專利名稱：花色改變了的蝴蝶蘭屬植物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用基因重組技術(shù)來改變蝴蝶蘭屬植物的花色的方法。更 詳細(xì)地說，涉及向蝴蝶蘭屬植物導(dǎo)入編碼花青素生物合成體系的酶的基因、 從而制造紅花色蝴蝶蘭屬植物的方法。
背景技術(shù)：
在觀賞用植物中，花的顏色作為特別重要的性質(zhì)，自古以來通過各種 顏色的花雜交育種來產(chǎn)生。但是，在依賴偶然的交配育種法中，為了僅將 像花的顏色那樣的特定性質(zhì)導(dǎo)入某個特定品種中，必須將回交反復(fù)進(jìn)行幾 代，需要非常大的勞力和時間。進(jìn)一步地，根據(jù)植物不同，交配育種的周 期不同，像蝴蝶蘭屬那樣的蘭科植物，大多數(shù)直到開花之前需要較長時間， 僅通過交配育種來產(chǎn)生所需性質(zhì)的品種實質(zhì)上是不可能的。因此，盡管市 場需要，但將蝴蝶蘭屬植物的花色改變?yōu)樗Ｍ念伾菢O困難的。
近年來，通過DNA重組技術(shù)，已經(jīng)可以超越種、屬來進(jìn)行育種，可 以期待育種具有通過現(xiàn)有的交配育種得不到的顏色的新品種。
花的顏色主要起因于花色素苷、類胡蘿卜素、甜菜色素(Betalain)3種 色素。其中，花色素苷控制紅色至藍(lán)色，是最大吸收波長寬度最寬的色素。 花色素苷是黃酮類化合物的一種，通過


圖1所示的代謝途徑生物合成。花 色素苷的色調(diào)較大地依賴于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是B環(huán)的羥基數(shù)。所述B環(huán) 的羥化是由黃酮類化合物3，-羥化酶(F3，H)和黃酮類化合物3，，5，-羥化酶 (F3，5，H)催化的。在花瓣細(xì)胞內(nèi)無F3，H活性和F3，5，H活性的情況下，合 成花葵素(橙色)，在有F3，H活性的情況下，合成花青素(紅色)，在有F3，5，H 活性的情況下，合成翠雀素(藍(lán)色)。因此，認(rèn)為F3，H對產(chǎn)生紅花色發(fā)揮較
4大的作用。
作為使用基因改變花色的實例，有使用三色堇的F3，5，H基因來制造藍(lán) 色的玫瑰的方法(專利文獻(xiàn)1)。
另一方面，關(guān)于蝴蝶蘭屬植物，有通過過度表達(dá)內(nèi)在基因?qū)⒎奂t色的 花色改變?yōu)榧t紫色的報告(非專利文獻(xiàn)l)。
專利文獻(xiàn)1國際7>開//^艮 WO 2005/01714非專利文獻(xiàn)1Su和Hsu， Biotechnology Letters (2003) 25: 1933-1939。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的目的是提供制造花色改變?yōu)榧t色的蝴蝶蘭屬植物的方法， 所述方法為特別指定改變蝴蝶蘭屬植物的花色所必要的基因，通過將該 基因?qū)牒m屬植物并表達(dá)，制造花色改變?yōu)榧t色的蝴蝶蘭屬植物。
用于解決課題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明者們對花青素生合成相關(guān)酶的基因?qū)脒M(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 通過將編碼柚皮素下游的4個酶的基因?qū)氚咨m屬植物的花瓣細(xì) 胞，細(xì)胞內(nèi)生物合成紅色色素的花青素，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明基于上述見解，以以下各項為要旨。
(1) 花色改變了的蝴蝶蘭屬植物的制造方法，其特征在于將編碼黃 烷酮3-幾化酶的基因、編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因、編碼二氬黃酮 醇4-還原酶的基因和編碼花色素合成酶的基因?qū)牒m屬植物，并表達(dá)。
(2) (l)項所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因是 蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬(Gerbera)植物的基因。
(3) (l)項所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因是 序列號1或3的堿基序列所示的基因。
(4) (l)項所述的方法，其中編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因是扶 郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因。(5) (l)項所迷的方法，其中編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因;l^ 列號5或7的堿基序列所示的基因。(6) (l)項所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因是序列號 9的堿基序列所示的基因。(7) (l)項所述的方法，其中編碼花色素苷合成酶的基因是序列號 11或13的堿基序列所示的基因。(8) (l)項所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因是 蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬植物的基因；編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因是 扶郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因。(9) (l)項所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因是 序列號1或3的堿基序列所示的基因；編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因是 序列號5或7的堿基序列所示的基因。(10) (l)項所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因是序列號 9的堿基序列所示的基因；編碼花色素苷合成酶的基因;l^列號11或13 的堿基序列所示的基因。(11) (l)項所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因是序列號 9的堿基序列所示的基因，編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因^列號1 或3的堿基序列所示的基因，編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因A^列號5 或7的堿基序列所示的基因，編碼花色素苷合成酶的基因是序列號11或 13的堿基序列所示的基因。(12) (l)項所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因是序列號 9的堿基序列所示的基因，編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因M列號1 的堿基序列所示的基因，編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因;l^列號5的堿 基序列所示的基因，編碼花色素苷合成酶的基因是序列號11或13的堿基 序列所示的基因。(13) 通過(1) ~ (12)中任一項所述的方法獲得的花色改變蝴蝶蘭 屬植物、或者具有與改變的花色相同性質(zhì)的其后代或其組織。在本發(fā)明中"黃烷酮3-羥化酶"(下文中也稱為F3H)是指催化由柚皮素生成二氫莰非醇的反應(yīng)的酶。另外，"黃酮類化合物3，-羥化酶"(下 文中也稱為F3，H)是指催化由二氫莰非醇生成二氫五羥黃酮的反應(yīng)的酶， "二氫黃酮醇4-還原酶"(下文中也稱為DFR)是指催化由二氫五羥黃 酮生成無色花青素(leucocyanidin)的反應(yīng)的酶，"花色素合成酶"(下 文中也稱為ANS)是指催化由無色花青素生成花青素的反應(yīng)的酶。 發(fā)明的效果通過本發(fā)明，可以制作出原樣地保留有花色以外的性質(zhì)的優(yōu)秀性、自 白的蝴蝶蘭屬植物改變?yōu)槠浠ㄉ欠奂t色或紅色等的新品種。附圖簡述圖l是花色素苷的合成途徑。圖2是向花瓣進(jìn)行基因?qū)霑r使用的質(zhì)粒載體。P-CaMV35S表示花 椰菜花葉病毒35S啟動子。il表示煙草花葉病毒的ft序列。T表示來自花 椰菜花葉病毒的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖3顯示為了將白色蝴蝶蘭屬植物花瓣改變?yōu)榧t色所必要的基因的特 別指定。圖4顯示將植物來源不同的F3，H基因向阿嬤蝴蝶蘭(Phal. amabilis)的花瓣進(jìn)行基因?qū)?。?入'圖7顯示進(jìn)行蝴蝶蘭屬植物的轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)建步驟的概略圖 圖8同上。
具體實施方式
以下，對于本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但是，本發(fā)明的其它目的、特征、 優(yōu)秀性以及其具有的觀點(diǎn)通過以下記載對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的。但是，包括以下說明和具體實施例等記載的本說明書的記栽所顯示的是本 發(fā)明的優(yōu)選方式，理解為僅用于說明的目的而顯示。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易 理解，在本說明書所公開的本發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)，可進(jìn)行各種變化和/ 或改變(或修飾)。另外，本說明書所引用的所有專利文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)是為 了說明而引用的，它們的內(nèi)容應(yīng)解釋為作為本說明書的一部分而包含在本 發(fā)明中。在本發(fā)明中，編碼F3H、 F3，H、 DFR和ANS的各基因可以使用新的 或公知的基因。作為公知的基因，對于編碼F3H的基因，可例舉GenBank 中登錄的基因(登錄號DQ394303、 AY221246、 AJ493133、 AY641730、 AF184270、 AB078956、 AB201760、 AY669324、 AF036093、 AB211958、 AB187027、 AB234905)等；對于編碼F3，H的基因，可例舉GenBank中 登錄的基因(AAG49298、 ABA64468、 BAE47004、 BAE47005、 BAE47006、 BAE71221、 BAE72874、 CAI54278、 NP—920627、 Z17221)等;對于編碼 DFR的基因，可例舉GenBank中登錄的基因(登錄號AB012924、 AAB62873、 AAC17843、 AAD49343、 AAQ83576、 AAU93766、 AAY32600、 AAY32601、 AAY32602、 BAB40789、 BAE79202、 Z17221)等；對于編碼 ANS的基因，可例舉GenBank中登錄的基因(登錄號AY585677、 AY228485、 AF015885、 AY581048、 U82432、 AY695817、 AB208689、 AY997840、 AY997842、 AY382828、 AY256380、 AF026058、 Y07955、 AF384050、 AB097216、 AB087206、 AB198869、 AB044091、 AY123768、 AB234906 )等。在本說明書中，自登錄號Z17221和AY997842所特別指 定的序列設(shè)計一定的引物，分離扶郎花屬植物的編碼F3，H的基因(序列 號3)、編碼DFR的基因(序列號7)和編碼ANS的基因(序列號 13);另外，自登錄號AB057672和AB012924所特別指定的序列同樣地 分離蝴蝶草屬植物的編碼F3，H的基因(序列號87)和編碼DFR的基因 (序列號5),分別記載在實施例4和5中，因為其他公知的基因也可以 同樣地分離，所以它們能夠用于本發(fā)明是顯然的。另外，本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的 蝴蝶蘭屬植物的編碼F3H的基因(序列號9)、編碼F3，H的基因(序列號1)、編碼DFR的基因(序列號15)和編碼ANS的基因(序列號 ll)是新的基因，也能夠使用這些基因。