專(zhuān)利名稱(chēng)：：栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種栽培水稻成熟胚高頻再生植株的技術(shù)方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，普遍適用于不同的秈稻、粳稻和雜交稻等基因型栽培水稻成熟胚的組織培養(yǎng)、體細(xì)胞突變體篩選及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，由于人口的增加，耕地的減少，對(duì)作為全球一半以上為主食的水稻單產(chǎn)增加的需求更加迫切，但實(shí)際上，我國(guó)由于矮桿基因和雜種優(yōu)勢(shì)利用的廣泛應(yīng)用，水稻育種己取得了很大成就，再通過(guò)常規(guī)育種改良水稻的空間越來(lái)越小。今后迫切需要采用更高效新技術(shù)新思路來(lái)創(chuàng)造新種質(zhì)。20世紀(jì)80年代以來(lái)，水稻愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)在單倍體育種，遠(yuǎn)緣雜交育種和離體受精等方面得到了廣泛的應(yīng)用[章志宏，胡中立.水稻單倍體不定芽超低溫保存和植株再生及其遺傳穩(wěn)定性研究[J].武漢植物研究，2000,18(3)P.169-173;王愛(ài)云，陳冬玲，蔡得田.遠(yuǎn)緣雜交和異源多倍體化技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用[J].武漢植物研究，2005，23(5)P.491495;王忠安禾本科植物離體受精技術(shù)[J]生物學(xué)通報(bào)，2005,40(10)Rl-2]，它可以打破物種的界限進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，增加遺傳多樣性。從1988年獲得第一批轉(zhuǎn)基因水稻至今，己將大量的水稻基因庫(kù)中不具有的抗除草劑、抗蟲(chóng)、抗病、抗病毒、耐鹽、改善稻米品質(zhì)等基因引入水稻細(xì)胞中，獲得系列新的種質(zhì)資源，可見(jiàn)水稻生物技術(shù)越來(lái)越成為現(xiàn)代水稻育種的新興的重要的技術(shù)手段。利用水稻成熟胚進(jìn)行組織培養(yǎng)具有水稻品種來(lái)源廣，取材不受季節(jié)和地理環(huán)境限制，而且接種操作方便，不易染菌等很多優(yōu)點(diǎn)，因而水稻成熟胚是水稻組織培養(yǎng)首選的外植體。影響水稻胚性愈傷組織形成和植株再生能力的因素包括基因型、外源激素、滲透壓、外植體來(lái)源、固化劑、培養(yǎng)基其它成份以及溫度、光周期和繼代時(shí)間等多個(gè)方面，其中材料的基因型、外源激素的種類(lèi)、濃度和配比是最主要的因素[李霞，陳婷，周月蘭.秈粳稻成熟胚愈傷組織培養(yǎng)力的比較[J].南京師大學(xué)報(bào),2005,28(4)P.103-108]?，F(xiàn)階段，水稻成熟胚組織培養(yǎng)技術(shù)還是利用不同品種對(duì)外源激素的敏感性的不同而研制出一一對(duì)應(yīng)的愈傷組織誘導(dǎo)的獨(dú)特培養(yǎng)基配方，才可能進(jìn)一步用于水稻的生物技術(shù)育種和基因工程研究，而通常這個(gè)培養(yǎng)基研制的過(guò)程需要半年甚至更長(zhǎng)的研制時(shí)間[陳璋，繼代培養(yǎng)對(duì)水稻胚性愈傷組織染色體變異及體細(xì)胞無(wú)性變異的影響福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)1993,22(3)R274-279]?，F(xiàn)在所報(bào)道的培養(yǎng)方法和配方都是不同的，而且是選用的試劑都比較昂貴，應(yīng)用到大規(guī)模水稻改良還有相當(dāng)距離。如王萍等[王萍，徐大勇，王罡等粳秈稻兩個(gè)亞種成熟胚組織培養(yǎng)與再生能力的比較研究[J].種子R66-67]研究了8個(gè)生產(chǎn)上大面積栽培的粳稻基因型和5個(gè)雜交秈稻親本基因型進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)率與苗分化率的研究，采用以N6為基本培養(yǎng)基，附加2,4-Dl~2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，結(jié)果粳型水稻愈傷誘導(dǎo)率變化在85.71-100%，苗分化率為20~63.33%，秈型水稻愈傷誘導(dǎo)率在85.71~91.43%之間，但5種秈型水稻基因型苗分化率較低，僅為0~26.42%，而恢056沒(méi)有誘導(dǎo)分化苗。張玲等[張玲，謝崇華,李衛(wèi)鋒水稻成熟胚組織培養(yǎng)研究[J].雜交水稻.2002,17(2)P.4446]以粳稻品種H1493和中花11以及秈稻品種珍汕97B和明恢63為研究對(duì)象，在只加2mg/L2,4-D.蔗糖4.5%、瓊脂粉0.75%;分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基附加KT2mg/L、NAA0.5ml/L、蔗糖3%、瓊脂粉0.75%。