專利名稱：一種培育海水無核珍珠的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種珍珠養(yǎng)殖技術(shù)，尤其是供應(yīng)藥用的海水無核珍珠養(yǎng)殖技術(shù)。
背景技術(shù)：
天然珍珠資源稀少，在自然環(huán)境中，每一萬個(gè)母貝只能采到10余克珍珠，而且顆粒小、
形狀差，加上采珠是一件非常危險(xiǎn)而艱難的工作，隨著養(yǎng)殖珍珠的興起，采珠業(yè)也隨之消失， 所以目前市面上銷售都是養(yǎng)殖珍珠。
養(yǎng)殖珍珠與天然珍珠一樣，分為海水珍珠、淡水珍珠。人工海水育珠主要集中在廣西、 廣東的合浦、廉江和海南島等沿海地區(qū)，合浦珍珠含有豐富的營養(yǎng)成分及各類生命源物質(zhì)，為 自古以來中醫(yī)入藥首選，為中醫(yī)藥界公認(rèn)、首推的道地藥材，是藥用珍珠的主流品種，史稱廉
珠、南珠；而來源于江河湖泊的淡水珍珠習(xí)稱"東珠"，人工養(yǎng)殖淡水珍珠主要在浙江、湖南、 江蘇、安徽等省。
采用珍珠貝類外套膜上皮組織、移植到育珠貝體內(nèi)以培育珍珠的方法， 一直是人工培育 珍珠的基本技術(shù)。簡單地說人們將珠母貝外套膜上皮組織和珠核移植入貝體內(nèi)，育成人工 有核珍珠，單純插入外套膜小片則形成人工無核珍珠。單純插入外套膜小片養(yǎng)殖無核珍珠技 術(shù)在淡水珍珠的生產(chǎn)中巳經(jīng)成功地應(yīng)用，但海水養(yǎng)殖無核珍珠技術(shù)不成熟，至今沒有在生產(chǎn) 中應(yīng)用，其原因與海水天然環(huán)境下不能很好地施肥及控制病蟲害等因素有關(guān)。由于長珠緩慢、 不但成珠率低，且質(zhì)量低劣，這就失去了在生產(chǎn)中應(yīng)用的價(jià)值，所以，我們必須探索一種適 用于海水無核珍珠的養(yǎng)殖技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)在藥用珍珠領(lǐng)域具有特別重要的意義，因?yàn)槿斯げ?核海水珍珠是不適合藥用的。
我國自20世紀(jì)50年代末期開始對珍珠貝及珍珠養(yǎng)殖進(jìn)行系統(tǒng)研究。主要內(nèi)容集中在人 工育苗和人工插核育珠。但是，自20世紀(jì)50年代開始育珠試驗(yàn)至獲得成功， 一直到現(xiàn)在， 生產(chǎn)海水珍珠的貝類仍然是合浦珠母貝唱主角。因此出現(xiàn)品種老化，種質(zhì)退化和病害多，珍 珠質(zhì)差等現(xiàn)象。其次，幾十年來，插核育珠技術(shù)幾乎沒有多大改進(jìn)，插珠貝死亡率仍然很高， 成珠率低，育出的珍珠品種單一，這是制約珍珠生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
科研工作者從生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)τ榧夹g(shù)進(jìn)行了研究，日本學(xué)者最早提出了試管珍珠，所謂 試管珍珠，就是利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將珠核與外套膜細(xì)胞一起培養(yǎng)，使細(xì)胞貼在珠核上，形
3成珍珠囊，然后，植入母貝中或者直接在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)形成珍珠或者不用珠核，直接進(jìn)行細(xì)胞 培養(yǎng)，然后收集其分泌的珍珠質(zhì)液。另一種方法是運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)，將外套膜小片與珠核 一起培養(yǎng)，形成珍珠囊后再插人母貝生產(chǎn)珍珠。我國的南海水產(chǎn)研究所和廣西海洋研究所也 開展了一些這方面的工作，學(xué)者們既往遇到的一個(gè)共同難題是，外套膜細(xì)胞培養(yǎng)難以形成細(xì) 胞系，后續(xù)工作無法開展[喻達(dá)輝，蘇天鳳.生物技術(shù)在珍珠養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用.水產(chǎn)科技，2000， (1) : 13]。