扶郎花屬植物的編碼F3，H的基因M列號3的g序列所示的基因， 編碼DFR的基因是序列號7的堿基序列所示的基因，編碼ANS的基因是 序列號13的堿基序列所示的基因。另外，蝴蝶草屬植物的編碼DFR的基 因A^列號5的堿基序列所示的基因。另外，蝴蝶蘭屬植物的編碼F3H的 基因是序列號9的堿基序列所示的基因，編碼F3，H的基因是序列號1的 堿基序列所示的基因，編碼ANS的基因是序列號11的堿基序列所示的基 因。在本發(fā)明中，作為編碼F3，H的基因，優(yōu)選使用蝴蝶蘭屬植物或扶郎 花屬植物的基因，特別優(yōu)選使用蝴蝶蘭屬植物的基因。在本發(fā)明中，作為 編碼DFR的基因，優(yōu)選使用扶郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因，特別優(yōu) 選使用蝴蝶草屬植物的基因。在本發(fā)明中，編碼黃酮類化合物3，-羥化酶 (F3，H)的基因是蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬植物的基因，且編碼二氫黃酮 醇4-還原酶(DFR)的基因是扶郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因時，由 于花色呈現(xiàn)更濃的紅色，因此是優(yōu)選的。在本說明書中，基因這一用語以其最廣的意思使用，是指包含編碼該經(jīng)分離的核酸分子。該核酸分子除了含有編碼氨基酸序列的外顯子外，也 可以含有內(nèi)含子、5，非翻譯序列、3'非翻譯序列。本發(fā)明所示的特定的植物來源的基因可例舉作為該植物來源的 GenBank中登錄的基因等。另外，所述基因也包括自該基因通過自發(fā)突變 而產(chǎn)生的顯示高相似性的基因、或通過人工突變而產(chǎn)生的顯示高相似性的 基因。高相似性是指兩者的基因所編碼的氨基^列的同源性可例舉為85 %以上、優(yōu)選卯％以上、更優(yōu)選95%以上、還更優(yōu)選98%以上的同源性。另外，本發(fā)明的基因通過包含該基因的重組載體、特別是表達(dá)載體導(dǎo) 入蝴蝶蘭屬植物。表達(dá)載體依賴于應(yīng)導(dǎo)入該基因的宿主的種類，含有表達(dá) 控制區(qū)域例如啟動子和終止子、復(fù)制起點(diǎn)等。作為啟動子，可列舉 花瓣細(xì)胞中誘導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子，例如，可列舉來自蝴蝶蘭屬植物的CHS 基因的啟動子、來自花椰菜花葉病毒(CaMV)35S的啟動子等。另外，作為 終止子，可列舉例如來自蝴蝶蘭屬植物的CHS基因的終止子、來自花椰菜 花葉病毒(CaMV)35S的終止子等。
具體地il，優(yōu)選將各基因連接在啟動子序列的3，下游，進(jìn)一步地，在 各基因的3，下游附加有轉(zhuǎn)錄終止序列?？梢允褂孟拗菩悦浮⑦B接酶等按照 常規(guī)方法來制作表達(dá)栽體。另外，也可以按照常規(guī)方法用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿 主。作為本發(fā)明中在花瓣細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，可列舉例如基因槍法、 農(nóng)桿菌法、電穿孔法、PEG法、病毒法等。用于使用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭 屬植物的載體的一例示于圖7和圖8。
基因的表達(dá)這一用語以其最廣的意思使用，包括RNA的產(chǎn)生、或者 RNA和蛋白質(zhì)這兩者的產(chǎn)生。另外，植物中基因的表達(dá)可以是組成的或發(fā) 育的或誘導(dǎo)的表達(dá)中的任一種，可以是全身的或組織特異的.
本發(fā)明中，可轉(zhuǎn)化的植物是蘭科植物，優(yōu)選蝴蝶蘭屬植物。蝴蝶蘭屬 植物中有屬于蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)和朵麗蝶蘭屬(Doritaenopsis)的植 物。
本發(fā)明涉及通過將編碼F3H的基因、編碼F3，H的基因、編碼DFR 的基因和編碼ANS的基因?qū)牒m屬植物并表達(dá)，制造花色變紅的蝴蝶 蘭屬植物的方法，本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案如下。
(1)編碼F3，H的基因是蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬植物的基因。 (2 )編碼F3，H的基因;Ij^列號1或3的g序列所示的基因。 (3)編碼DFR的基因是扶郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因。 (4 )編碼DFR的基因是序列號5或7的堿基序列所示的基因。
(5) 編碼F3，H的基因是蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬植物的基因，編碼 DFR的基因是扶郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因。
(6) 編碼F3，H的基因是序列號1或3的堿基序列所示的基因，編碼 DFR的基因是序列號5或7的g序列所示的基因。
(7) 編碼F3H的基因M列號9的堿基序列所示的基因，編碼F3，H的基因;L^列號1或3的堿基序列所示的基因，編碼DFR的基因M列號 5或7的堿基序列所示的基因，編碼ANS的基因M列號11或13的g 序列所示的基因。
實施例
以下^Hf實施例，具體地說明本發(fā)明，但該實施例只是為了說明本發(fā) 明、用于參考其具體的方案而提供的。這些例示是用于說明本發(fā)明的特定 的具體方案的，4旦并不表示限定、或限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)該理解在本發(fā) 明中，可以進(jìn)行基于本說明書思想的各種實施方式。
此外，DNA的切割、連接、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、基因的堿基序列確定、 PCR等一般的基因重組所需的方法，基本按照各操作中使用的市售試劑、 儀器裝置等所附帶的說明書、實驗書(例如"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition, Sambrook和Russell, 2001， Cold Spring Harbor Laboratory Press)")來進(jìn)行。PCR反應(yīng)4吏用GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems)。 4義器的操作除了另外詳細(xì)記載的之 外，按照儀器所附帶的說明書所記栽的標(biāo)準(zhǔn)操作方法來進(jìn)行。所有實施例 除了另外詳細(xì)記載的之外，是使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實施的、或能夠?qū)嵤┑模@是 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說周知且常用的。
作為研究本發(fā)明中新獲得的基因所編碼的氨基酸序列與已知氨基* 列的相似性的同源性檢索程序，使用BLASTP 2.2.15 (http:〃www. ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html， 文獻(xiàn)Altschul等，Nucleic Acids Res. (1997)25:3389-3402)。這里所謂同源性，是整個序列的氨基酸的一致性， 是將新獲得的基因所編碼的氨基酸序列與已知氨基酸序列以 一致性高的形 式并列，用在兩者中一致的氨基酸數(shù)除以比較區(qū)域的氨基酸數(shù)而得的值。 此外，這里所謂一致性高的形式，是在以上述BLASTP程序的參數(shù)為默認(rèn) 值的狀態(tài)(有缺口(gap)、期望值10、有篩選(filter))下輸出的比對結(jié)果。本 實施例中所記栽的同源性，是對于分析時在上述同源性檢索分析中顯示最 高同源性的已知氨基酸序列所記載的同源性。實施例1向蝴蝶蘭屬植物花瓣的基因?qū)?br> 本說明書的實施例在無特別記述的情況下，使用以下所述的基因?qū)?br> 方法將各種基因?qū)牒m屬植物花瓣，評價其功能。所有基因都采取5， 側(cè)連接有啟動子、3，側(cè)連接有終止子的DNA結(jié)構(gòu)，以在花瓣細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 形態(tài)導(dǎo)入。
將蝴蝶蘭屬植物的花蕾用1%的次氯酸鈉水溶液滅菌5分鐘，再用滅 菌水洗滌3次，然后將該花蕾分解，將側(cè)萼片、背萼片、花瓣置床在含有 NDM鹽(Tokuhara和Mii， Plant Cell Reports(1993) 13: 7-ll)和0.6 %瓊脂 糖的瓊脂培養(yǎng)基上。此外，花蕾使用白色蝴蝶蘭屬植物阿嬤蝴蝶蘭的長 15mm左右的花蕾。
導(dǎo)入的DNA使用Hi Speed Plasmid Midi Kit (QIAGEN)來純化，該基 因用基因槍法進(jìn)行基因?qū)?。此外，在同時導(dǎo)入多個基因時，準(zhǔn)備將該DNA 溶液彼此均等地混合的溶液，作為導(dǎo)入用的DNA溶液。這時金粒子與DNA 的吸附按照以下比例來進(jìn)行。將溶解在20nl的TE緩沖液中的DNA(將每 種含有基因的質(zhì)粒DNA混合2照，溶解而得的溶液)與50fil的金粒子混濁 液(粒子直徑為l.Oum, 60mg/ml的50%甘油)混合，在70fil該混合液中加 入SO^il的2.5M氯化鈣和lOfil的0.2M亞精胺并懸浮，使DNA吸附在金 粒子上。接著，通過離心操作除去上清，用70%乙醇和100%乙醇洗滌粒 子，然后在得到的該沉淀物中加入60jil的100%乙醇，以得到的懸浮液作 為樣品溶液，將其10^1用于一次基因?qū)搿；驑屖褂肐DERA GIE-III(TANAKA Co. Ltd.)?；?qū)霔l件是在槍口至樣品的距離12cm、 -S0kPa的減壓下，在氦氣壓0,3MPa、噴射時間0.025秒的條件下進(jìn)行。
基因?qū)胫蟮幕ò曛么灿贜DM鹽瓊脂培養(yǎng)基上，在明暗循環(huán)下(光 強(qiáng)度2^mol/mV秒，明期16小時，暗期8小時)，在25。C進(jìn)行培養(yǎng)。
實施例2基因?qū)胗玫谋磉_(dá)載體(pBS-P35T35 )的制備
pBS-P35T35是pBluescriptIISK- (Stratagene)內(nèi)依次具有花椰菜花葉 病毒35S啟動子(Hohn等,Curent Topics in Microbiology and Immunology (1982) 96: 194-236)、煙草花葉病毒的Q序列(Gallie等，Nucleic AcidsResearch (1987) 15: 3257-3273)、限制性酶Swal位點(diǎn)以及花椰菜花葉病毒 35S終止子的質(zhì)粒(圖2)。與該pBS-P35T35實質(zhì)上功能等同的質(zhì)?？梢匀?下那樣構(gòu)建。
將寡核苷酸SAS-S ( 5，-CTAGCTAGCGGCGCGCCTGCAGGATAT CATTTAAATCCCGGG-3，； 序列號17 )和寡核苷酸SAS-AS
(5-CCCGGGATTTAAATGATATCCTGCAGGCGCGCCGCTAGCTA G-3，；序列號18)熱變性后，慢慢地回到室溫，將產(chǎn)物用NheI處理，連 接到pBluescriptIISK- ( Stratagene )的Xbal - EcoRV位點(diǎn)，制備出改變 了限制性酶位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA，為pBS-SAS。以花椰菜花葉病毒的基因組 DNA (GenBank登錄號V00140 )為模板， <吏用引物T-CaMV35S-SseI-F
(5，-AACCTGCAGGAAATCACCAGTCTCTCTCTA-3，；序列號19 ) 和引物T國CaMV35S-AscI-R ( 5，畫GGCGCGCCATCGATAAGGGGTTAT TAG-3，；序列號20 ),通過PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的區(qū)域用限制性酶Sse8387I 和Ascl處理。將該片段連接到pBS-SAS的Sse8387I - Ascl位點(diǎn)，制備出 pBS-T35S。將通過HindlII和Hindi自pJD301( Leon等，Plant Physiology (1991) 95: 968-972 )切出的花椰菜花葉病毒35S啟動子和煙草花葉病毒 的Q序列連接到pBS-T35S的Hindlll-Smal位點(diǎn)，制備出表達(dá)載體