其粳稻再生率分別為90.0%和66.7%，秈稻再生率幾乎為0，李霞等[李霞，陳婷，周月蘭.秈粳稻成熟胚愈傷組織培養(yǎng)力的比較[J].南京師大學(xué)報(bào),2005,28(4)R103-108]用粳稻9908和秈稻揚(yáng)稻6號(hào)進(jìn)行研究，以M8為基本培養(yǎng)基，激素配比為lmg/L2,4-D、2mg/LABA、2mg/L6-BA的培養(yǎng)基可以使秈稻揚(yáng)稻6號(hào)的成愈率達(dá)到90.5%;激素配比為.lmg/L2，4-D的培養(yǎng)基可以使粳稻9908的成愈率達(dá)到88.2%;以MS為基本培養(yǎng)基，激素配比為0.2mg/L2,4-D、2mg/L6-BA、2mg/LKT的培養(yǎng)基使揚(yáng)稻6號(hào)和粳稻9908愈傷組織的植株再生分別達(dá)到65.4%和62.7%;黃賽麟等[黃賽麟，李東宣，甘樹(shù)仙，朱建榮，李娟，梁晶，陳麗娟，水稻成熟胚培養(yǎng)高效再生系統(tǒng)的創(chuàng)新分子植物育種，2008，6(4)P.801—806]在改良培養(yǎng)基N6I愈傷誘導(dǎo)、MSR綠苗分化和MSC生根條件下，秈稻滇屯502、粳稻日本睛、秈粳雜種F1(滇屯502/日本晴)和非洲栽培稻(RG105)誘導(dǎo)率分別為96%、100%、98%和100%，成苗率也非常高，但是否適合其他水稻類(lèi)型還不清楚。實(shí)際上，上述報(bào)道的水稻成熟胚再生技術(shù)從水稻的品種、基本培養(yǎng)基，激素的比率，碳源的種類(lèi)和濃度等都不同，甚至相同的水稻材料在不同的培養(yǎng)方法中所得結(jié)果的差異也非常大，可見(jiàn)，現(xiàn)有水稻成熟胚再生技術(shù)對(duì)基因型的依賴(lài)仍較強(qiáng)，實(shí)際上目前很難參照一套通用的完整組織培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)得出理想的再生效果。尤其是上述研究所使用的碳源都是選擇蔗糖、葡萄糖和麥芽糖等單一碳源，成本普遍偏高，應(yīng)用于規(guī)?；乃旧锛夹g(shù)育種還有一定距離，而使用廉價(jià)的市售的復(fù)合碳源白砂糖作為碳源可以得到和單一碳源相同效果的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。而且上述報(bào)道中整個(gè)誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)多在暗箱中培養(yǎng)，雖然誘導(dǎo)率很高，但是多生成浸潤(rùn)的白色的愈傷組織，不利于胚性愈傷組織的生成，造成不同水稻品種分化率差異很大，嚴(yán)重影響其后分化的效果穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)栽培水稻成熟胚再生技術(shù)中對(duì)基因型的高度依賴(lài)，一種水稻材料只有一種特定的最適培養(yǎng)基配方，而且每種培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)技術(shù)的的研制都需要半年，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)現(xiàn)有大量水稻栽培品種的改良不相適應(yīng)，且也不宜用于規(guī)?；嚬苊绶敝澈臀磥?lái)水稻基因工程的篩選等缺陷。通過(guò)培養(yǎng)條件的改進(jìn)尤其是通過(guò)激素和理化因子的調(diào)優(yōu)，在同類(lèi)型中尋求適用于多種水稻材料的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為公眾提供一種通用型栽培水稻高頻成熟胚可育植株再生技術(shù)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，水稻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代的基本培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和幼苗壯根培養(yǎng)基均在高壓滅菌前調(diào)整pH值為5.8^6.1;愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化和幼苗壯根均在試管中完成，培養(yǎng)過(guò)程中的環(huán)境溫度為28°C~30°C，其特征在于水稻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代的基本培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和幼苗6壯根培養(yǎng)基中的復(fù)合碳源為白砂糖；在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)的前7天全暗培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，獲得愈傷組織；選取淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基光下培養(yǎng)；然后選取蓬松狀愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)；再選取含綠芽的顆粒狀愈傷組織再轉(zhuǎn)入幼苗壯根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，長(zhǎng)成3片葉且根系發(fā)達(dá)后，形成健壯試管植株。