王愛民等在幾年的插囊育珠實(shí)驗(yàn)中得出的一個(gè)共同的結(jié)果用外套膜細(xì)胞形成的體外珍珠 囊用于插囊育珠無法得到珍珠，而將外套膜組織塊形成的體外珍珠囊用于插囊育珠能夠得到 珍珠。說明，體外細(xì)胞培養(yǎng)所形成的珍珠囊還不是完善的珍珠囊，而由外套膜組織塊形成的 珍珠囊才具有完整的結(jié)構(gòu)和功能。但用外套膜組織塊形成的體外珍珠囊用于插囊育珠實(shí)驗(yàn)中 往往出現(xiàn)成珠率低、素珠多和育珠貝死亡率高。他們認(rèn)為這同插核技術(shù)無不相關(guān)。切口的大 小及珠核通過切口運(yùn)至預(yù)定核位的方式直接影響到體外珍珠囊的結(jié)構(gòu)變化。若體外珍珠囊在 珠核上貼附不牢固、切口過小，就會造成體外珍珠囊受到破壞，使它們在到達(dá)預(yù)定核位之前 完全脫落，無法產(chǎn)生珍珠，只能是素珠。而保持完整結(jié)構(gòu)珍珠囊的珠核最終產(chǎn)生珍珠。他們
在1999年的實(shí)驗(yàn)中，改進(jìn)了插核技術(shù)，切口變大，擴(kuò)大輸送通道，但用組織塊培養(yǎng)技術(shù)將外 套膜小片與珠核一起培養(yǎng)獲得的珍珠囊應(yīng)用于海水養(yǎng)殖，只是取得4. 05%的成功率，要應(yīng)用于
生產(chǎn)，還有很多基礎(chǔ)工作要做[王愛民，閻冰,蘇瓊，等.馬氏珠母貝珍珠囊體外培養(yǎng)及插囊
育珠.廣西科學(xué)，2000， 7(1): 70]。
針對上述相關(guān)研究現(xiàn)狀 一是在外套膜細(xì)胞體外培養(yǎng)珍珠囊方面，由于目前尚無法精確
地分離外套膜組織中的各類細(xì)胞，特別是外上皮細(xì)胞、內(nèi)上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞三類細(xì)胞， 因此無法按比例在體外建立珍珠囊，其結(jié)果是雖然有不少細(xì)胞粘附在珠核上，但細(xì)胞之間無 法建立應(yīng)有的連接，不能形成結(jié)構(gòu)完整的珍珠囊。二是用外套膜組織塊貼附在珠核上進(jìn)行培 養(yǎng)，外套膜組織建立體外珍珠囊的過程同體內(nèi)建立珍珠囊的過程基本上是一致的，外上皮細(xì) 胞從外套膜組織塊中遷出，沿著珠核的表面移動(dòng)，逐漸包裹珠核表面。同時(shí)外套膜組織中的 結(jié)締組織細(xì)胞再包裹在外上皮細(xì)胞表面，最終形成結(jié)構(gòu)較完整的珍珠囊，這種珍珠囊是真正 意義上的珍珠囊，但用于插囊育珠成功率非常低，還需要解決體外珍珠囊在珠核上貼附不牢 固，擴(kuò)大切口，對育珠貝損傷大等基礎(chǔ)性問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在天然海水環(huán)境下，能夠促進(jìn)珍珠生長，育珠成活率及成珠率 高，珍珠質(zhì)量好，無污染的海水無核珍珠人工養(yǎng)殖方法。
所述的海水無核珍珠養(yǎng)殖方法，包括下述步驟(1) 首先按常規(guī)方法取出健康珠母貝外套膜上皮組織，除去裙帶部分，凈化處理后切成 盡可能細(xì)的小塊，加入質(zhì)量含量0.1-0.8%蛋白酶溶液，在20-28。C的溫度下消化15 20min， 然后加入帶有貝血清的培養(yǎng)液中止消化。
所述的蛋白酶溶液是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶等商品酶。 所述的蛋白酶溶液的制備是按比例秤取胰蛋白酶，溶解于重蒸餾水或三蒸水中配制成
0.1-0.8%的胰蛋白酶溶液，混勻，過濾除菌，4C備用，其中的過濾除菌可以采用板框過濾器、
微孔濾膜密閉過濾等形式。
所述的帶有貝血清的培養(yǎng)液是從珍珠貝心臟或大血管中取出血液，經(jīng)離心，取上清液得
到；要求貝血清必須及時(shí)采集及時(shí)使用，如果不能及時(shí)使用，應(yīng)當(dāng)將貝血清于一2(TC保存，
使用前置入4'C容器融化，盡快使用。
(2) 培養(yǎng)液的配制貝組織液貝血清滅菌過濾的天然海水=1 1.5: 0.5 1: 8,使
用時(shí)每100ml溶液中加入100IU/ml青霉素0.5-2ml，0.1g/L鏈霉素0.5-2ml，或者其中的一種， 用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至6.6-7.4。
(4) 將上述含有經(jīng)消化的外套膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液置20'C的恒溫培養(yǎng)箱或20"C 25"C 的無菌環(huán)境中做細(xì)胞培養(yǎng)。