(pBS畫P35T35)。
本實施例中所使用的基因的分離和向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的DNA的構(gòu)建 方法如下所述。
實施例3 蝴蝶蘭屬植物的CHS基因、CHI基因、F3H基因、F3，H 基因、DFR基因和ANS基因的分離和瞬時表達(dá)用DNA的制備 (1)蝴蝶蘭屬植物的CHS基因(PhCHS3)的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)，從蝴蝶蘭屬植物(Dtps. Sogo VivienxDtps. Sogo Yenlin)即將開花之前的花瓣提取總RNA，以該RNA為 模板,使用Superscrip til First-Strand Synthesis System(Invitrogen)來制備 cDNA。接著以該cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。 PCR反應(yīng)中使用的引物是 根據(jù)已知的蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS)的序列(GenBank登錄號DQ089652)設(shè)計的PhCHS3 Fl (5'-AAGCTTGTGAGAGACGACGGA -3，；序列號21)和PhCHS3Rl (5， TGGCCCTAATCCTTCAAATT-3，； 序列號22)。反應(yīng)是將94'C 30秒、55°C 30秒、72°C 1分鐘的步驟重復(fù) 25個循環(huán)。以該反應(yīng)液為模板再次在相同條件下擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。將得到的 反應(yīng)產(chǎn)物克隆到pBS-P35T35的Swal位點(diǎn)，得到p35PhCHS3。接著，確 定了 p35PhCHS3所含的蝴蝶蘭屬植物CHS基因的全長堿基序列 (PhCHS3，序列號23)。 p35PhCHS3是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶蘭屬植物 CHS基因的DNA。
(2)蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl)的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit( QIAGEN )，從蝴蝶蘭屬植物(Dtps. Sogo Vivien x Dtps. Sogo Yenlin )即將開花之前的花瓣提取總RNA， 以該RNA為才莫板，4吏用SuperscriptII First-Strand Synthesis System
(Invitrogen)來制備cDNA。接著以該cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。在多 種植物中才艮道了 CHI基因(GenBank登錄號AY700850、 AY086088、 DQ160231、 AJ004902、 AF474923、 XM—470129、 1103433、 AB187026)， PCR反應(yīng)中使用的引物是根據(jù)已知的CHI基因的序列設(shè)計的，使用 CHI-dgFl (5，-TTYCTCGSYGGBGCMGGYGWVMGVGG-3，；序列號 25)和CHI-dgRl (5，-CMGGIGAIACVSCRTKYTYICCRATVAT-3，；序 列號26),反應(yīng)是將94'C 30秒、l分鐘的步驟重復(fù)5個循環(huán)、94 °C 30秒、l分鐘的步驟重復(fù)5個循環(huán)、然后94匸30秒、68。C 30 秒、72'C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。進(jìn)一步地，以得到的反應(yīng)液為模 板，使用引物CHI-dgF3 (5'-TMIKYWCMGGISMITTYGARAARYT-3，； 序列號27)和引物CHI-dgR3(5，-TYICCRATVATIGWHTCCARIAYBG C-3，；序列號28)進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將30秒、60*€ 30秒、 72"C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO
(Invitrogen)，得到PhCHIfrag16，確定PhCHIfrag16中含有的部分序 列的堿基序列(PhCHI部分序列)。
由PhCHI部分序列用RACE法分析3'下游側(cè)序列和5，上游側(cè)序列。
143，RACE法使用可以根據(jù)PhCHI部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是PhCHI-GSP Fl( 5，-ATGCTGCTGCCATTAACGGGTCA-3，；序列號29 )和GeneRacer 3，引物。反應(yīng)是將94^C 30秒、72"C 1分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)、94。C 30 秒、70*C 1分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)后，94^ 30秒、60°C 30秒、72'C 1 分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。進(jìn)一步地，以得到的反應(yīng)液為模板，使用引物 PhCHI-GSP F2 (5，-TCCGAGAAGGTCTCCGGGAACT-3，；序列號 30 )和GeneRacer 3'巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94。C 30秒、60 "C 30秒、72°C l分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4-TOPO( Invitrogen ),得到PhCHI3，RACE23，確定PhCHI3，RACE23 中所含的3，下游側(cè)序列的堿基序列(PhCHI 3，RACE序列)。
5，RACE法使用可以根據(jù)PhCHI部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是PhCHI-GSP Rl ( 5，GCATTCGTCAGCTTCTTGCTCTCT-3，；序列號31 )和 GeneRacer 5，引物。反應(yīng)是將94。C 30秒、72°C l分鐘的步驟進(jìn)行5個 循環(huán)、94*C 30秒、70°C 1分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)后，94°C 30秒、60 °C 30秒、l分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。進(jìn)一步地，以得到的反應(yīng)液 為模板，使用引物PhCHI-GSP R2 ( 5，-ATCACATCAGTCTCAGCCACA曙 3，；序列號32 )和GeneRacer 5'巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94 °C 30秒、60匸30秒、72°C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng) 產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO (Invitrogen)，獲得PhCHI5，RACE54,確定 PhCHI5，RACE54中所含的5，上游側(cè)序列的^J^序列(PhCHI 5，RACE 序列)。
以PhCHI 3，RACE序列和PhCHI 5，RACE序列為基礎(chǔ)進(jìn)行蝴蝶蘭 屬植物CHI基因(PhCHI)的全長克隆。使用上述cDNA、引物PhCHI init ( 5，-ATGGCAGAAACAGTGGCGACGCCCA-3，；序列號33 )和 PhCHI term (5，-TCAAACGACTCCATCTTGCTC-3，；序列號34 )進(jìn) 行PCR。反應(yīng)是將94。C 30秒、65°C 30秒、72'C 1.5分鐘的步驟重復(fù)45個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal位點(diǎn)，得到 p35PhCHI1。接著，確定p35PhCHI1中所含的全長蝴蝶蘭屬植物CHI基 因的堿基序列(PhCHIl，序列號35)。另外，從蝴蝶蘭屬植物發(fā)現(xiàn)的本 序列的基因是新的基因。根據(jù)同源性分析，該堿基序列所編碼的氨基, 列與茶的CHI基因所編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號DQ120521) 具有54。/。的同源性。p35PhCHI1是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶蘭屬植物CHI 基因的DNA。
(3)蝴蝶蘭屬植物F3H基因(PhF3Hl)的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit( QIAGEN ),從蝴蝶蘭屬植物(Dtps. Sogo Vivien x Dtps. Sogo Yenlin )即將開花之前的花瓣提取總RNA， 以該RNA為才莫板，4吏用SuperscriptII First-Strand Synthesis System
(Invitrogen)來制備cDNA。接著以該cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。 F3H 基因在多種植物中有報道(GenBank登錄號DQ394303、 AY221246、 AJ493133、 AY641730、 AF184270、 AB078956、 AB201760、 AY669324、 AF036093、 AB211958、 AB187027、 AB234905) ， PCR反應(yīng)中使用的引 物是根據(jù)已知的F3H基因的序列設(shè)計的，使用引物F3H-dgFl
(5，-TIVGIGAYGARGABGARMGBCCIAA誦3，；序列號37 )和引物 F3H-dgR1( 5，-ACBGCYYGRTGRTCHGCRTTCTTRAA-3，；序列號38 )。 反應(yīng)是將94C 30秒、72'C l分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)、94°C 30秒、70 X: l分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)后，將94'C 30秒、68°C 30秒、72'C l分 鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。進(jìn)一步地，以得到的反應(yīng)液為才莫板，使用引物 F3H-dgF3 (5，畫AARYTBRGKTTYGAYATGWCHGGIG-3，；序列號39) 和引物F3H-dgR3 ( 5，-GGHWSRACVGTDATCCAIGWBTT陽3，；序列號 40)進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94匸30秒、60t; 30秒、l分鐘的步 驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO (Invitrogen)， 得到PhF3Hfrag26,確定PhF3Hfrag26中所含的部分序列的堿基序列
(PhF3H部分序列)。
由PhF3H部分序列用RACE法分析3，下游側(cè)序列和5，上游側(cè)序列。
163，RACE法使用可以根據(jù)PhF3H部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是 PhF3H-GSPFl (5，-TTCTCATACCCAATCGGGAG畫3，；序列號41)和 GeneRacer 3，引物。反應(yīng)是將94°C 30秒、72°C l分鐘的步驟進(jìn)行5個 循環(huán)、30秒、70'C 1分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)后，將94t: 30秒、 60°C 30秒、72'C l分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。使用得到的反應(yīng)液、引物 PhF3H國GSPF2 (5，國AATCGGGAGCCGCGATTACT-3，；序列號42)和 GeneRacer 3，巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94"C 30秒、6030 秒、72'C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4誦TOPO( Invitrogen ),得到PhF3H3，RACE33，確定PhF3H3，RACE33 中所含的3'下游側(cè)序列的堿基序列(PhF3H 3'RACE序列)。