在本發(fā)明中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)耗時(shí)2835天；繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和幼苗壯根培養(yǎng)分別耗時(shí)14~21天；在愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化和幼苗壯根期間的光下培養(yǎng)期間，光照時(shí)間為12~14h/d，光強(qiáng)為18002100Lux。在本發(fā)明中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量比3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5%的山梨醇、l-2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(又稱(chēng)為2，4JD，下同)、lmg/L的脫落酸，0.3~2.0mg/L的6"芐基腺嘌呤(又稱(chēng)為6^BA，下同)和0.2mg/L的激動(dòng)素(又稱(chēng)為KT，下同)。在本發(fā)明中所述的水稻為秈稻，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2,4-二氯苯氧乙酸的添加量為lmg/L，6-芐基腺嘌呤的添加量為1.5~2mg/L。在本發(fā)明中所述的水稻為粳稻，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2,4-二氯苯氧乙酸的添加量為2mg/L，6-芐基腺嘌呤的添加量為0.3~0.6mg/L。在本發(fā)明中所述的水稻為雜交稻，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量為l~2mg/L，6-芐基腺嘌呤的添加量為0.6~1.5mg/L。在本發(fā)明中所述的繼代的基本培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量比3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5-1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和0.1~0.2mg/L的激動(dòng)素；所述的分化培養(yǎng)基以MS的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，添加lg/L的活性炭、8g/L的瓊脂條、30g/L的白砂糖、0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和lmg/L的苯基脲類(lèi)細(xì)胞分裂素；所述的幼苗壯根培養(yǎng)基以1/2MS基本成分為基礎(chǔ)，添加15g/L的白砂糖、10g/L的瓊脂條、0.2mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的多效唑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明在整個(gè)愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)中采用接種后7天暗培養(yǎng)，之后全部在光下培養(yǎng)替代原有的暗箱培養(yǎng)方法，有效地解決了水稻成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織水漬化或因形成大量毛狀根而喪失植株分化能力的難題，大幅度地提高了愈傷組織的分化率；本發(fā)明將原有水稻組織培養(yǎng)常用的單一碳源如蔗糖全部改為市面上可售的廉價(jià)的復(fù)合碳源-白砂糖，獲得了與蔗糖類(lèi)似的誘導(dǎo)效果，而且大大地降低了水稻組織培養(yǎng)的成本；通過(guò)激素的調(diào)控，找到了適合同類(lèi)水稻如秈稻、粳稻和雜交水稻的愈傷組織高頻誘導(dǎo)的通用激素范圍，使得不同類(lèi)型的水稻材料的成熟胚采用本發(fā)明的激素范圍，其愈傷組織的誘導(dǎo)率和分化率》60%,而且均可以在水稻正季室外栽培獲得可育的再生植株，大大地降低了水稻組織培養(yǎng)中專(zhuān)一培養(yǎng)基研制的時(shí)間，縮短了水稻生物技術(shù)育種周期；使用本發(fā)明方法對(duì)繼代和分化培養(yǎng)基中愈傷組織的形態(tài)也做了明確的描述，即選擇淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織，不僅使繼代21天后能始終保持胚性，并在分化培養(yǎng)基中獲得高頻率植株再生的能力，克服了以往水稻組織培養(yǎng)中的愈傷組織繼代培養(yǎng)的盲目性或者單純靠培養(yǎng)者經(jīng)驗(yàn)的現(xiàn)狀，從而增加了水稻成熟胚高頻再生技術(shù)的精準(zhǔn)性，可見(jiàn)，本發(fā)明的方法使水稻組織培養(yǎng)再生體系突破了對(duì)原有基因型的依賴(lài)，大大減低了研究成本，拓寬了通過(guò)生物技術(shù)改良栽培水稻基因型的范圍，尤其是秈型水稻，節(jié)省了水稻組織培養(yǎng)的時(shí)間，提高了水稻生物技術(shù)育種的效率，而且誘導(dǎo)愈傷組織高繼代能力的保持也可為開(kāi)展栽培水稻細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)育種提供了重要的基礎(chǔ)條件，并將可能配組或育成新的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的水稻新品種，從而拓寬水稻雜交優(yōu)勢(shì)的利用范圍。