專利名稱：：異甘草甙的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物殺菌劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種甘草提取物中有效成分異甘草甙在防治植物病害中的新用途。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著植物病理學(xué)、生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，農(nóng)藥中殺菌劑的研究已進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。高效內(nèi)吸性殺菌劑如Strobilurn類殺菌劑的出現(xiàn)，一方面使植物病害的防治獲得了突破性進(jìn)展，另一方面也造成病原菌對(duì)藥劑的抗性問題日益突出。尋求對(duì)環(huán)境相容性好，對(duì)病原菌具有持久效果的無公害農(nóng)藥，在綠色食品日益被重視的今天顯得格外重要。天然產(chǎn)物常表現(xiàn)出許多生物活性，數(shù)百年來廣為人們所用。其中，植物源殺菌活性成分的研究和開發(fā)是解決當(dāng)前化學(xué)殺菌劑諸多負(fù)面效應(yīng)的一個(gè)重要研究方向。植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過400000種，據(jù)報(bào)道，現(xiàn)在地球上的35萬多種植物中，約有2400種植物具有控制有害生物的活性。多年以來，國內(nèi)外科研工作者對(duì)多種植物如楝科Meliacea植物中米仔蘭屬Aglaia植物、樟科Lauraceae植物印度鱷梨Perseaindica、天南星科Araceae、植物菖蒲等進(jìn)行了殺蟲物質(zhì)的研究，而植物源抑菌、殺菌活性物質(zhì)的研究相對(duì)較少，實(shí)際上據(jù)報(bào)道有1389種植物有可能作為殺菌劑，植物中的抗毒素、類黃酮、罹病相關(guān)的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和酚類化合物等均有殺菌和抗菌活性。植物源殺菌物質(zhì)大多為復(fù)合的抑菌有效成分，且具有多種作用位點(diǎn)和作用機(jī)制，因而植物被認(rèn)為是化學(xué)合成殺菌劑替代品最好的開發(fā)資源。甘草是豆科甘草屬植物，其根和根莖是最常用的中藥，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古和新疆維吾爾自治區(qū)，除用作藥品外，還廣泛用在食品、釀造和化妝品工業(yè)上，有著越來越廣的應(yīng)用前景。近些年，甘草的活性研究已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。在臨床醫(yī)學(xué)上，該屬植物廣泛用于抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗?jié)?、抗肝炎、解毒、治療?nèi)分泌系統(tǒng)疾病等方面，即具有抗腫瘤作用、抗炎及抗變態(tài)反應(yīng)作用、抗病原微生物作用、免疫調(diào)節(jié)作用等功效，作為抗病原微生物藥物還可以應(yīng)用在食品的保鮮防腐方面。在甘草屬植物中，人們己對(duì)烏拉爾甘草、脹果甘草、光果甘草、黃甘草、粗毛甘草等進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，如不同種、同種不同產(chǎn)地、植株不同部位、不同組織結(jié)構(gòu)中甘草次酸(Clycyrrhetinicaci)含量的對(duì)比。實(shí)際上，從甘草屬植物中已分離出約170余種化合物，其主要化合物是黃酮類和三萜類化合物，還有少量的生物堿，木質(zhì)素，香豆素和多種氨基酸；在研究的成分種類上，主要有甘草甜素(Glycyrrhizin)、甘草多糖類(Glycyrrhizapolpsacchride)、甘草黃酮類(Glycyrrhizaflavonoides)，分別研究了它們的性質(zhì)及用途。甘草的殺菌活性可見于醫(yī)學(xué)上的報(bào)道，而關(guān)于甘草提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性未見報(bào)道，尤其是對(duì)甘草中具體是哪一種活性成份具有殺菌活性未見有技術(shù)報(bào)道。研究甘草提取物對(duì)植物病原菌的抑菌活性，將甘草提取物質(zhì)應(yīng)用到植物病害的防治上，對(duì)解決病原菌對(duì)藥劑日益突出的抗性問驛具有重要的意義。而具體研究甘草提取物中活性成分對(duì)植物病原菌的抑菌活性將可以提高防治的針對(duì)性和提高防治效率，具有重要的應(yīng)用前景，目前沒有見到相關(guān)技術(shù)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服植物殺菌劑技術(shù)的不足，提供甘草提取物活性成分異甘草甙在殺菌方面的新應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來予以實(shí)現(xiàn)提供異甘草甙(isoliquiritin)在防治植物病害中的應(yīng)用。所述異甘草甙(isoliquiritin)為為甘草甲醇提取物中活性成分。所述異甘草甙(isoliquiritin)的制備方法是采集甘草全株，優(yōu)選甘草根，置于5(TC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干；粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，所得甘草粉用密封袋密封避光處保存?zhèn)涮崛∮?。