5，RACE法使用可以根據(jù)PhF3H部分序列設(shè)計的寡核苷酸、上述RNA 以及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是 PhF3H畫GSPRl ( 5，-TCTGTGTGGCGCTTCAGGCC-3，；序列號43 )和 GeneRacer 5，引物。反應(yīng)是將94°C 30秒、72'C l分鐘的步驟進(jìn)行5個循 環(huán)、94°C 30秒、70'C l分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)后，將94。C 30秒、60 'C 30秒、72X: 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。使用得到的反應(yīng)液、 PhF3H-GSPR2(5，-TGAGGTCCGGTTGCGGGCATTTT畫3，；序列號44) 和GeneRacer 5'巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94'C 30秒、60°C 30 秒、72'C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4畫TOPO( Invitrogen )，得到PhF3H5，RACE86,確定PhF3H5，RACE86 中所含的5，上游側(cè)序列的堿基序列(PhF3H 5，RACE序列)。
以PhF3H 3，RACE序列和PhF3H 5，RACE序列為基礎(chǔ)進(jìn)行蝴蝶蘭 屬植物F3H基因的全長克隆。使用上述cDNA、引物PhF3H init. (5，國ATGGCCCCAATACCATTCCTACCGA-3，；序列號45 )和PhF3H term. ( 5，-CCTTAAGCTAAAATCTCATTTAATGCCTTTGCTCC國3，；序 列號46)進(jìn)行PCR。反應(yīng)是將94'C 30秒、30秒、72。C 1.5分鐘 的步驟重復(fù)40個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal位點(diǎn)，得到p35PhF3Hl。接著，確定p35PhF3Hl中所含的全長蝴蝶蘭屬植 物F3H基因的堿基序列(PhF3Hl，序列號9)。另外，從蝴蝶蘭屬植物 發(fā)現(xiàn)的本序列的基因是新的基因。根據(jù)同源性分析，該堿基序列所編碼的 氨基酸序列與Bromheadia finlaysoniana的F3H基因所編碼的氨基^f 列(GenBank登錄號X89199)具有86%的同源性。p35PhF3Hl是在植 物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶蘭屬植物F3H基因的DNA。
(4 )蝴蝶蘭屬植物F3，H ( PhF3，H)基因的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit ( QIAGEN公司)，自蝴蝶蘭屬植物
(Dtps. Queen Beer "滿天紅，，)花蕾的花瓣提取總RNA。以該RNA 為模板，使用GeneRacer kit (Invitrogen )來制備cDNA 。接著以該cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR。 F3，H基因在多種植物中有報道(AAG49298、 ABA64468、 BAE47004、 BAE47005、 BAE47006、 BAE71221、 BAE72874、 CAI54278、 NP—920627)。用于PCR反應(yīng)的引物使用自前述F3，H基因的 序列設(shè)計的F3HDF3 (5，-GCITAYAAYTAYCARGAYYTIGTNTT-3，；序 列號47)和F3HD-R4-2 (5，-GCICKYTGIARIGTNARNCC-3，；序列號 48)。反應(yīng)是將94。C 30秒、48°C 30秒、72°C l分鐘的步驟重復(fù)40個循 環(huán)J吏用得到的反應(yīng)液、引物F3HDF4( 5，-GAYYTIGTNTTYGCICCNTAY GG畫3，；序列號49 )和引物F3HD畫R3陽2 ( 5，-DATICKICKICCIGCNCCR AANGG-3，；序列號50 )進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94'C 30秒、30 秒、l分鐘的步驟重復(fù)35個循環(huán)。使用得到的反應(yīng)液、引物F3HDF5
(5，-GARTTYAARIIIATGGTIGTIGARYTNATG-3，；序列號51)和引 物F3HD畫Rl-3 (5，-GGRTCICKNGCDATNGCCC-3，；序列號52)再次 進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94X: 30秒、48°C 30秒、72C 30秒的步驟重 復(fù)35個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO (Invitrogen)，命 名為PhF3，H-D/pCR4。確定PhF3，H-D/pCR4中所含的部分序列的堿基序 列(PhF3，H部分序列)。
由上述PhF3，H部分序列用RACE法分析3，下游側(cè)序列和5，上游側(cè)序列。
183，RACE法使用可以根據(jù)PhF3，H部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行.PCR反應(yīng)所用的引物是PhF3dH國F7
(5'-AGGGCGAAGTTAATGGTGGAGGCAGTGATA-3，；序列號53) 和GeneRacer 3，引物。反應(yīng)是將94X: 30秒、72°C 2分鐘的步驟重復(fù)5 個循環(huán)、接下來將94X: 30秒、70X: 2分鐘的步驟重復(fù)5個循環(huán)、接下來 將94'C 30秒、68'C 30秒、72°C 2分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。使用得到 的反應(yīng)液、引物PhF3dH-F8 ( 5，-AAGTTAATGGTGGAGGCAGTGATAT GCTGA畫3，；序列號54) 、 GeneRacer 3，巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反 應(yīng)是將94'C 30秒、65'C 30秒、72'C 2分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得 到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO ( Invitrogen ),命名為PhF3，H 3'RACE/pCR4。確定PhF3，H 3，RACE/pCR4中所含的3'下游側(cè)序列的 堿基序列(PhF3，H3，RACE序列)。
5，RACE法使用可以根據(jù)PhF3，H部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是PhF3dH-R6
(5，-CACTGCCTCCACCATTAACTTCGCCCTTCT國3，；序列號55 )和 GeneRacer 5'引物。反應(yīng)是將94'C 30秒、72°C l分鐘的步驟重復(fù)5個 循環(huán)、接下來將94X: 30秒、70'C l分鐘的步驟重復(fù)5個循環(huán)、接下來將 94'C 30秒、68'C 30秒、72'C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。使用得到的 反應(yīng)液、引物PhF3dH-R5 ( 5，歸CCTCCACCATTAACTTCGCCCTTCTCT ATT-3，；序列號56 )和GeneRacer 5，巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是 將94'C 30秒、65'C 30秒、72°C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的 反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO ( Invitrogen )， 命名為PhF3，H 5，RACE/pCR4。確定PhF3，H 5，RACE/pCR4中所含的5'上游側(cè)序列的 堿基序列(PhF3，H5，RACE序列)。
以上述PhF3，H3，RACE序列和PhF3，H5，RACE序列為基礎(chǔ)進(jìn)行 PhF3，H基因的全長克隆。使用上述RNA、隨機(jī)六聚體、引物 PhF3dH-FllE4 ( 5-AAGAAGCAAATGGCATTCTTAACCTACCTG誦3，； 序 列 號 57 ) 和 引 物 PhF3dH-R7G11(5，-TTATCACTGCCTCCACCATTAACTTCGCCC畫3，；序列號58)、 以及Ready-To-Go You Prime First Strand Beads (Amersham Biosciences公司)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)是將98t: 10秒、68'C 30秒、72 °C 1.5分鐘的步驟重復(fù)35個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO
(Invitrogen )，命名為PhF3，H/pCR4。確定PhF3，H/pCR4中所含的 PhF3，H基因的堿基序列(PhF3，H;序列號1)。另外，從蝴蝶蘭屬植物 發(fā)現(xiàn)的本序列的基因是新的基因。根據(jù)同源性分析，該堿基序列所編碼的 氨基酸序列與兩色蜀黍(Sorghum bicolor) F3，H基因所編碼的^J^, 列(GenBank登錄號DQ787855 )顯示59%的同源性。將PhF3，H/pCR4 用EcoRI切割，自質(zhì)粒切下DNA片段后，用克列諾片段將突出末端平端 化。將該DNA片段插入用Swal切割pBS-P35T35后產(chǎn)生的部位處，選擇 以有意方向插入了 cDNA的克隆，構(gòu)建pBS-35S-PhF3，H。pBS-35S-PhF3，H 是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶蘭屬植物F3，H基因的DNA。 (5)蝴蝶蘭屬植物DFR基因(PhDFR)的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit( QIAGEN ),自蝴蝶蘭屬植物(Dtps. Queen Beer "滿天紅")的花蕾的花瓣提取總RNA，以該RNA為模 板，使用GeneRacer kit (Invitrogen)來制備cDNA。接著以該cDNA 為模板進(jìn)行RT-PCR。 DFR基因在多種植物中有報道(GenBank登錄號 AAB62873、 AAC17843、 AAD49343、 AAQ83576、 AAU93766、 AAY32600、 AAY32601、 AAY32602、 BAB40789、 BAE79202)。用于PCR反應(yīng)的引 物4吏用自前述 DFR 基因的序列設(shè)計的 DFRD-F1
(5，-TTYCAYGTIGCIACNCCNATG-3，；序列號59 )和DFRD-R1
(5，-DATNGCRTCRTCRAACATYTC-3，；序列號60)。反應(yīng)是將94 X: 30秒、48'C 30秒、72X: l分鐘的步驟重復(fù)40個循環(huán)。以得到的反應(yīng) 液為模板，4吏用引物DFRD-F2 ( 5，-ATGAAYTTYCARWSIRARGAYCC畫 3，； 序列號61)和引物DFRD-R2(5，畫RCAIATRTAICKNCIRTTNGC-3，； 序列號62)進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94C 30秒、48°C 30秒、72匸1 分鐘的步驟重復(fù)40個循環(huán)。進(jìn)一步地，以得到的反應(yīng)液為才莫板，使用引物