圖1不同的培養(yǎng)基對(duì)武育粳3號(hào)愈傷誘導(dǎo)率的影響；圖2是雜交稻品種兩優(yōu)培九的初始愈傷組織；圖3是秈稻品種9311的初始愈傷組織；圖4是粳稻品種揚(yáng)輻粳7號(hào)的初始愈傷組織；8圖5是揚(yáng)輻粳7號(hào)的繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)的白色、半透明、粘狀的愈傷組織；圖6是揚(yáng)輻粳7號(hào)的繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)的蓬松狀愈傷組織；圖7是揚(yáng)輻粳7號(hào)的繼代培養(yǎng)中出現(xiàn)的水漬狀愈傷組織；圖8是揚(yáng)輻粳7號(hào)分化7天后的綠色叢芽；圖9是揚(yáng)輻粳7號(hào)分化14天后綠色叢芽；圖10是揚(yáng)輻粳7號(hào)的完整試管苗植fr"綠芽分化出葉片；圖11是揚(yáng)輻粳7號(hào)的完整試管苗植ft"試管苗長(zhǎng)出根；圖12是揚(yáng)輻粳7號(hào)的試管苗移栽前在培養(yǎng)室煉苗。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇M8大量元素、微量元素和有機(jī)成分、鐵鹽為基本組分，添加的2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸；N6大量元素、微量元素和有機(jī)成分、鐵鹽為基本組分，添加的2mg/L的2，4"二氯苯氧乙酸；MS大量元素、微量元素和有機(jī)成分、鐵鹽為基本組分，添加的2mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸；水稻武育粳3號(hào)當(dāng)年收獲的種子為外植體材料。試驗(yàn)方法將武育粳3號(hào)的成熟種子去殼，經(jīng)75%乙醇處理5min，用0.1%氯化汞溶液浸泡15min,再用無(wú)菌水漂洗4-5次，放入26'Ci2""C培養(yǎng)過(guò)夜，次日再用75。/。乙醇處理5min，之后用0.1%氯化汞溶液浸泡5min，再用無(wú)菌水漂洗4^5次。將消毒的稻種分別接種到50ml的三角瓶中，每瓶接種6粒種子，每個(gè)材料做100瓶。首先在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基28'C士2X:全黑暗條件下培養(yǎng)7d，然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照時(shí)間為12~14h/d，光強(qiáng)為18002100Lux。接種不同的天數(shù)分別記錄出愈的數(shù)目。計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的愈傷組織米粒敏接種的米粒數(shù)^100%。結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果紀(jì)錄在圖1的圖表中，由圖1可見(jiàn)，在M8作為基本培養(yǎng)基時(shí)，在相同時(shí)間內(nèi)，其出愈率始終最大，且最后最大可達(dá)到66.7%。其次是在N6培養(yǎng)基上，雖然出愈最晚，但是其出愈率最終也可達(dá)到64.2%。在MS培養(yǎng)基上，武育粳3號(hào)的最大出愈率僅為41.7%。本發(fā)明選用M8作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。實(shí)施例2市售的白砂糖對(duì)不同單一碳源的替代效果碳源的選擇M8大量元素、微量元素和Bs維生素為基本組分，分別添加質(zhì)量比8%瓊脂條、0.5%的山梨醇、2mg/L的2+二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6—芐基腺嘌呤，選擇質(zhì)量比3%的市售的白砂糖作為碳源(白砂糖購(gòu)自江蘇南京蘇果超市，3.5元/500g);M8大量元素、微量元素和Bs維生素為基本組分，分別添加質(zhì)量比8%瓊脂條、0.5%的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6—芐基腺嘌呤，選擇質(zhì)量比3%的蔗糖作為碳源(購(gòu)自上海開(kāi)米化學(xué)有限公司，價(jià)格82元/500g);M8大量元素、微量元素和Bs維生素為基本組分，分別添加質(zhì)量比8%瓊脂條、0.5%的山梨醇、2mg/L的2，冬二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6—芐基腺嘌呤，選擇質(zhì)量比3%的麥芽糖作為碳源(購(gòu)自楚和生物公司的美國(guó)原裝，137.59力250g);M8大量元素、微量元素和B5維生素為基本組分，添加與M8質(zhì)量比8%瓊脂條，與M8質(zhì)量比0.5。