2個(gè)月至成苗；(5)定植將移栽苗定植在大田中，培育6～10個(gè)月至植株。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為-(1) 基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基，瓊脂8 g/L， pH5.8;(2) 誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+ BA l.Omg/L+ IAA0.1mg/L +蔗糖30g/L;(3) 微扦插培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+白糖30g/L;(4) 壯苗培養(yǎng)基MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+PP333 0.2mg/L+白糖30g/L;(5) 微嫁接培養(yǎng)基MS+BA0.1mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖40g/L;(6) 生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.1mg/L+白糖20g/L;(7) 無(wú)菌播種培養(yǎng)基1/2MS+白糖20g/L。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的 人參果莖尖脫毒培養(yǎng)時(shí)外植體的滅菌處理是經(jīng)75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升汞溶 液滅菌10 15min，最后用無(wú)菌水沖洗3 5次。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的 指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)種子的滅菌處理是經(jīng)75%酒精浸泡0.5 1.0min，再用0.1%升 汞溶液滅菌20 30min，最后用無(wú)菌水沖洗3 5次。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的 人參果莖尖脫毒培養(yǎng)和脫病毒組培培養(yǎng)時(shí)各組培階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25i2'C，光 照光強(qiáng)為2500 3000Lx，光照時(shí)間為12h/d。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的 指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)各階段的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25士2'C，光照光強(qiáng)為2000 2500 Lx，光照時(shí)間為10h/d。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述的 嫁接苗培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25i2'C，光照光強(qiáng)為3000 3500Lx，光照時(shí)間為 16h/d。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的 移栽基質(zhì)由泥炭珍珠巖蛭石按體積比2: 1: 1配制而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人參果脫毒組培苗的病毒快速檢測(cè)方法，屬植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，包括如下步驟培養(yǎng)基的配制、莖尖脫毒培養(yǎng)、指示植物番茄的無(wú)菌苗培養(yǎng)、微嫁接培養(yǎng)和脫病毒組培苗的增殖培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所用的培養(yǎng)基、組培條件和微嫁接器適于人參果脫毒苗的微嫁接培養(yǎng)，利于嫁接口的愈合，平均嫁接成功率超過(guò)90％，可完全滿足病毒檢測(cè)的要求。與傳統(tǒng)的田間指示植物檢測(cè)相比，大大縮短了檢測(cè)所需的時(shí)間。該種方法不受時(shí)間限制、環(huán)境因素的影響，可常年在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，非常實(shí)用，可用于人參果脫毒苗的病毒快速檢測(cè)和脫毒苗的規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01G31/00GK101248761SQ20081006054
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者呂永平, 剛 徐, 汪一婷, 牟豪杰, 陳劍平 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院