20DFRD-F3 (5，-GARAAYGARGTNATHAARCC-3，；序列號63)和引物 DFRD-R3 (5，-RTCRTCIARRTGNACRAAYTG-3，；序列號64 )再次進(jìn) 行巢式PCR。反應(yīng)是將94C 30秒、48。C 30秒、72。C 30秒的步驟重復(fù) 40個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pCR4-TOPO (Invitrogen)，得到 PhDFR-D/pCR4，確定PhDFR-D/pCR4中所含的部分序列的堿基序列
(PhDFR部分序列)。
由PhDFR部分序列用RACE法分析3，下游側(cè)序列和5，上游側(cè)序列。 3，RACE法使用可以根據(jù)PhDFR部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是PhDFR-Fl
(5'-GGTCATGCAAAAGGTCGGGCAGCGTAA畫3，；序列號65 )和 GeneRacer 3'引物。反應(yīng)是將94'C 30秒、l分鐘的步驟重復(fù)5個 循環(huán)、接下來將94。C 30秒、70'C l分鐘的步驟重復(fù)5個循環(huán)、接下來將 94°C 30秒、30秒、72°C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。進(jìn)一步地， 以得到的反應(yīng)液為模板，使用 PhDFR-F2
(5，-GTGATCTTCACATCTTCCGCAGGAACAGT-3，；序列號66)和 GeneRacer 3，巢式引物進(jìn)4亍巢式PCR。反應(yīng)是將94。C 30秒、65°C 30 秒、72'C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4/TOPO10 (Invitrogen )，得到PhDFR 3，RACE/pCR4 ，確定PhDFR 3'RACE/pCR4中所含的3'下游側(cè)序列的堿基序列(PhDFR3，RACE序列)。 5，RACE法4吏用可以才艮據(jù)PhDFR部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是PhDFR-R4
(5，陽ATGATTCATTAAAAATCCGAAAAAAAGACCACTACAA國3，；序 列號67 )和GeneRacer 5，引物。反應(yīng)是將94*C 30秒、1分鐘的 步驟重復(fù)5個循環(huán)、接下來將94'C 30秒、l分鐘的步驟重復(fù)5個循 環(huán)、接下來將94'C 30秒、68匸30秒、72。C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。 進(jìn) 一 步地，以得到的反應(yīng)液為模板，使用引物PhDFR-R3
(5，-AACCATGCATAATAAAGCAGATGTGTAAAT誦3，；序列號68) 和GeneRacer 5，巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94°C 30秒、30秒、72°C 1分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4-TOPO (Invitrogen )，得到PhDFR 5'RACE/pCR4，確定PhDFR 5，RACE/pCR4中所含的5'上游側(cè)序列的堿基序列(PhDFR 5，RACE序列)。
以PhDFR 3，RACE序列和PhDFR 5，RACE序列為基J出進(jìn)行蝴蝶 蘭屬植物DFR基因的全長克隆。使用上述RNA、引物PhDFR-F8A5 (5'畫AAAAAATGGAGGATGTGAGGAAGGGTCCTGTT-3，；序列號
69 ) 和 PhDFR-R5 (5，-ACATGATTCATTAAAAATCCGAAAAAAAGACCA誦3，；序列號
70 )、 以及Ready-To曙GoYouPrimeFirstStrand Beads (Amersham Biosciences公司)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)是將98"C 30秒、
68'C 30秒、72'C 1.5分鐘的步驟重復(fù)35個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆 入pBS-P35T35,得到p35PhDFR。接著，確定p35PhDFR中所含的全長 DFR基因的堿基序列(PhDFR，序列號15)。另外，從蝴蝶蘭屬植物發(fā) 現(xiàn)的本序列的基因是新的基因。根據(jù)同源性分析，該堿基序列所編碼的氨 基酸序列與Bromheadia finlaysoniana的DFR基因所編碼的氨基酸序列
(GenBank登錄號AF007096 )具有86%的同源性。p35PhDFR是在植 物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶蘭屬植物DFR基因的DNA。
(6 )蝴蝶蘭屬植物ANS基因(PhANSl)的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit ( QIAGEN)，自蝴蝶蘭屬植物
(Dtps.Sogo Vivien x Dtps.Sogo Yenlin )即將開花之前的花瓣提取總 RNA，以該RNA為才莫板，使用SuperscriptII First-Strand Synthesis System (Invitrogen )來制備cDNA。接著以該cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。 PCR反應(yīng)中所用的引物使用根據(jù)已知的ANS基因的序列設(shè)計的ANS-dgF2
(5，-TICARGGBTAYGGIAGYARRYTIGCIRMYA-3，；序列號71)和 ANS-dgR2 (5，GGYTCRCARAAIAYIRCCCAIGADA-3，；序列號72)。 反應(yīng)是將94。C 30秒、60X: 30秒、72'C 1.5分鐘的步驟重復(fù)40個循環(huán)。 以得到的反應(yīng)液為模板，再次使用相同的引物，進(jìn)行94'C 30秒、56X: 30秒、72'C 1分鐘的步驟30個循環(huán)的反應(yīng)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4-TOPO (Invitrogen)，得到PhANSfraglO，確定PhANSfraglO中 所含的部分序列的堿基序列(PhANS部分序列)。
由PhANS部分序列用RACE法分析3，下游側(cè)序列和5'上游側(cè)序列。 3'RACE法使用可以根據(jù)PhANS部分序列設(shè)計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是 PhANS3RACEGSPl ( 5，-GCCCACACCGACGTCAGCTCCCTCTCCT畫 3，；序列號73)和GeneRacer 3，引物。反應(yīng)是將94C 30秒、72°C 1.5 分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)、94X: 30秒、70n 1.5分鐘的步驟進(jìn)行5個循 環(huán)后，將94。C 30秒、70€ 30秒、72'C 1.5分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。 進(jìn)一步地，以得到的反應(yīng)液為模板，使用引物PhANS3RACEGSP2
(5，畫CGTCGGGGATGCGCTCGAGATCCTCAGC畫3，；序列號74)和 GeneRacer 3'巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94X: 10秒、58t: 10 秒、72'C 1分鐘的步驟重復(fù)35個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4-TOPO( Invitrogen )，得到PhANS3，RACE37，確定PhANS3，RACE37 中所含的3，下游側(cè)序列的堿基序列(PhANS 3'RACE序列)。
5，RACE法4吏用可以才艮據(jù)PhANS部分序列i殳計的引物、上述RNA以 及GeneRacer kit (Invitrogen)來進(jìn)行。PCR反應(yīng)所用的引物是 PhANS5RACEGSPl ( 5，-AGTCCGCGGGTTCAGTCGGCCAGATGGT-3，；序列號75)和GeneRacer 5，引物。反應(yīng)是將94。C 30秒、1.5 分鐘的步驟進(jìn)行5個循環(huán)、94'C 30秒、70'C 1.5分鐘的步驟進(jìn)行5個循 環(huán)后，將94'C 30秒、30秒、72^ 1.5分鐘的步驟重復(fù)25個循環(huán)。 使用得到的反應(yīng)液、 引物 PhANS5RACEGSP2
(5'-CCGTCTTCTCCGGCGGGTAGACGAGGTG國3，；序列號76)和 GeneRacer 5，巢式引物進(jìn)行巢式PCR。反應(yīng)是將94。C 10秒、58°C 10 秒、72°C 1分鐘的步驟重復(fù)35個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入 pCR4-TOPO( Invitrogen ),得到PhANS5，RACE15,確定PhANS5，RACE15 中所含的5，上游側(cè)序列的堿基序列(PhANS 5，RACE序列)。
23以PhANS 3，RACE序列和PhANS 5，RACE序列為基礎(chǔ)進(jìn)行蝴蝶蘭 屬植物ANS基因的全長克隆。使用上述cDNA、引物PhANS init (5，-ATGGCCACCAAAGCAATCCCACC-3，；序列號77)和PhANS term (5，-TCAATCCACAGGCGCCTTCT畫3，；序列號78 )進(jìn)行PCR。 反應(yīng)是將94C 30秒、30秒、72'C 1.5分鐘的步驟重復(fù)35個循環(huán)。 將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal位點(diǎn)，得到p35PhANSl。 接著，確定了 p35PhANSl中所含的全長ANS基因(PhANSl)的堿基序 列(PhANSl，序列號11)。另外，從蝴蝶蘭屬植物發(fā)現(xiàn)的本序列的基 因是新的基因。根據(jù)同源性分析，該堿基序列所編碼的氨基^列與花燭 屬植物的ANS基因所編碼的氨基酸序列(GenBank登錄號EF079869 ) 具有58%的同源性。p35PhANSl是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶蘭屬植物ANS 基因的DNA。
實施例4扶郎花屬植物F3，H基因、DFR基因和ANS基因的分離以 及表達(dá)栽體的制備
(1) 扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H)的分離
使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN),自市售的扶郎花屬植 物雜交體的花蕾的花瓣提取總RNA，以該RNA為模板，使用SuperscriptII First-Strand Synthesis System (Invitrogen )來制備cDNA。接著以該 cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。用于PCR反應(yīng)的引物是自已知的扶郎花屬植 物F3，H基因(GerF3，H)的序列(GenBank登錄號:Z17221 )設(shè)計的 GerF3H-F ( 5，-ATGACGCCTTTAACGCTCCT-3，；序列號79 )和 GerF3H-R ( 5，-CTAGACCTTAGTCGTCTCATATACATG-3，；序列號 80)。反應(yīng)是將98。C 10秒、55"C 10秒、72。C 1分鐘30秒的步驟重復(fù) 45個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal位點(diǎn) (p35GerF3，H ),得到扶郎花屬植物F3，H基因(序列號3 ) 。 p35GerF3，H 是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)扶郎花屬植物F3，H基因的DNA。