(5) 4—8小時(shí)后，解離的外套膜上皮細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)正常，上皮細(xì)胞占絕對優(yōu)勢， 在培養(yǎng)后的5 30h之間，在珍珠囊形成之前，用注射器將細(xì)胞液注入育珠貝體內(nèi)，然后將注 射后育珠貝在休養(yǎng)期7 20天后放入海水中吊養(yǎng)或在養(yǎng)殖池箱中喂養(yǎng)。
以上所述的采用的健康珠母貝是指珍珠養(yǎng)殖生產(chǎn)中主要的海產(chǎn)貝種，包括馬氏珠母貝、 解氏珠母貝、白蝶珠母貝、黑氏珠母貝、企鵝珍珠貝。
以上所述的提供外套膜上皮組織以及貝血清的珠母貝是同一種屬的海產(chǎn)貝，或者是不同 種屬的，只要是貝類血清就可以了。如果以從上述同時(shí)取外套膜上皮組織的珍珠貝取貝血清， 可以大大降低成本。
以上所述的注入育珠貝體內(nèi)的細(xì)胞液的量視貝體大小不同注入不同的量，以馬氏珠母貝 為例， 一般每ml細(xì)胞液注射10 15只貝。所得的培養(yǎng)細(xì)胞液可以注射到不同品種的珠母貝。
本發(fā)明上述海水無核珍珠培育養(yǎng)殖方法的原理是(1)采用經(jīng)初步培養(yǎng)的外套膜上皮細(xì)胞 懸液注射到育珠貝體內(nèi)，有助于外套膜上皮細(xì)胞盡快與珠母貝建立血液循環(huán)關(guān)系，加速珍珠 囊的形成，避免了由于目前尚無法精確地分離外套膜組織中的各類細(xì)胞，特別是外上皮細(xì)胞、 內(nèi)上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞三類細(xì)胞，因此在細(xì)胞培養(yǎng)中無法按比例在體外形成結(jié)構(gòu)完整的 珍珠囊的問題；(2)采用注射器將外套膜上皮細(xì)胞注射到育珠貝體內(nèi)，解決了器械直接挾持珠 核或直接挾持組織細(xì)胞植入過程對育珠貝及珍珠上皮細(xì)胞造成的傷害，對提高海水珍珠的成珠率是有幫助的。
本發(fā)明的有益效果在于
1、 被移植到育珠貝體內(nèi)的是解離了的外套膜上皮細(xì)胞，而不是珠母貝外套膜組織塊，也 不是在體外培育形成的珍珠囊；更區(qū)別于傳統(tǒng)的用器械直接挾持珠核插入的方法，植入的細(xì) 胞比組織塊更宜于在珠母貝體內(nèi)生長，較快較好地在體內(nèi)形成結(jié)構(gòu)完整的珍珠囊；也避免了 既往用外套膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體外珍珠囊實(shí)驗(yàn)中碰到的無法在體外建立結(jié)構(gòu)完整的珍珠囊的難題。
2、 成活率及成珠率高由于移植到育珠貝體內(nèi)的是生長狀況良好的外套膜上皮細(xì)胞懸混 液，比插入上皮組織片更迅速地與育珠貝建立血液循環(huán)關(guān)系，且采用注射的方法，對育珠貝 基本沒有造成損傷，也沒有對珍珠囊的損傷，故應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)成活率及成珠率高。既往
報(bào)道用外套膜上皮組織培養(yǎng)的珍珠囊插囊育珠成珠率只是4.05%,據(jù)我們觀察海水插片育無核 珠的成珠率只有25%左右，而用本發(fā)明技術(shù)成珠率在60%以上。
3、 適合于藥用珍珠貝類是低等的無脊椎動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)證明采用市售的通用的培養(yǎng)脊椎動(dòng) 物的培養(yǎng)基方案不能取得理想效果。本發(fā)明采用的貝類組織液及貝血清可以從取外套膜上皮 組織的同種珠貝中獲取，也可以從其他海水貝類中獲取，為無毒性物質(zhì)，適合于藥用。
4、 操作簡單，減少污染機(jī)會國內(nèi)養(yǎng)殖場普遍條件較差，手術(shù)過程很難做到無菌操作，
注射法比插入法操作方便，可以多點(diǎn)注射，操作人員易掌握，對珠貝損傷少，減少了感染機(jī)會。
5、 成本低供給外套膜上皮、貝組織液及貝血清的可以是同一貝體，節(jié)約了貝資源；另 外，可以在插入有核珍珠的珠貝中選取不同位置注入細(xì)胞液培養(yǎng)無核珍珠，可以增加珠農(nóng)的 收入。