/。的山梨醇，2mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，以及0.5mg/L的6—芐基腺嘌呤，選擇與M8質(zhì)量比3%的葡萄糖作為碳源。(國(guó)產(chǎn)無(wú)水葡萄糖13.9元/500g)水稻揚(yáng)輻粳7號(hào)當(dāng)年收獲的種子為外植體材料。試驗(yàn)方法將揚(yáng)輻粳7號(hào)的成熟種子去殼，經(jīng)75%乙醇處理5min，用0.1%氯化汞溶液浸泡15min，再用無(wú)菌水漂洗4-5次，放入28"C士2""C培養(yǎng)過(guò)夜，次日再用75y。乙醇處理5min，之后用0.1%氯化汞溶液浸泡5min，再用無(wú)菌水漂洗4-5次。將消毒的稻種分別接種到50ml的三角瓶中，每瓶接種6粒種子，每個(gè)材料做100瓶。首先在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基26。C士2'C全黑暗條件下培養(yǎng)7d，然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照時(shí)間為1214h/d，光強(qiáng)為18002100Lux。接種35天記錄不同碳源條件下水稻成熟胚出愈的數(shù)目。計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率愈傷組織誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生的愈傷組織米粒數(shù)/接種的米粒數(shù))x1000/。。試驗(yàn)結(jié)果列于表1，由表1可見(jiàn)水稻秈粳亞種對(duì)單一碳源蔗糖，麥芽糖，葡萄糖與市售的白砂糖的反應(yīng)基本一致，用白砂糖代替培養(yǎng)基中的蔗糖或麥芽糖或葡萄糖，也可以達(dá)到類(lèi)似的誘導(dǎo)效果，降低培養(yǎng)基成本。表l不同碳源對(duì)揚(yáng)輻粳7號(hào)成熟胚出愈率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例3不同水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)組愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基秈稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量比3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5%的山梨醇、lmg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、lmg/L的脫落酸、1.5mg/L的6-芐基腺嘌呤和0.2mg/L的激動(dòng)素；粳稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量比3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5%的山梨醇、2mg/L的2，4^二氯苯氧乙酸、lmg/L的脫落酸、0.5mg/L的6-芐基腺嘌呤和0.2mg/L的激動(dòng)素；雜交稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量比3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5%的山梨醇、2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、lmg/L的脫落酸，lmg/L的6-芐基腺嘌呤和0.2mg/L的激動(dòng)素；上述各愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH5.8。對(duì)照組愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6基本成分為基礎(chǔ)，添加2mg/L的2,4"二氯苯氧乙酸、3g/L的蔗糖、6g/L的瓊脂，pH5.8[黃賽麟等(2008年)報(bào)道的適合不同類(lèi)型的改良培養(yǎng)基N6I的配方]。實(shí)驗(yàn)材料秈稻選擇秈稻1號(hào)、R14、070057、9311、明恢63、協(xié)青早B、粵泰B、滇屯502和揚(yáng)輻秈6號(hào)；粳稻選擇南京41、南京17111、淮稻9702、水晶3號(hào)、揚(yáng)輻粳7號(hào)、揚(yáng)輻粳8號(hào)、武運(yùn)粳、日本晴和武育粳3號(hào)；雜交稻中兩系雜交稻選擇兩優(yōu)培九、淮兩優(yōu)和紅蓮優(yōu)6號(hào)；三系雜交稻選擇汕優(yōu)63和協(xié)優(yōu)9308。