(2) 扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR)的分離 以上述實施例4 (1)的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。用于PCR反應(yīng)的引物是自已知的扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR)的序列(GenBank 登錄號:Z17221 )設(shè)計的GerDFR-F ( 5，-ATGGAAGAGGATTCTCCGGC-3，；序列號81 )和GerDFR-R( 5，國CTATTGGCCTTCTTTTGAACAACAA A誦3，；序列號82)。反應(yīng)是將98。C 10秒、55'C 10秒、72°C 1分鐘30 秒的步驟重復(fù)45個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal 位點(diǎn)(p35GerDFR )，得到扶郎花屬植物DFR基因(序列號7 )。 p35GerDFR 是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)扶郎花屬植物DFR基因的DNA。 (3)扶郎花屬植物ANS基因(GerANS)的分離
以上述實施例4 (1)的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。用于PCR反應(yīng) 的引物是自已知的扶郎花屬植物ANS基因(GerANS)的序列(GenBank 登錄號:AY997842 )設(shè)計的GerANS-F ( 5'-ATGGTGATTCAAGCAACCA CA-3，；序列號83 )和GerANS-R( 5，國CTAGTTTTGCATCACTTCGTCT TTAT-3，；序列號84)。反應(yīng)是將94'C 30秒、56匸30秒、72'C l分 鐘10秒的步驟重復(fù)45個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的 Swal位點(diǎn)(p35GerANS)，得到扶郎花屬植物ANS基因(序列號13)。 p35GerANS是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)扶郎花屬植物ANS基因的DNA。
實施例5蝴蝶草屬植物F3，H基因和DFR基因的分離以及表達(dá)載體 的制備
(1)蝴蝶草屬植物F3，H基因(TorF3，H)的分離 使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN),自市售的蝴蝶草屬植 物(藍(lán)翅蝴蝶草(Torenia fournieri))的花蕾的花瓣提取總RNA,使 用SuperscriptII First-Strand Synthesis System (Invitrogen )來制備 cDNA。接著以該cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。用于PCR反應(yīng)的引物是自 已知的蝴蝶草屬植物F3，H基因(TorF3，H)的序列(GenBank登錄號 AB057672)設(shè)計的TorF3Hl-F ( 5，-ATGAGTCCCTTAGCCTTGATGAT -3，；序列號85)和TorF3Hl-R(5，誦TTAATAGACATGAGTGGCCAACC -3，；序列號86)。反應(yīng)是將30秒、55匸30秒、72°C 1分鐘10 秒的步驟重復(fù)45個循環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal位點(diǎn)(p35TorF3，H)，得到蝴蝶草屬植物的F3，H基因(序列號8"。 p35TorF3，H是在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蝴蝶草屬植物F3，H基因的DNA。 (2)蝴蝶草屬植物DFR基因(TorDFR)的分離
以上述實施例5 (1)的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。用于PCR反應(yīng) 的引物是自已知的蝴蝶草屬植物DFR基因(TorDFR)的序列(GenBank 登錄號 AB012924 ) 設(shè)計的寡核苷酸 TorDFR-F (5，國ATGAGCATGGAAGTAGTAGTACCA-3，； 序列號89 )和 TorDFR畫R(5，-CTATTCTATCTTATGTTCTCCATGG-3，；序列號90)。 反應(yīng)是將94。C 30秒、30秒、72°C 1分鐘10秒的步驟重復(fù)45個循 環(huán)。將得到的反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pBS-P35T35的Swal位點(diǎn)(p35TorDFR), 得到蝴蝶草屬植物的DFR基因(序列號5) 。 p35TorDFR是在植物細(xì)胞 內(nèi)表達(dá)蝴蝶草屬^t物DFR基因的DNA。
實施例6花瓣細(xì)胞的著色的觀察
花瓣和花瓣細(xì)胞的著色通過實體顯微鏡szxi2(才；；7戶7)和肉眼觀
察來進(jìn)行?；ò甑闹潭鹊幕鶞?zhǔn)是，可用肉眼觀察到的為"III"，可用 實體顯微鏡以32倍以下的倍率觀察到的為"II",以32倍以上的倍率才 能觀察到的為"I"，不能確認(rèn)著色的為"-"。
實施例7白色蝴蝶蘭屬植物的花瓣改變?yōu)榧t色所必要的基因的特別
指定
根據(jù)實施例1的方法向白色蝴蝶蘭屬植物(阿嬤蝴蝶蘭)的花瓣中導(dǎo) 入下述四種的基因套組后，由實施例6的方法觀察著色的程度，特別指定 了花色改變所必要的基因。
(1) 扶郎花屬植物F3，H基因(GerFS，H) +扶郎花屬植物DFR基因 (GerDFR) +扶郎花屬植物ANS基因(GerANS )
(2) 蝴蝶蘭屬植物F3H基因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因 (GerF3，H) +扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR) +扶郎花屬植物ANS基因
(GerANS )
(3) 蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHll) +蝴蝶蘭屬植物F3H基因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H) +扶郎花屬植物DFR基因 (GerDFR) +扶郎花屬植物ANS基因(GerANS )
(4)蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS3) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因 (PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因 (GerF3，H) +扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR) +扶郎花屬植物ANS基因 (GerANS )
將上述基因套組基因?qū)氚吆m的花瓣，觀察各花瓣細(xì)胞的著色， 結(jié)果是在(l)以外的組中，花瓣中出現(xiàn)了紅色細(xì)胞(圖3)。由該結(jié)果可 見，為了花瓣變?yōu)榧t色，導(dǎo)入F3，H基因+DFR基因+人 8基因是不充分 的，至少要加上F3H基因，導(dǎo)入4種基因?qū)τ诨ㄉ母淖兪潜匾摹?br> 最佳的F3，H基因、DFR基因和ANS基因的研究
關(guān)于白色蝴蝶蘭屬植物向紅色的改變，為了觀察到最佳的F3，H基因、 DFR基因和ANS基因，將植物來源不同的基因?qū)?，進(jìn)行比較研究。
實施例8在白色蝴蝶蘭屬植物的花瓣中比較F3，H基因
向白色蝴蝶蘭屬植物(阿嬤蝴蝶蘭)的花瓣中導(dǎo)入僅F3，H基因不同 的下述三種基因套組，觀察著色的程度。
(1) 蝴蝶蘭屬植物F3，H基因(？1^3，11) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因 (PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +蝴蝶草屬植物DFR基因(TorDFR) +蝴蝶蘭屬植物ANS基 因(PhANSl)
(2) 扶郎花屬植物F3，H基因(。6^3，11) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因 (PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +蝴蝶草屬植物DFR基因(TorDFR) +蝴蝶蘭屬植物ANS基 因(PhA麗)
(3) 蝴蝶草屬植物F3，H基因(TorF3，H) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因 (PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +蝴蝶草屬植物DFR基因(TorDFR) +蝴蝶蘭屬植物ANS基 因(PhANSl)其結(jié)果是所有組的花瓣均出現(xiàn)了紅色的細(xì)胞。各10枚花瓣的著色濃薄進(jìn)行比較的結(jié)果示于圖4。紅色的著色程度順序為蝴蝶蘭屬植物(PhF3，H)、扶郎花屬植物(GerF3，H)、蝴蝶草屬植物(TorF3，H)。明確了對于制備出濃紅的花色，較優(yōu)選蝴蝶蘭屬植物(PhF3，H)和扶郎花屬植物(GerF3，H)，特別優(yōu)選蝴蝶蘭屬植物的F3，H基因(PhF3，H)。實施例9在白色蝴蝶蘭屬植物的花瓣中比較DFR基因向白色蝴蝶蘭屬植物(阿嬤蝴蝶蘭)的花瓣導(dǎo)入僅DFR基因不同的下述三種基因套組，觀察著色的程度。
(1) 蝴蝶蘭屬植物DFR基因(PhDFR) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H) +扶郎花屬植物ANS基因(GerANS)
(2) 扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H) +扶郎花屬植物ANS基因(GerANS)
(3) 蝴蝶草屬植物DFR基因(TorDFR) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H) +扶郎花屬植物ANS基因(GerANS)
其結(jié)果是所有組的花瓣均出現(xiàn)了紅色的細(xì)胞。各36枚花瓣的著色濃薄進(jìn)行比較的結(jié)果示于圖5。紅色的著色程度順序為蝴蝶草屬植物(TorDFR)、扶郎花屬植物(GerDFR)、蝴蝶蘭屬植物(PhDFR)。明確了對于實現(xiàn)濃紅的花色，蝴蝶草屬植物(TorDFR)或扶郎花屬植物(GerDFR)較蝴蝶蘭屬植物的內(nèi)在DFR基因(PhDFR)更優(yōu)選，特別優(yōu)選蝴蝶草屬植物的DFR基因(TorDFR)。
實施例IO在白色蝴蝶蘭屬植物的花瓣中比較ANS基因
向白色蝴蝶蘭屬植物(阿嬤蝴蝶蘭)的花瓣導(dǎo)入僅ANS基因不同的下述二種基因套組，觀察著色程度。
(1) 蝴蝶蘭屬植物ANS基因(PhANSl) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H) +扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR)
(2) 扶郎花屬植物ANS基因(GerANS) +蝴蝶蘭屬植物CHS基因(PhCHS3 ) +蝴蝶蘭屬植物CHI基因(PhCHIl) +蝴蝶蘭屬植物F3H基
因(PhF3Hl) +扶郎花屬植物F3，H基因(GerF3，H) +扶郎花屬植物DFR基因(GerDFR)
其結(jié)果是在所有樣品中出現(xiàn)了相同程度的紅色細(xì)胞。分別比較16
枚花瓣所出現(xiàn)的紅色細(xì)胞的著色濃度的結(jié)果示于圖6。
實施例11對阿嬤蝴蝶蘭以外的白色蝴蝶蘭屬植物的應(yīng)用向市售的純白色大型蝴蝶蘭屬植物(Phal. White Lady )的長1.7cm
的花蕾的花瓣共導(dǎo)入來自蝴蝶蘭屬植物的CHS (PhCHS3) 、 CHI(PhCHIl) 、 F3H (PhF3Hl)的各基因以及來自扶郎花屬植物的F3，H
基因(GerF3，H) 、 DFR基因(GerDFR)和ANS基因(GerANS)時，
花瓣中出現(xiàn)了多數(shù)紅色細(xì)胞。
實施例12 制備通過農(nóng)桿菌法的蝴蝶蘭屬植物轉(zhuǎn)化用DNA不僅可以使用基因槍法，也可以使用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭屬植物(Belarmino和Mii，PlantCellReports(2000)19:435-442;
Mishiba等人，Plant Cell Reports (2005) 24: 297-303)。按照這
些方法，為了得到基因重組體而構(gòu)建轉(zhuǎn)化用DNA。將各個質(zhì)粒的圖語和制
作步驟示于圖7和圖8。(1) pBI-SASl的構(gòu)建
