甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法
【專(zhuān)利摘要】甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，首先將甘草通過(guò)常用的提取方法進(jìn)行提取，得到甘草酸溶液。從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)甘草酸和甘草黃酮的同時(shí)提取；然后根據(jù)甘草酸和甘草黃酮在水中溶解性和電離常數(shù)(pKa)上的差異，以水和乙醇為溶劑，通過(guò)對(duì)干燥后提取物用不同濃度梯度的水/乙醇溶解和對(duì)溶液pH值的精密控制，使含有甘草酸和甘草黃酮的混合液依次通過(guò)聚酰胺類(lèi)的樹(shù)脂和大孔吸附樹(shù)脂混合床吸附柱吸附/解吸的方法，實(shí)現(xiàn)甘草酸和甘草黃酮的高效分離，制備出較高純度甘草酸和甘草黃酮。
【專(zhuān)利說(shuō)明】甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從甘草中同時(shí)提取甘草酸和甘草黃酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘草為常用大宗藥材，年需量約6萬(wàn)噸左右，甘草提取物被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、化工等領(lǐng)域，并大量出口。由于生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，致使原料供給不足，目前市場(chǎng)上甘草品質(zhì)下降，價(jià)格持續(xù)增長(zhǎng)。甘草中含有甘草酸、甘草黃酮等活性成分。是一種具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增強(qiáng)免疫等多項(xiàng)功能的中藥材。
[0003]目前從甘草中提取甘草酸和甘草黃酮的方法主要有以下幾種:
(I)水提法:但建明等發(fā)表的論文“甘草渣中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝研究”(石河子大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，26(1)，39-44)，該方法主要以水作為溶劑，將甘草放入提取器中，進(jìn)行水煮提取，結(jié)果表明雖然提取工藝簡(jiǎn)單、溶劑成本低、環(huán)保。但此法存在提取雜質(zhì)多、提取液存放易腐敗變質(zhì)、后續(xù)處理繁瑣等缺點(diǎn)。
[0004](2)超聲提取法:隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分的提取中。超聲波能破壞植物的細(xì)胞，從而加速藥材有效成分在溶劑中的溶解，縮短提取時(shí)間，提高有效成分的提出率，為中草藥成分的提取提供了一種快速、高效的新方法。李炳奇等發(fā)表的論文“超聲法聯(lián)合提取甘草黃酮和甘草酸的研究”(山東中醫(yī)雜志，2005，24 (I)，38-40)，采用超聲技術(shù)對(duì)甘草中黃酮和甘草酸進(jìn)行聯(lián)合提取，確定了影響提取效果的主要因素，摸索出一套恰當(dāng)?shù)母什菟岷忘S酮的提取方法。但對(duì)于超聲提取，耗能大、浪費(fèi)能源、成本高、不利于工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)也破壞了天然藥材的有效成分。
[0005](3)氨水提取法:崔杏雨等發(fā)表的論文“甘草酸制備新工藝的研究”(太原理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32(3): 271-273)，該方法主要以氨水作為溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果表明雖然提取率高于水提法，但氨水造成環(huán)境污染，不易采用。
[0006]盡管現(xiàn)有的工藝能滿(mǎn)足現(xiàn)有企業(yè)對(duì)甘草中主要成分的分離，但是，現(xiàn)有的工藝都有它的不足之處，例如:超濾法成本太高,不利于工業(yè)化生產(chǎn),但是對(duì)于甘草中主要成分的分離，現(xiàn)有的工藝往往采用大孔樹(shù)脂分離的方法，不能同時(shí)將甘草黃酮和甘草酸連續(xù)分離出來(lái)，往往是針對(duì)其中的一種成分進(jìn)行分離的。即采用單一的樹(shù)脂來(lái)分離，得到的純度很低，不利于回收。
[0007]雖然目前對(duì)MAR應(yīng)用的研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛，但研究主要集中在利用合成或市售的某一種MAR對(duì)底物的吸附分離實(shí)驗(yàn)。由于不同的MAR在極性、功能基、孔徑、孔容及比表面積等結(jié)構(gòu)參數(shù)方面都有所不同，而某一種MAR對(duì)多種成分也有不同程度的吸附，因此，對(duì)于一些物質(zhì)結(jié)構(gòu)較為相似的成分分離，采用單一類(lèi)型的MAR往往很難達(dá)到預(yù)期的分離效果，這在一定程度上限制了 MAR應(yīng)用研究更好地發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提高一種甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法。[0009]本發(fā)明是甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其步驟為:
(1)將烘干粉碎的甘草，通過(guò)常用的方法進(jìn)行提取，得到含有甘草酸和甘草黃酮的提取液，然后再將提取液濃縮、烘干干燥；
(2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分別對(duì)樣品進(jìn)行充分溶解；
(3)得到系列梯度溶液，分別測(cè)定各梯度溶液中甘草酸和甘草黃酮的含量；
(4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解；
(5)用AlCl3和NaNO2顯色法測(cè)定甘草總黃酮含量；
通過(guò)用不同大孔吸附樹(shù)脂在相同條件下進(jìn)行吸附/解吸實(shí)驗(yàn)，并采用相同方法測(cè)定殘液和解吸液中甘草總黃酮的含量，根據(jù)吸附值和解吸率選擇對(duì)甘草黃酮吸附/解吸性能優(yōu)異的大孔吸附樹(shù)脂；
(6)再將解吸液濃縮烘干，通過(guò)顯色法測(cè)其純度；
(7)取市售純度為98%的甘草酸樣品，加水完全溶解，用HPLC法測(cè)定溶液濃度；
采用與步驟(5)中同樣的方法，進(jìn)行分離甘草酸的大孔吸附樹(shù)脂混合床選擇；
(8)再將解吸液濃縮烘干，通過(guò)HPLC法測(cè)其純度。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
(1)實(shí)現(xiàn)了甘草黃酮和甘草酸的同時(shí)提取、分離技術(shù)；
(2)在最佳工藝條件下，采用動(dòng)、靜態(tài)吸附相結(jié)合的方法，首先采用靜態(tài)吸附方法對(duì)MAR進(jìn)行篩選，篩選出較好的混合床，然后再通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附的方法對(duì)其進(jìn)行分離純化；
(3)實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種成分的更高效分離，為工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)；
(4)本發(fā)明所涉及到的工藝路線(xiàn)、所用試劑等均為國(guó)際上所公認(rèn)的綠色環(huán)保技術(shù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為技術(shù)路線(xiàn)圖，圖2為甘草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]如圖1所示，甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其步驟為:
(1)將烘干粉碎的甘草，通過(guò)常用的方法進(jìn)行提取，得到含有甘草酸和甘草黃酮的提取液，然后再將提取液濃縮、烘干干燥；
(2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分別對(duì)樣品進(jìn)行充分溶解；
(3)得到系列梯度溶液，分別測(cè)定各梯度溶液中甘草酸和甘草黃酮的含量；
(4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解；
(5)用AlCl3和NaNO2顯色法測(cè)定甘草總黃酮含量；
通過(guò)用不同大孔吸附樹(shù)脂在相同條件下進(jìn)行吸附/解吸實(shí)驗(yàn)，并采用相同方法測(cè)定殘液和解吸液中甘草總黃酮的含量，根據(jù)吸附值和解吸率選擇對(duì)甘草黃酮吸附/解吸性能優(yōu)異的大孔吸附樹(shù)脂；
(6)再將解吸液濃縮烘干，通過(guò)顯色法測(cè)其純度；
(7)取市售純度為98%的甘草酸樣品，加水完全溶解，用HPLC法測(cè)定溶液濃度；
采用與步驟(5)中同樣的方法，進(jìn)行分離甘草酸的大孔吸附樹(shù)脂混合床選擇；
(8)再將解吸液濃縮烘干，通過(guò)HPLC法測(cè)其純度。[0013]本發(fā)明中所采用的大孔吸附樹(shù)脂為:從極性樹(shù)脂和非極性樹(shù)脂中選出來(lái)的幾種混
合在一起。
[0014]本發(fā)明中大孔吸附樹(shù)脂含水率的測(cè)定及其活化方法如下:
(I)大孔吸附樹(shù)脂含水率的測(cè)定
稱(chēng)取一定量的MAR，在110°c的真空干燥箱中烘36 h，取出并置于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱(chēng)重；在同樣的溫度條件下再烘30 min，取出并置于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱(chēng)重。重復(fù)前面測(cè)重過(guò)程，直到前后兩次質(zhì)量差(0.05 mg。根據(jù)烘干前后的質(zhì)量差計(jì)算其含水率。每種樹(shù)脂在測(cè)定含水率時(shí)取兩份平行樣，以保證稱(chēng)量的精確性。
[0015](2)大孔吸附樹(shù)脂的活化與純化
稱(chēng)取干重約為28 g的聚酰胺樹(shù)脂和32g MAR，分別放入250 mL瓶杯中，加入150 mL乙醇浸泡24 h后，回收浸泡液。再加入適量乙醇洗滌至加入3倍體積的蒸餾水已無(wú)白色渾濁物出現(xiàn)。加入適量的蒸餾水洗滌樹(shù)脂，浸泡5 min以后棄去洗滌液，如此反復(fù)三次，使得殘留在樹(shù)脂中的乙醇能夠較充分的被水逐漸替換。
[0016]本發(fā)明中，純度的測(cè)定和計(jì)算方法如下:
用移液管分別移取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL，分別置于25 mL容量瓶中，向容量瓶中加入蒸餾水至刻度。在波長(zhǎng)254 nm處通過(guò)HPLC測(cè)峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖 2。所得線(xiàn)性回歸方程為:y= 573572.lx-1863.46 (R2 = 0.996)，且在 0.08 ~0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。甘草黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)用NaNO2-AlCl3-NaOH顯色法來(lái)測(cè)其吸光度，A = 10.837C + 0.00161 (R2 = 0.9991 )，且在 0.002 ~0.07 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。
`[0017](3)甘草黃酮和甘草酸吸附率、吸附量、解吸量、解吸率的計(jì)算
將活化處理過(guò)的聚酰胺樹(shù)脂裝入內(nèi)徑為1.6 cm的交換柱中，準(zhǔn)確移取1000 mL總濃度為2.00 mg/mL pH為9的甘草提取物溶液，控制流速為1.6 BV/h行吸附，收集殘液，用顯色法測(cè)定殘液中甘草黃酮的含量。將吸附后的MAR用蒸餾水洗滌3次，每次間隔5 min，然后準(zhǔn)確移取2倍樹(shù)脂床體積的pH=8的70%乙醇溶液進(jìn)行解吸，控制其流速為2.5 BV/h進(jìn)行洗脫，收集解吸液，用顯色法測(cè)定解吸液中甘草黃酮的含量。然后再將交換柱中的聚酰胺樹(shù)脂換成MAR，將聚酰胺樹(shù)脂吸附殘液PH調(diào)到6以1.2 BV/h的流速進(jìn)通過(guò)MAR進(jìn)行吸附，收集殘液,通過(guò)HPLC測(cè)定殘液中甘草酸的含量，再通過(guò)2倍樹(shù)脂床體積的pH為7的70%進(jìn)行解吸，控制其流速為2 BV/h進(jìn)行洗脫，收集解吸液，用HPLC法測(cè)定解吸液中甘草酸的含量，依式(I)- (4)分別計(jì)算聚酰胺樹(shù)脂和MAR的吸附率、解吸率、吸附量及解吸量；依下式(5)計(jì)算經(jīng)吸附解吸附分離過(guò)程后所得樣品的純度。
[0018]吸附率:
【權(quán)利要求】
1.甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其步驟為: (1)將烘干粉碎的甘草，通過(guò)常用的方法進(jìn)行提取，得到含有甘草酸和甘草黃酮的提取液，然后再將提取液濃縮、烘干干燥； (2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分別對(duì)樣品進(jìn)行充分溶解； (3)得到系列梯度溶液，分別測(cè)定各梯度溶液中甘草酸和甘草黃酮的含量； (4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解； (5)用AlCl3和NaNO2顯色法測(cè)定甘草總黃酮含量； 通過(guò)用不同大孔吸附樹(shù)脂在相同條件下進(jìn)行吸附/解吸實(shí)驗(yàn)，并采用相同方法測(cè)定殘液和解吸液中甘草總黃酮的含量，根據(jù)吸附值和解吸率選擇對(duì)甘草黃酮吸附/解吸性能優(yōu)異的大孔吸附樹(shù)脂； (6)再將解吸液濃縮烘干，通過(guò)顯色法測(cè)其純度； (7)取市售純度為98%的甘草酸樣品，加水完全溶解，用HPLC法測(cè)定溶液濃度； 采用與步驟(5)中同樣的方法，進(jìn)行分離甘草酸的大孔吸附樹(shù)脂混合床選擇； (8)再將解吸液濃縮烘干，通過(guò)HPLC法測(cè)其純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述為提取過(guò)程，干燥溫度為20~60°C。`
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(2)、(3)中所述為提取物的梯度溶解，濃度范圍0-10g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(4)、(5)、(6)中所述為甘草黃酮大孔吸附樹(shù)脂混合床的選擇，吸附溫度為30-60°C，解吸溫度為 30-60°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(5)中所述大孔吸附樹(shù)脂混合床采用“接枝法”進(jìn)行篩選，即先用單一大孔吸附樹(shù)脂對(duì)甘草酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行吸附/解吸，然后選出吸附分離效果最好的大孔吸附樹(shù)脂為“干枝”，分離效果較好和一般的為側(cè)枝，進(jìn)行接枝，以此類(lèi)推，最后篩選出效果好的大孔吸附樹(shù)脂組成混合床。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(7)、(8)中所述為分離甘草酸大孔吸附樹(shù)脂混合床的選擇，烘干溫度為20~60 °C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于，本發(fā)明中所述大孔吸附樹(shù)脂是從極性樹(shù)脂和非極性樹(shù)脂中選出的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于，最終選用的大孔吸附混合床是從極性樹(shù)脂和非極性樹(shù)脂中選出來(lái)的幾種混合在一起組成的。
【文檔編號(hào)】A61K36/484GK103724394SQ201410000244
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】陳振斌, 龍佳朋, 劉曉嬌 申請(qǐng)人:蘭州理工大學(xué)