試驗(yàn)方法取上述不同類(lèi)型的每種水稻種子去皮，分別將秈稻接種在秈稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，將粳稻接種在粳稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；將雜交稻接種在雜交稻愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，同時(shí)將不同類(lèi)型的水稻種子去皮接種在對(duì)照組愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。同步愈傷誘導(dǎo)，首先7天的暗培養(yǎng)，大部分成熟胚均生出短小的胚芽，明顯形變，然后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光照時(shí)間14h/d，光強(qiáng)為2000Lux，10~15天在水稻的盾片處陸續(xù)產(chǎn)生白色或淺黃色顆粒狀愈傷組織，與其他的暗誘導(dǎo)相比，一周后轉(zhuǎn)入光下，愈傷組織增殖快，而且淺黃色顆粒狀愈傷組織較多。21天后少量非胚性的白色水化愈傷組織分化出毛狀根、愈傷組織呈蓬松狀或褐化，其他仍保持淺黃色顆粒狀愈傷組織，誘導(dǎo)培養(yǎng)35天后記錄其出愈率，培養(yǎng)過(guò)程的培養(yǎng)室溫度為28"C3(TC。從表2中可以看出，相比較而言，粳稻出愈最快，秈稻出愈較慢，而雜交稻則處于兩者之間，取決于雜交稻的偏秈還是偏粳稻特性。但是使用對(duì)照的改良培養(yǎng)基N61，雖然報(bào)道的水稻品種如粳稻日本晴和滇屯502，可以達(dá)到類(lèi)似的誘導(dǎo)效果，但是其他供試材料的誘導(dǎo)效果則差異很大；而使用本發(fā)明的培養(yǎng)基基配方可以使不同類(lèi)型的水稻材料成熟胚的出愈率均可以達(dá)到》60%，適應(yīng)性很好，具有通用性。表2不同水稻品種成熟胚的愈傷誘導(dǎo)率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>雜交稻、秈稻和粳稻的愈傷組織分別參見(jiàn)圖2、圖3和圖4。實(shí)施例4愈傷組織的繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)基M8大量元素、微量元素和有機(jī)成分、鐵鹽為基本組分，白砂糖濃度為30g/L，瓊脂條8g/L,附加0.5lmg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，實(shí)驗(yàn)方法將實(shí)施例3中試驗(yàn)組誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)35天后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，愈傷組織的質(zhì)量隨繼代時(shí)間而形態(tài)上有明顯變化在光下培養(yǎng)，水漬狀愈傷組織在所有繼代培養(yǎng)基中5~7天全部死亡;蓬松狀愈傷組織(圖6)轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基生長(zhǎng)迅速，但710天后，部分蓬松狀愈傷組織產(chǎn)生大量的毛狀結(jié)構(gòu)和不定根，大部分蓬松狀愈傷組織15天以后逐漸惡化，喪失綠苗分化的能力；而只有從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中選擇色澤鮮亮、顆粒狀愈傷組織繼代后，愈傷組織增殖快，IO天后，部分愈傷組織開(kāi)始變?yōu)榕钏蔂?圖6)，開(kāi)始分化出綠芽點(diǎn)或毛狀根，而且水稻成熟胚誘導(dǎo)白色、半透明、粘狀(圖5)或水漬化愈傷組織(圖7)經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后易喪失植株分化能力，綠苗分化率也很低，培養(yǎng)過(guò)程的培養(yǎng)室溫度均為28°C~30°C，光照時(shí)間14h/d，光強(qiáng)為2000Lux。本實(shí)施例還發(fā)現(xiàn)，本實(shí)施例重點(diǎn)選用實(shí)施例3中通過(guò)試驗(yàn)組獲得的揚(yáng)輻粳7號(hào)的愈傷組織，研究繼代培養(yǎng)基組分與繼代能力的關(guān)系，結(jié)果表明最適繼代培養(yǎng)基激素組成還與成熟胚初始誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基激素組分有關(guān)。從表3可見(jiàn)，當(dāng)繼代培養(yǎng)基中施用的2,4-二氯苯氧乙酸濃度與初始誘導(dǎo)的濃度相等的時(shí)候，可以保持70%的繼代率，而當(dāng)比初始誘導(dǎo)愈傷的濃度降低，可以顯著增加繼代率，達(dá)到80%以上，而且胚性愈傷組織的增殖較快，并獲得較高的分化能力，在繼代培養(yǎng)基中增加一些激動(dòng)素，有利于愈傷組織的增殖和保持胚性的顆粒狀態(tài)。