將國際申請?zhí)朠CT/JP02/12268中所記載的pBI-RHL用NotI和Hindlll切割，向切割后的部位亞克隆入將實施例2的pBS-SAS用NotI和HindIII切割后產(chǎn)生的短片段，從而構(gòu)建pBI-SASl。 pBI-SASl是可以
使用農(nóng)桿菌法進(jìn)4亍植物轉(zhuǎn)化，并可以賦予植物潮霉素抗性的質(zhì)粒。(2) pBS-35S-FT的構(gòu)建
由于蝴蝶蘭屬植物到開花之前需要1年以上的時間，故而構(gòu)建在蝴蝶蘭屬植物中表達(dá)花芽誘導(dǎo)基因FT(Kobayashi等，Science (1999) 286:1960-1962)的DNA。
FTcDNA是由從擬南芥屬整個植物體制備的總RNA通過RT-PCR擴(kuò)增來制備的 。PCR 的引物使用 AtFT 2nd-F(5'-GAAACCACCTGTTTGTTCAAGA-3，；序列號91)和AtFT 2nd畫R(5，-TCAATTGGTTATAAAGGAAGAAGC國3，；序列號92)，將可以分離出的FT cDNA插入將pBS-P35T35用Swal切割所產(chǎn)生的部位，選擇以有義方向插入了 cDNA的克隆，從而構(gòu)建pBS-P35S-FT。 pBS-35S-FT是由CaMV 35S啟動子、CaMV35S終止子控制FT轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒。
(3 ) pBS-35S-mPhF3，H的構(gòu)建
在PhF3，H cDNA內(nèi)的2個Sphl切割部位處導(dǎo)入不引起氨基酸置換的堿基置換，制備不被SphI切割的cDNA,插入pBS-P35T35。對于堿基置換，使用PhF3dH畫367F(5，-CGGTGCGCGGTGGCGTATGCTGAGGCGT-3，；序列號93 )和PhF3dH-394R( 5，-ACGCCTCAGCATACGCCACCGCGCACCG-3，；序列號94)作為引物，以pBS-35S-PhF3，H為模板進(jìn)行PCR。將得到的PCR產(chǎn)物用克列諾片段處理、環(huán)狀化。以該環(huán)狀化DNA為模板，使用PhF3dH-FllE4 (序列號57 )和PhF3dH-R7G12(5，畫CACCCTTTGCATAAATTTATGACATCAAGC-3，；序列號95)作為引物，進(jìn)行PCR。將得到的PCR產(chǎn)物插入pBS-P35T35用Swal切割后所產(chǎn)生的部位，選擇以有義方向插入了 cDNA的克隆，從而構(gòu)建了pBS-35S畫mPhF3，H。
(4 ) pBS-35S-mPhCHS3的構(gòu)建
在PhCHS3 cDNA內(nèi)的Sphl切割部位處導(dǎo)入不引起氨基酸置換的堿基置換，制備不被Sphl切割的cDNA。對于堿基置換，使用PhCHS3-1038F(5，-GTAACATGTCGAGCGCTTGCGTTCTTTTCATACTCG-3，；序列號96 )和PhCHS3-1073R( 5'畫CGAGTATGAAAAGAACGCAAGCGCTC
30GACATGTTAC-3，；序列號97)作為引物，以p35PhCHS3為模板，使用Pyrobest(夕力，乂《4才)進(jìn)行DNA合成。然后，通過Dpnl處理消化模;^粒，從而構(gòu)建了 pBS-35S-mPhCHS3。
(5) pBS-35S-UPl的構(gòu)建
將p35PhCHI1用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將p35PhF3Hl用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-UPl。 pBS-35S-UPl是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以PhCHIl、 PhF3Hl的順序連接的質(zhì)粒。
(6) pBS-35S-Cyal的構(gòu)建
將p35GerANS用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將p35GerDFR用XbaI切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cyal。 pBS-35S誦Cyal是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以GerANS、 GerDFR的順序連接的質(zhì)粒。
(7 ) pBS-35S-Cya2的構(gòu)建
將p35GerF3，H用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBS-35S-Cyal用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cya2。 pBS-35S-Cya2是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以GerF3，H、GerANS、 GerDFR的順序連接的質(zhì)粒。
(8) pBS-35S-Cya3的構(gòu)建
將pBS-35S-Cya2用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBS-35S-UPl用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cya3。 pBS-35S-Cya3是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以GerF3，H、GerANS、 GerDFR、 PhCHI、 PhF3H的順序連接的質(zhì)粒。(9) pBS-35S-Cya4的構(gòu)建
pBS-35S-Cya3用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBS-35S-mPhCHS3用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cya4。 pBS-35S-Cya4是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以GerF3，H、 GerANS、 GerDFR、 PhCHI、 PhF3H、 mPhCHS3的順序連接的質(zhì)粒。
(10 ) pBS-35S-Cya10的構(gòu)建
將pBS-35S-mPhF3，H用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將 pBS-35S-FT用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cya10。 pBS-35S-Cya10是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以mPhF3，H、 FT的順序連接的質(zhì)粒。
(11) pBS-35S-De116的構(gòu)建
將p35TorDFR用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將p35PhANSl用XbaI切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-De116。 pBS-35S-De116是由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以TorDFR、 PhANSl的順序連接的質(zhì)粒。
(12 ) pBS-35S-UP4的構(gòu)建
將pBS-35S-De116用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將DNA片段插入將pBS-35S-UPl用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用 Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-UP4。 pBS-35S-UP4是由 CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以TorDFR、 PhANSl、 PhCHIl、 PhF3Hl的順序連接的質(zhì)粒。 (13 ) pBS-35S-Cya11的構(gòu)建
將pBS-35S-mPhF3，H用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端 化，進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將 pBS-35S-UP4用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用 Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cya11。 pBS-35S-Cya11是 由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以 mPhF3，H、 TorDFR、 PhANS、 PhCHI、 PhF3H的順序連接的質(zhì)粒。
(14 ) pBS-35S-Cya12的構(gòu)建
將pBS-35S-Cya10用Ascl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化， 進(jìn)而用Sphl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將 pBS-35S-UP4用Xbal切割、然后用克列諾片段將突出末端平端化、再用 Sphl切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBS-35S-Cya12。 pBS-35S-Cya12是 由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以 mPhF3，H、 FT、 TorDFR、 PhANS、 PhCHI、 PhF3H的順序連接的質(zhì)粒。
(15 ) pBIH-35S-Cya3的構(gòu)建
將pBS-35S-Cya3用Sphl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化， 進(jìn)而用Ascl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBI-SASl 用Ascl和Swal切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBIH-35S-Cya3。 pBIH-35S-Cya3是雙元載體，具有作為選擇標(biāo)記的HPT和由CaMV 35S 啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以GerF3，H、 GerANS、 GerDFR、 PhCHI、 PhF3H的順序連接的T-DNA區(qū)域。
(16 ) pBIH-35S-Cya4的構(gòu)建
將pBSJ5S-Cya4用Sphl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化， 進(jìn)而用Ascl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBI-SASl用Ascl和Swal切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBIH-35S-Cya4。 pBIH-35S-Cya4是雙元栽體，具有作為選擇標(biāo)記的HPT和由CaMV 35S 啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以GerF3，H 、 GerANS、 GerDFR、 PhCHI、 PhF3H、 mPhCHS3的順序連接的T-DNA區(qū)域。 (17) pBIH-35S-Cya11的構(gòu)建
將pBS-35S-Cya11用Sphl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化， 進(jìn)而用Ascl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBI-SASl 用Ascl和Swal切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBIH-35S-Cya11。 pBIH-35S-Cya11是雙元載體，具有作為選擇標(biāo)記的HPT和由CaMV 35S 啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以mPhF3，H、 TorDFR、 PhANS、 PhCHI、 PhF3H的順序連接的T-DNA區(qū)域，