6、 上述方法能夠提高珠母貝成活率及成珠率，培育過程與珠母貝生態(tài)接近，操作容易， 成本降低，便于在生產(chǎn)中推廣，社會效益及經(jīng)濟(jì)效益顯著。天然珍珠的價(jià)格歷來比黃金貴， 本發(fā)明在海水無核珍珠(主要為藥用)的生產(chǎn)中保證珍珠道地藥材的可持續(xù)利用提供了技術(shù) 支撐，對于弘揚(yáng)南珠文化，支持地方經(jīng)濟(jì)建設(shè)具有重要的意義。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。 采用自制天然培養(yǎng)液培養(yǎng)珍珠貝外套膜上皮細(xì)胞獲取海水藥用無核珍珠的試驗(yàn) 實(shí)施例1
(1)按比例秤取木瓜蛋白酶，溶解于三蒸水中配制成質(zhì)量含量0.5%的木瓜蛋白酶溶液，
混勻，采用板框過濾器過濾除菌，4'C備用。按常規(guī)方法取出l-2齡的健康馬氏珠母貝外套膜上皮組織，除去裙帶部分，凈化處理后切成盡可能細(xì)的小塊；置木瓜蛋白酶溶液中消化，溫 度為攝氏2(TC-25'C。
(2) 快速從上述提供外套膜上皮組織的珠母貝體中提取貝組織液及貝血清(從珍珠貝心
臟或大血管中取血，經(jīng)離心，取上清液即為珍珠貝血清)；配成比例為貝組織液貝血清
滅菌過濾海水=1 1.5: 0.5 1: 8的培養(yǎng)液，使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液中加入100IU/ml青霉素 1.5ml,0.1g/L鏈霉素1.5ml，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至6.6-7.4。
(3) 將上述自配的帶有貝血清的培養(yǎng)液加入胰蛋白消化溶液里終止消化，整個(gè)消化時(shí)間 為15-20min;并將含有經(jīng)消化的外套膜上皮組織的培養(yǎng)液置攝氏2(TC的恒溫培養(yǎng)箱或2(TC 25'C的無菌環(huán)境中做細(xì)胞培養(yǎng)。
(4) 在培養(yǎng)后的5 30h之間，在珍珠囊形成之前，用注射器將細(xì)胞液注入育珠貝體內(nèi)， 視貝體大小不同注入不同的量，以馬氏珠母貝為例， 一般每ml細(xì)胞液注射10 15只貝，同 一貝體可以只采取注射法接種外套膜上皮細(xì)胞，也可以在接受了有核珍珠插核手術(shù)的不同核 位接種外套膜上皮細(xì)胞懸液。
(5) 將注射后育珠貝放入海水中或在養(yǎng)殖池箱中休養(yǎng)，休養(yǎng)期一般7 20天，海水水溫 15 3(TC，海水比重1.018 1.024。休養(yǎng)期過后即可移入大海中按常規(guī)吊養(yǎng)，六個(gè)月后即 可開貝采珠。
實(shí)施例2
(1) 秤取胰蛋白酶溶解于50ml的三蒸水中配制成0.3M的胰蛋白酶溶液，混勻，微孔濾 膜密閉過濾除菌，4"備用；按常規(guī)方法取出l-2齡的健康黑氏珠母貝外套膜上皮組織，除去 裙帶部分，凈化處理后切成盡可能細(xì)的小塊；置胰蛋白酶溶液中消化，溫度為攝氏20°C-25 。C。
(2) 事先從同種珠母貝制備貝血清或從其他海水貝類制備貝血清于一20'C冰箱保存。使 用前置入4'C融化，盡快使用，使用之前無需水浴滅活處理?？焖購纳鲜鎏峁┩馓啄ど掀そM
織的珠母貝體中提取貝組織液及4'C融化的貝血清；配成比例為貝組織液貝血清滅菌
過濾海水=1 1.5:0.5 1:8的培養(yǎng)液,使用時(shí)每100ml溶液中加入100IU/ml青霉素2ml,0.1g/L 鏈霉素2ml，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至6.6-7.4。
(3) 將上述自配的帶有貝血清的培養(yǎng)液加入胰蛋白消化溶液里終止消化，整個(gè)消化時(shí)間 為15-20min;并將含有經(jīng)消化的外套膜上皮組織的培養(yǎng)液置攝氏2(TC的恒溫培養(yǎng)箱或20°C 25'C的無菌環(huán)境中做細(xì)胞培養(yǎng)。
(4) 在培養(yǎng)后的5 30h之間，在珍珠囊形成之前，用注射器將細(xì)胞液注入育珠貝體內(nèi)， 視貝體大小不同注入不同的量，以黑氏珠母貝為例， 一般每ml細(xì)胞液注射10 15只貝，同一貝體可以只采取注射法接種外套膜上皮細(xì)胞，也可以在接受了有核珍珠插核手術(shù)的不同核 位接種外套膜上皮細(xì)胞懸液。
(5)將注射后育珠貝放入海水中或在養(yǎng)殖池箱中休養(yǎng)，休養(yǎng)期一般7 20天，海水水溫: 15 30°C，海水比重1.018 1.024。休養(yǎng)期過后即可移入大海中按常規(guī)吊養(yǎng)，六個(gè)月后即 可開貝采珠。