表3不同2,4"D濃度對(duì)誘導(dǎo)的愈傷組織繼代能力的比較材料名稱(chēng)繼代培養(yǎng)2，4"D愈傷組織的形態(tài)接種后新生長(zhǎng)的愈傷繼代率(％)濃度(mg/L)組織出現(xiàn)的時(shí)間(d)揚(yáng)輻粳7號(hào)3干燥，顆粒，增殖慢14542干燥，增殖慢10691蓬松，顆粒，增殖快7890.5白色，水化，增殖快885實(shí)施例5愈傷組織的成苗和移栽分化培養(yǎng)基以MS的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，添加lg/L的活性炭、8g/L的瓊脂條、30g/L的白砂糖、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和lmg/L的苯基脲類(lèi)細(xì)胞分裂素；幼苗壯根培養(yǎng)基以1/2MS基本成分為基礎(chǔ)，添加15g/L的白砂糖、10g/L的瓊脂條、0.2mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的多效唑。將實(shí)施例4中繼代培養(yǎng)基誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中蓬松狀愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基光下培養(yǎng)，光照時(shí)間14h/d，光強(qiáng)為2000Lux，14天后，帶綠芽點(diǎn)的愈傷組織(圖8)在本發(fā)明的分化培養(yǎng)基上即可分化成植株，分化綠芽點(diǎn)(圖9)甚至可一步成苗。采用本發(fā)明所述的分化培養(yǎng)基，考察不同水稻類(lèi)型材料均可以獲得260%的分化率(表4)。分化培養(yǎng)21天后，選取含綠芽的顆粒狀愈傷組織的小苗(圖IO)轉(zhuǎn)入壯根培養(yǎng)基光下培養(yǎng)，光照時(shí)間14h/d，光強(qiáng)為2000Lux，生長(zhǎng)14~21天，長(zhǎng)成3片葉且根系發(fā)達(dá)，形成健壯試管植株根系發(fā)達(dá)茁壯(圖11)。健壯試管植株在培養(yǎng)室中培養(yǎng)3天(圖12)，冬季和早春試管苗移栽至簡(jiǎn)易大棚經(jīng)7天溫室煉苗后，活棵快，移栽至大田成活率達(dá)95%以上，生長(zhǎng)健壯的小苗15天左右長(zhǎng)出新的分蘗；其它生長(zhǎng)季節(jié)可直接移栽至大田，即可發(fā)育成熟，結(jié)出飽滿(mǎn)的種子。在分化、壯根、培養(yǎng)室中培養(yǎng)和練苗過(guò)程中的環(huán)境溫度均為28~30°C。表4不同水稻品種成熟胚的愈傷分化率材料名稱(chēng)水稻類(lèi)型接種愈傷組織數(shù)出現(xiàn)綠芽的愈傷數(shù)分化率(％)南京41粳稻1207865.7南京niii1148574.6淮稻97021209478.2水晶3號(hào)1209175.7揚(yáng)輻粳7號(hào)1208974.2揚(yáng)輻粳8號(hào)1209276.7武運(yùn)粳1208470.7武育粳3號(hào)1208873.3日本晴1199580.1秈稻l號(hào)秈稻1207160.2R141207160.00700571207461.793111207360.8明恢631207664.8協(xié)青早B1207163.2粵泰B1207160.0揚(yáng)輻秈6號(hào)1207562.5滇屯5021218066.2兩優(yōu)培九兩系雜交稻1187371.8淮兩優(yōu)1146960.0紅蓮優(yōu)6號(hào)1177261.5汕優(yōu)63三系雜交稻1207563.1協(xié)優(yōu)930812074.862.3以上各實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的具體限制，具體實(shí)施時(shí)可以在權(quán)利要求規(guī)范的范圍內(nèi)調(diào)整各種培養(yǎng)基，選擇不同階段的培養(yǎng)期，完成栽培水稻成熟胚高頻植株再生。1權(quán)利要求1、一種栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，水稻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代的基本培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和幼苗壯根培養(yǎng)基均在高壓滅菌前調(diào)整pH值為5.8～6.1；愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化和幼苗壯根均在試管中完成，培養(yǎng)過(guò)程中的環(huán)境溫度為28℃～30℃，其特征在于水稻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代的基本培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和幼苗壯根培養(yǎng)基中的復(fù)合碳源為白砂糖；在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)的前7天全暗培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，獲得愈傷組織；選取淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基光下培養(yǎng)；然后選取蓬松狀愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)；再選取含綠芽的顆粒狀愈傷組織再轉(zhuǎn)入幼苗壯根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，長(zhǎng)成3片葉且根系發(fā)達(dá)后，形成健壯試管植株。