采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)對(duì)甘草粉粉進(jìn)行提取。甘草粉甲醇提取物再進(jìn)行活性成份的分離、提純以及結(jié)構(gòu)鑒定確認(rèn)活性成分為異甘草甙(isoliquiritin)。將異甘草甙(isoliquiritin)配制成一定濃度的供試藥液，采用菌絲生長速率法、孢子囊芽管萌發(fā)法、離體葉片法對(duì)霜疫霉屬(i^roMO/p/^/ZzonaChen)、疫霉屬(尸/z^to//2f/7oraca/w/c/Leonian)、芽枝霉屬(C7^/ospoW謂LK.exFr)、核盤菌屬(5Wera"'m'a入炭疽菌屬(Co〃etoWc/mmCorda)等屬的常見植物病害進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定并進(jìn)行了溫室盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)供試病原菌具有良好的抑制效果，可以開發(fā)其在防治植物病害中的新用途。作為一個(gè)優(yōu)選方案，本發(fā)明提供了所述異甘草甙(isoliqiiiritin)以400pg/mL的干粉濃度應(yīng)用于防治辣椒辣椒疫霉病。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明突破傳統(tǒng)的甘草僅應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)的限制，對(duì)甘草的應(yīng)用提出了新的思路，并確定了甘草提取物活性成分異甘草甙(isoliquiritin)用于防治植物病害的技術(shù)方案。為植物替代化學(xué)合成殺菌劑提供了新的開發(fā)資源，對(duì)解決病原菌對(duì)藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1異甘草甙(isoliquiritin)的制備采集甘草根，置于5(TC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干；粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。所得植物粉用密封袋密封避光處保存?zhèn)涮崛∮谩１景l(fā)明采用現(xiàn)有常規(guī)的超聲波提取法制備甘草提取物，也可以參用現(xiàn)有的其他常規(guī)技術(shù)提取制備。將制備得到的甲醇提取物經(jīng)分離、提純以及結(jié)構(gòu)鑒定得到異甘草甙(isoliquiritin)。實(shí)施例2:異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)霜疫霉屬(尸ero/，A^/oraChen)病菌的抑制作用用75%甲醇作為溶劑溶解提取物，然后再與PDA培養(yǎng)基配制成帶毒培養(yǎng)基，以菌絲生長速率法測定不同濃度提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌絲生長的抑制作用。具體操作是-采用菌絲生長速率法用75%甲醇作為溶劑將異甘草甙(isoliquiritin)配制成一定濃度的供試藥液，準(zhǔn)確吸取lmL藥液加入到49mL融化的PDA培養(yǎng)基中(約50°C)混合均勻后倒入滅過菌的培養(yǎng)皿中(直徑9cm)，每瓶均勻倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中，配制成所需濃度的帶毒培養(yǎng)基。以混入相同體積的無菌水或75°/。甲醇做對(duì)照。供試病菌荔枝霜疫霉病菌在直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi)用約17mLPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后在菌落邊緣菌絲生長旺盛處用打孔器打取直徑為0.6cm的菌餅，分別接種于每個(gè)培養(yǎng)皿中央，有菌絲的一面向下。每個(gè)培養(yǎng)皿放一個(gè)菌餅，每個(gè)處理做三個(gè)重復(fù)，25。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后，采用十字交叉法測定菌落直徑(cm)，按以下公式計(jì)算抑菌率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l:抑菌率(％)=(CK菌落直徑一0.6)—(處理菌落直徑一0.6)CK菌落直徑一0.6:100表1異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)荔枝霜疫霉病菌菌絲生長的抑制作用(7天)處理濃度(干粉)mg/mL(cm)(f±S,￡.)平均抑菌率(%)CK(1.5%甲醇)107.422.68土0.031h1.43士0.021k0.78士0.031L63.836c80.683b89.443a注1)表中結(jié)果為三次重復(fù)的平均值；2)同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有相同字母者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。實(shí)驗(yàn)表明，異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)荔枝霜疫霉病菌菌絲生長的抑制率明顯高于處理，在10mg/mL、5mg/mL、lmg/mL干粉濃度時(shí)抑制率達(dá)89.443%、80.683%、63.830%，顯示出很強(qiáng)的抑菌作用。