權(quán)利要求
1、一種培育海水無核珍珠的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)首先按常規(guī)方法取出健康珠母貝外套膜上皮組織，除去裙帶部分，凈化處理后切成盡可能細(xì)的小塊，加入質(zhì)量含量0.1-0.8％蛋白酶溶液，在20-28℃的溫度下消化15～20min，然后加入帶有貝血清的培養(yǎng)液中止消化；(2)培養(yǎng)液的配制貝組織液∶貝血清∶滅菌過濾的天然海水＝1～1.5∶0.5～1∶8，使用時(shí)每100ml溶液中加入100IU/ml青霉素0.5-2ml，0.1g/L鏈霉素0.5-2ml，或者青霉素和鏈霉素的其中的一種，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)pH值至6.6-7.4；(4)將上述含有經(jīng)消化的外套膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液置20℃的恒溫培養(yǎng)箱或20℃～25℃的無菌環(huán)境中做細(xì)胞培養(yǎng)；(5)4-8小時(shí)后，解離的外套膜上皮細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)正常，上皮細(xì)胞占絕對優(yōu)勢，在培養(yǎng)后的5～30h之間，在珍珠囊形成之前，用注射器將細(xì)胞液注入育珠貝體內(nèi)，然后將注射后育珠貝在休養(yǎng)期7～20天后放入海水中吊養(yǎng)或在養(yǎng)殖池箱中喂養(yǎng)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育海水無核珍珠的方法，其特征在于所采用的健康珠母貝 是指珍珠養(yǎng)殖生產(chǎn)中主要的海產(chǎn)貝種，包括馬氏珠母貝、解氏珠母貝、白蝶珠母貝、黑氏 珠母貝、企鵝珍珠貝。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育海水無核珍珠的方法，其特征在于所述的提供外套膜上皮組織以及貝血清的珠母貝是同一種屬的海產(chǎn)貝，或者是不同種屬的海產(chǎn)貝。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育海水無核珍珠的方法，其特征在于所述的注入育珠貝體內(nèi)的細(xì)胞液的量視貝體大小不同注入不同的量。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育海水無核珍珠的方法，其特征在于所述的蛋白酶溶液是 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠蘿蛋白酶的商品酶，蛋白酶溶液的制備是按比例秤取蛋白酶，溶解于重蒸餾水或三蒸水中配制成質(zhì)量含量0.1-0.8%的蛋白酶溶液，混勻，過濾除菌，4'C備用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育海水無核珍珠的方法，其特征在于所述的帶有貝血清的培養(yǎng)液是從珍珠貝心臟或大血管中取出血液，經(jīng)離心，取上清液得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海水無核珍珠人工養(yǎng)殖方法，是取出健康珠母貝外套膜上皮組織，除去裙帶部分，將外套膜上皮組織用蛋白酶溶液消化，然后加入帶有貝血清的培養(yǎng)液中止消化，培養(yǎng)液中含貝組織液，適量的青霉素和鏈霉素，在無菌環(huán)境中培養(yǎng)5-30h后將細(xì)胞懸液注射入育珠貝體內(nèi)，休養(yǎng)期后放入海水中吊養(yǎng)或在養(yǎng)殖池箱中喂養(yǎng)。本發(fā)明對育珠貝損害少，成活率及成珠率高，適合于藥用，操作方便，成本低。
文檔編號A01K61/00GK101491228SQ20091011389
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者強(qiáng) 劉, 華 單, 銘 戴, 李中華, 輝 楊, 楊繼峰, 江 林, 海 林, 湧 林, 林其溪, 勤 王, 王乃平, 霖 甘, 鄧家剛, 陳明偉 申請人:廣西中醫(yī)學(xué)院;林 湧