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)耗時(shí)28~35天；繼代培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和幼苗壯根培養(yǎng)分別耗時(shí)14~21天；在愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化和幼苗壯根期間的光下培養(yǎng)期間，光照時(shí)間為12~14h/d，光強(qiáng)為18002100Lux。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，再添加質(zhì)量比分別為3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5%的山梨醇、l-2mg/L的2,4"二氯苯氧乙酸、lmg/L的脫落酸，03~2.0mg/L的6-芐基腺嘌呤和0.2mg/L的激動(dòng)素。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于所述的水稻為秈稻，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2,4>二氯苯氧乙酸的添加量為lmg/L，6-芐基腺嘌呤的添加量為1.5~2mg/L。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于所述的水稻為粳稻，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-二氯苯氧乙酸的添加量為2mg/L，6-芐基腺嘌呤的添加量為0.3~0.6mg/L。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于所述的水稻為雜交稻，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2,4-二氯苯氧乙酸的添加量為l~2mg/L，6-芐基腺嘌呤的添加量為0.6~1.5mg/L。7、根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述的栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于所述的繼代的基本培養(yǎng)基以M8的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，分別添加質(zhì)量比3%的白砂糖、0.8%的瓊脂條、0.5~1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.1-0.2mg/L的激動(dòng)素；所述的分化培養(yǎng)基以MS的大量元素、有機(jī)成分、微量元素的基本成分為基礎(chǔ)，添加lg/L的活性炭、8g/L的瓊脂條、30g/L的白砂糖、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和lmg/L的苯基脲類(lèi)細(xì)胞分裂素；所述的幼苗壯根培養(yǎng)基以1/2MS基本成分為基礎(chǔ)，添加15g/L的白砂糖、10g/L的瓊脂條、0.2mg/L的萘乙酸和0.4mg/L的多效唑。全文摘要本發(fā)明涉及一種栽培水稻成熟胚高頻植株再生方法，其特征在于水稻的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代的基本培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和幼苗壯根培養(yǎng)基中的復(fù)合碳源為白砂糖；在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)的前7天全暗培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，獲得愈傷組織；選取淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基光下培養(yǎng)；然后選取蓬松狀愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)；再選取含綠芽的顆粒狀愈傷組織再轉(zhuǎn)入幼苗壯根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，形成健壯試管植株。文檔編號(hào)A01H4/00GK101536673SQ200910029469公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年4月14日優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日發(fā)明者周月蘭,霞李,閻麗娜申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院