實(shí)施例3:異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)霜疫霉屬(尸erOT0p力7"araChen)病菌的抑制作用采用載玻片法(方中達(dá)，1998)測定將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)IO天的荔枝霜疫霉病菌用無菌水洗下孢子囊，加入藥液制備成含各種濃度藥液的孢子囊懸浮液，孢子囊濃度調(diào)整為每視野(10x10倍)約4060個(gè)孢子囊，取50pL孢子囊懸浮液滴在載玻片上，再將載玻片置于已放一張濾紙的9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，并在濾紙上滴加少量無菌水以保濕，蓋上培養(yǎng)皿，置于28匸下光照培養(yǎng)4小時(shí)后觀察孢子囊萌發(fā)情況。按下式計(jì)算藥劑處理的孢子囊萌發(fā)率和藥劑對(duì)孢子囊萌發(fā)的抑制百分率。孢子囊萌發(fā)數(shù)孢子囊萌發(fā)率(°/。)=^^一——x100觀察孢子囊數(shù)對(duì)照孢子囊萌發(fā)率一藥劑處理孢子囊萌發(fā)率孢子囊萌發(fā)抑制率(％)=-xioo對(duì)照孢子囊萌發(fā)率采用載玻片法測定了異甘草甙(isoliquiritin)在1.3、1.0、0.7、0.5、0.3、0.15mg/mL下對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊芽管萌發(fā)的抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明處理后4小時(shí)，顯微鏡下觀察，隨著處理濃度的升高，孢子囊萌發(fā)率相應(yīng)降低，抑制率依次為97.84%、86.45%、67.27°/。、52.67%、30.21%、13.26%，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。將平均抑制率值進(jìn)行百分率一概率轉(zhuǎn)換，以概率幾率值為橫坐標(biāo)，處理濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，求取回歸曲線，得到毒力回歸方程y=3.0474x+5.9922，相關(guān)系數(shù)R=0.9288，EC5Q為0.47mg/mL，95%置信限0.450.49。表2異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)荔枝霜疫霉病菌孢子囊芽管萌發(fā)的抑制活性(4小時(shí))處理(mg/mL)孢子囊總數(shù)萌發(fā)孢子囊總數(shù)萌發(fā)率(%)(f士S.五.)抑制率(%)1.3679182.16±0.4297.84士0.42fL07394213.55±1.0786.45士1.07e0.76729032.73±0.9667.27±0.96d0.572027847.33±0.9952.67士0.99c0.379474769.79±1.7630.21士1.76b0.1573369886.74±1.9713.26士1.97aCK70868997.28±0.882.72±0.88注1)表中萌發(fā)率、抑制率結(jié)果分別為五次重復(fù)的平均值;2)同一列數(shù)據(jù)后標(biāo)有相同字母者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。實(shí)施例4:異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)疫霉屬(尸力ytop力t力oracapw'cj'Leonian)病菌的的溫室盆栽試驗(yàn)辣椒疫霉病菌孢子囊液的制備采用MSS溶液法(常彩濤等，1995)誘導(dǎo)辣椒疫霉病菌產(chǎn)生大量孢子囊，即將在PSA上培養(yǎng)7天的菌絲塊，接種于含PS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在2527。C下培養(yǎng)4860小時(shí)后，濾去液體培養(yǎng)基，用20mLMSS液將濾紙上的菌絲清洗沖回三角瓶，在2527C下光照培養(yǎng)24小時(shí)后，取培養(yǎng)菌液用于接種辣椒苗上。試劑配方如下(1)MSS液配方MgS047H20,KN03Fe-EDTA蒸餾水(2)Fe-EDTA的配方:EDTA-Na2FeS047H20蒸餾水0.004mol/L0.05mol/LlmL1000mL14.86g24,9glOOOmL盆栽試驗(yàn)在塑料大棚中進(jìn)行。每個(gè)塑料盆缽裝自然風(fēng)干菜園土0.5kg，移栽4葉期健壯辣椒苗。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5盆，每盆4株。在幼苗長到45片真葉時(shí)，先噴藥液，對(duì)照噴自來水，并設(shè)甲霜靈對(duì)照，2h后噴接制備好的辣椒疫霉病菌孢子囊懸浮液，并立即覆蓋塑料薄膜保濕24h。2、4、7d分別觀察發(fā)病情況，記錄溫度，發(fā)病程度一株為單位，按04級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)査0級(jí)無??；l級(jí)l片葉發(fā)??；2級(jí)2片葉發(fā)??；3級(jí)3片葉發(fā)??