(18 ) pBIH-35S-Cya12的構(gòu)建
將pBS-35S-Cya12用Sphl切割后，用克列諾片段將突出末端平端化， 進(jìn)而用Ascl切割而從質(zhì)粒切下DNA片段。將該DNA片段插入將pBI-SASl 用Ascl和Swal切割所產(chǎn)生的部位，從而構(gòu)建了 pBIH-35S-Cya12。 pBIH-35S-Cya12是雙元載體，具有作為選擇標(biāo)記的HPT和由CaMV 35S 啟動子、CaMV 35S終止子控制轉(zhuǎn)錄的各cDNA以mPhF3，H、 FT、 TorDFR、 PhANS、 PhCHI、 PhF3H的順序連接的T-DNA區(qū)域。
實施例13轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭屬植物的制備
使用構(gòu)建為雙元載體的實施例12的DNA ( pBIH-35S-Cya3 、 pBIH-35S-Cya4 、 pBIH畫35S-Cya11 、以及pBIH-35S-Cya12 )和農(nóng)桿菌 EHA101林制備的轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭屬植物用50mg/ml的潮霉素選擇。其結(jié)果是 能夠得到染色體上整合有實施例12所示的基因的蝴蝶蘭屬植物。
可以由得到的轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭屬植物，利用花莖的腋芽等植物體的一部分 來誘導(dǎo)PLB,從而進(jìn)行克隆增殖。使用得到的轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭屬植物作為交配 親本，進(jìn)行交配育種，可以得到具有導(dǎo)入基因的后代。
如以上那樣，自共導(dǎo)入了 F3H、 F3，H、 DFR、 ANS各基因的白的蝴 蝶蘭屬植物能夠制備出具有紅色花瓣的新品種。工業(yè)可利用性
通過本發(fā)明，可以制作出原樣地保留有花色以外的性質(zhì)的優(yōu)秀性、自 白的蝴蝶蘭屬植物改變?yōu)槠浠ㄉ欠奂t色或紅色等的新品種，能夠在工業(yè) 上廣泛利用。
此外，本發(fā)明引用在2007年4月26日提出申請的日本專利申請2007 - 116396號的說明書、專利權(quán)利要求書、附圖和摘要的全部內(nèi)容，并引入 作為本發(fā)明的說明書的內(nèi)容。
序列表獨(dú)立文本
SEQ ID NO 化酶的核苷酸序列
SEC ID NO 的氛基^列
SEQ ID NO 酶的核苷酸序列
SEQ ID NO 氨基紗列
SEQ ID NO
列
SEQ ID NO
SEQ ID NO 核普酸序列
SEQ ID NO ,列
SEQ ID NO 苷*列
SEQ ID NO
35
:1，編碼朵麗蝶蘭屬雜交栽培種黃酮類化合物3，-羥
:2，朵麗蝶蘭屬雜交栽培種黃酮類化合物3，-羥化酶
:3，編碼扶郎花屬雜交栽培種黃酮類化合物3，-羥化
:4，扶郎花屬雜交栽培種黃酮類化合物3，-羥化酶的
:5，編碼藍(lán)翅蝴蝶草二氫黃酮醇4-還原酶的核苷^
:6,藍(lán)翅蝴蝶草二氫黃酮醇4-還原酶的氨基酸序列 :7，編碼扶郎花屬雜交栽培種二氫黃酮醇4-還原酶的
:8，扶郎花屬雜交栽培種二氫黃酮醇4-還原酶的氨基
:9,編碼朵麗蝶蘭屬雜交栽培種黃烷酮3-幾化酶的核
:10，朵麗蝶蘭屬雜交栽培種黃烷酮3-羥化酶的氨基,列
SEQ ID NO: 崎列
SEQ ID NO:
列
SEQ ID NO:
序列
11，編碼朵麗蝶蘭屬雜交栽培種花色素合酶的核苷 12，朵麗蝶蘭屬雜交栽培種花色素合酶的氨基酸序 13，編碼扶郎花屬雜交栽培種花色素合酶的核苷酸
SEQIDNO:14,扶郎花屬雜交栽培種花色素合酶的M酸序列
SEQIDNO:15，編碼朵麗蝶蘭屬雜交栽培種二氬黃酮醇4-還原
酶的核苷酸序列
SEQIDNO:16，朵麗蝶蘭屬雜交栽培種二氫黃酮醇4-還原酶的
氨基紗列
SEQIDNO:17，寡核苷酸SAS-S
SEQIDNO:18，寡核苷酸SAS-AS
SEQIDNO:19,引物T-CaMV35S-SseI-F
SEQIDNO:20，引物T畫CaMV35S-AscI誦R
SEQIDNO:21,引物PhCHS3 Fl
SEQIDNO:22,引物PhCHS3 Rl
SEQIDNO:23，編碼朵麗蝶蘭屬雜交栽培種查耳酮合酶的核苷
酸序列
SEQIDNO:24，朵麗蝶蘭屬雜交栽培種查耳酮合酶的氨基^
列
SEQIDNO25，引物CHI-dgFl
SEQIDNO26,引物CHI-dgRl
SEQIDNO27,引物CHI-dgF3
SEQIDNO28,引物CHI-dgR3
SEQIDNO29,引物PhCHI-GSP Fl
SEQIDNO30,引物PhCHI-GSP F2SEQIDNO:31
SEQIDNO:32
SEQIDNO:33
SEQIDNO:34
SEQIDNO:35
苷酸序列
SEQIDNO:36
序列
SEQIDNO:37
SEQIDNO:38
SEQIDNO:39
SEQIDNO:40
SEQIDNO:41
SEQIDNO:42
SEQIDNO:43
SEQIDNO:44
SEQIDNO:45
SEQIDNO:46
SEQIDNO:47
SEQIDNO:48
SEQIDNO:49
SEQIDNO:50
SEQIDNO:51
SEQIDNO:52
SEQIDNO-53
SEQIDNO:54
SEQIDNO:55
SEQIDNO:56
引物PhCHI-GSP Rl 引物PhCHI畫GSP R2 引物PhCHI init 引物PhCHI term
編碼朵麗蝶蘭屬雜交栽培種查耳酮異構(gòu)酶的核
36，朵麗蝶蘭屬雜交栽培種查耳酮異構(gòu)酶的氨基酸
引物F3H-dgFl
引物F3H-dgRl
引物F3H-dgF3
引物F3H-dgR3
引物PhF3H-GSPFl
引物PhF3H-GSPF2
引物PhF3H-GSPRl
引物PhF3H-GSPR2
引物PhF3H init.
引物PhF3H term.
引物F3HDF3
引物F3HD-R4-2
引物F3HDF4
引物F3HD-R3-2
引物F3HDF5
引物F3HD-Rl-3
引物PhF3dH-F7
引物PhF3dH-F8
引物PhF3dH-R6
引物PhF3dH-R5SEQIDNO:57，引物PhF3dH誦FllE4
SEQIDNO:58，引物PhF3dH-R7G11
SEQIDNO:59，引物DFRD-F1
SEQIDNO:60,引物DFRD-R1
SEQIDNO:61,引物DFRD-F2
SEQIDNO:62，引物DFRD-R2
SEQIDNO:63，引物DFRD-F3
SEQIDNO:64,引物DFRD-R3
SEQIDNO:65，引物PhDFR-Fl
SEQIDNO:66，引物PhDFR-F2
SEQIDNO:67，引物PhDFR-R4
SEQIDNO:68，引物PhDFR-R3
SEQIDNO:69，引物PhDFR曙F8A5
SEQIDNO:70，引物PhDFR-R5
SEQIDNO:71，引物ANS-dgF2
SEQIDNO-72,引物ANS-dgR2
SEQIDNO:73，引物PhANS3RACEGSPl
SEQIDNO:74，引物PhANS3RACEGSP2
SEQIDNO:75，引物PhANS5RACEGSPl
SEQIDNO-76，引物PhANS5RACEGSP2
SEQIDNO:77，引物PhANS init
SEQIDNO:78，引物PhANS term
SEQIDNO:79，引物GerF3H-F
SEQIDNO:80,引物GerF3H-R
SEQIDNO:81,引物GerDFR-F
SEQIDNO:82，引物GerDFR-R
SEQIDNO:83，引物GerANS-F
SEQIDNO:84，引物GerANS-RSEQIDNO:85，引物TorF3Hl-F
SEQIDNO:86,引物TorF3Hl-R
SEQIDNO:87,編碼藍(lán)翅蝴蝶草黃酮類化合物3，-羥化酶的核苷
斷列
SEQ ID NO: 88，藍(lán)翅蝴蝶草黃酮類化合物3，-羥化酶的氨基,
列
SEQIDNO:89,引物TorDFR-F
SEQIDNO:90，引物TorDFR-R
SEQIDNO:91,引物AtFT 2nd-F
SEQIDNO'92,引物AtFT 2nd-R
SEQIDNO93,引物PhF3dH-367F
SEQIDNO94，引物PhF3dH-394R
SEQIDNO95，引物PhF3dH-R7G12
SEQIDNO96,引物PhCHS3-1038F
SEQIDNO:97，引物PhCHS3-1073R
權(quán)利要求
1.花色改變了的蝴蝶蘭屬植物的制造方法，其特征在于將編碼黃烷酮3-羥化酶的基因、編碼黃酮類化合物3’-羥化酶的基因、編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因和編碼花色素合成酶的基因?qū)牒m屬植物，并表達(dá)。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因 是蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬植物的基因。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因 M列號1或3的堿基序列所示的基因。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因是扶 郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因。
5. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因^ 列號5或7的堿基序列所示的基因。
6. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因是序列號 9的堿基序列所示的基因。
7. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼花色素苷合成酶的基因^列號 11或13的堿基序列所示的基因。
8. 權(quán)利要求1所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因 是蝴蝶蘭屬植物或扶郎花屬植物的基因；編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因 是扶郎花屬植物或蝴蝶草屬植物的基因。
9. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因 是序列號1或3的堿基序列所示的基因；編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因 M列號5或7的堿基序列所示的基因。
10. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因^jf列 號9的堿基序列所示的基因；編碼花色素苷合成酶的基因是序列號11或 13的堿基序列所示的基因。
11. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼黃烷酮3-羥化酶的基因A^列 號9的堿基序列所示的基因，編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因是序列號1或3的堿基序列所示的基因，編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因是序列號5 或7的堿基序列所示的基因，編碼花色素苷合成酶的基因是序列號11或 13的堿基序列所示的基因。
12. 權(quán)利要求l所述的方法，其中編碼黃烷酮3-幾化酶的基因是序列 號9的堿基序列所示的基因，編碼黃酮類化合物3，-羥化酶的基因A^列號 1的堿基序列所示的基因，編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因是序列號5的 堿基序列所示的基因，編碼花色素苷合成酶的基因是序列號11或13的堿 基序列所示的基因。
13. 通過權(quán)利要求1 ~ 12中任一項所述的方法獲得的花色改變蝴蝶蘭 屬植物、或者具有與改變的花色相同性質(zhì)的其后代或其組織。
全文摘要
本發(fā)明提供了改變蝴蝶蘭屬植物花色的方法、特別是提供了自白色的蝴蝶蘭屬植物制造改變?yōu)榧t色系統(tǒng)的蝴蝶蘭屬植物的方法。本發(fā)明提供了花色改變了的蝴蝶蘭屬植物的制造方法，其特征在于將編碼黃烷酮3-羥化酶的基因、編碼黃酮類化合物3’-羥化酶的基因、編碼二氫黃酮醇4-還原酶的基因和編碼花色素合成酶的基因?qū)牒m屬植物，并表達(dá)。
文檔編號A01H5/00GK101668420SQ20088001369
公開日2010年3月10日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者片山孝一, 荒木智史, 鈴木崇紀(jì) 申請人:石原產(chǎn)業(yè)株式會社