；4級(jí)4片以上葉發(fā)病或莖受害i:(病級(jí)葉片數(shù)x病級(jí)級(jí)數(shù))病情指數(shù)=葉片總數(shù)X最高病級(jí)級(jí)數(shù)處理病情指數(shù)防治效果(％)=(1對(duì)照病情指數(shù)xiooxioo實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示表3異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)辣椒疫霉病的盆栽防治效果2d5d10d濃度|ig/mL病情指數(shù)(%)防效(%)病情指數(shù)(%)防效(%)病情指數(shù)(%)防效(%)對(duì)照24.17/52.5/80.00/508.3365.53b29.1744.43c52.5034.38c1006.6772.40b13.3374.6lab40.0050.00b2003.3386.22ab9.1782.53a25.0068.75ab3002.5085.65ab8.3384.13a20.0075.00a4000.8396.56a5.8388.89a10.8386.46a53%雷多米爾錳鋅3.3386.22ab7.5085.71a16.6779.16a注1)53%雷多米爾處理為稀釋500倍液；2)表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值；數(shù)據(jù)后標(biāo)有相同字母者表示在5%水平上差異不顯著(DMRT法)。室內(nèi)盆栽測試結(jié)果顯示，異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)辣椒疫霉病有較好的防治效果，防治效果隨處理濃度的升高而提高。供試濃度為50、100、200、300、400ng/mL時(shí)，處理2天后防效依次為65.54%、72.40%、86.22%、85.66%、96.57;處理5天后防效依次為44.44%、74.61%、82.53%、84.13%、88.90%;處理10天后防效依次為34.38%、50.00%、68.75%、75.00%、86.46%。結(jié)果還顯示處理濃度為400Mg/mL的防效優(yōu)于對(duì)照藥劑雷多米爾錳鋅。實(shí)施例5:異甘草甙(isoUquiritin)對(duì)3種病原菌的抑菌活性采用菌絲生長速率法測定異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)3種分屬于芽豐支霉屬(C7a^wpcWwmLK.exFr)、核盤菌屬(5Weraf/m'a入炭疽菌屬(Co//etoWc/mwCorda)的花生黑霉病、大麥條紋病、香蕉炭疽病原真菌的抑制效果。在無菌條件下，配制不同濃度藥劑，再倒入已融化的培養(yǎng)基(溫度約為60°C)中，充分搖勻，趁熱倒入90cm的培養(yǎng)皿中制成含藥培養(yǎng)基平板。平板凝固冷卻后用接種針接進(jìn)大小一致、生長一致的各種植物病原真菌菌餅(O=5.0mm)，每皿接1個(gè)菌餅，生長有菌落的一面朝下，每處理3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)清水空白對(duì)照、1%甲醇對(duì)照。置于生化培養(yǎng)箱中，25匸條件下培養(yǎng)5天，再用十字交叉法測量供試真菌菌落直徑的大小，按以下公式計(jì)算抑菌率，進(jìn)而計(jì)算藥劑處理對(duì)不同病菌的有效抑制中濃度(EC5())及相關(guān)系數(shù)(。值。加es。n—[CK(o)-原菌餅o]-[處理(o)-原菌餅①]x100抑菌率(^)一[CK(①)-原菌餅①]Xl00抑菌活性測定結(jié)果見表4<表4異甘草甙對(duì)3種植物病原真菌的抑菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、異甘草甙在防治植物病害方面的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述異甘草甙為甘草干燥根的甲醇提取物中活性成分。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述異甘草甙的制備方法是采集甘草全株，烘干，粉碎得甘草粉；甘草粉經(jīng)提取得到甘草提取物；提取物經(jīng)分離、提純和結(jié)構(gòu)鑒定得到異甘草甙。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物病害包括霜疫霉屬、疫霉屬、芽枝霉屬、核盤菌屬和/或炭疽菌屬植物病害。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述異甘草甙以400pg/mL的濃度應(yīng)用于防治辣椒辣椒疫霉病。全文摘要本發(fā)明公開了一種異甘草甙的應(yīng)用，具體應(yīng)用于防治植物病害。通過室內(nèi)生物測定和盆栽試驗(yàn)，本發(fā)明提供了甘草甲醇提取物中活性成分異甘草甙(isoliquiritin)對(duì)霜疫霉屬(PeronophythoraChen)、疫霉屬(PhytophthoracapsiciLeonian)、芽枝霉屬(CladosporiumLK.exFr)、核盤菌屬(Sclerotinia)、炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)等屬的常見植物病害良好的防治應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)甘草及其提取物用于防治植物病害的新用途提出了新的思路，為植物替代化學(xué)合成殺菌劑提供了新的開發(fā)資源，對(duì)解決病原菌對(duì)藥劑日益突出的抗性問題具有重要的意義。文檔編號(hào)A01N43/16GK101543214SQ20091003835公開日2009年9月30日申請(qǐng)日期2009年3月31日優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日發(fā)明者勇曾,林慶勝,羅建軍,胡美英,郝衛(wèi)寧,鐘國華申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)