專利名稱：一種來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是涉及一種利用紫莖澤蘭來(lái)制造抗煙草
花葉病毒的生物農(nóng)藥及其制備方法。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第二大類植物病害(趙善歡(主編).植物 化學(xué)保護(hù)(第三版)[M].北京農(nóng)業(yè)出版社，2000.)，世界各地的絕大部分作物都不同程度受 其危害，由于防治困難，素有"植物癌癥"之稱。據(jù)相關(guān)資料報(bào)道(吳拒文，陳建峰.植物源 農(nóng)藥及其安全性[J].植物保護(hù)，2002，28(4) :39-41.)，20世紀(jì)80年代初，僅美國(guó)每年因植 物病毒病造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)15 20億美元，而全世界每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失 更是高達(dá)200億美元左右。植物病毒種類繁多，分布廣泛，我國(guó)植物病毒病害在各省區(qū)都較 為普遍，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失，嚴(yán)重影響農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)發(fā)展。 煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)，病毒粒體為直桿狀，直徑18nm，長(zhǎng) 300nm ;粒體分子量為40X107，由外殼蛋白包圍著一個(gè)核糖核酸中心軸組成。每個(gè)粒體有 2130個(gè)蛋白亞基，以左旋螺旋排列成130圈。RNA為單分子線性、正鏈ssRNA，在距螺旋中心 4. Onm處以螺旋形式回旋于蛋白亞基中。TMV增殖的最適溫度為28-3(TC，溫度在37。C以上 時(shí)即停止增殖，其毒力和抗逆力均較強(qiáng)。粒體非常穩(wěn)定，稀釋限點(diǎn)為10-6-10-7，致死溫度 為90-93°C，體外保毒期達(dá)2個(gè)月以上。干燥葉片中病毒經(jīng)14(TC的高溫處理30分種才喪 失侵染力，在自然條件下經(jīng)52年仍有致病力。但在堿性條件下，病毒粒體即發(fā)生降解，從而 失去侵染力。TMV引起的花葉病是煙草、番茄等作物上十分重要的病害，世界各地發(fā)生普遍， 損失嚴(yán)重。如在煙草上自苗期至大田期可連續(xù)發(fā)生，幼苗被侵染后，新葉的葉脈顏色變淺， 成半透明的"明脈癥"，而后形成黃綠相間的花葉癥；苗期侵染的植株發(fā)育緩慢，幾乎沒(méi)有經(jīng) 濟(jì)價(jià)值。大田期植株發(fā)病，除顯示明脈、花葉癥狀外，病葉上會(huì)形成皰斑，厚薄不勻葉形也 會(huì)出現(xiàn)各種畸形，如葉緣反巻、皺縮扭曲，葉緣缺刻或成帶狀。 TMV主要靠病汁液接觸傳播，在農(nóng)事操作中沾染了病株汁液的手或工具通過(guò)接觸 煙苗的微傷口侵入。由于病毒的抗逆能力很強(qiáng)，混有病株殘?bào)w的肥料、種子、土壤和帶病的 其他寄主植物及野生植物，甚至烤過(guò)的煙葉、煙末都可以成為病害的初侵染來(lái)源。這些初侵 染源或移入大田的病苗，通過(guò)各種接觸媒介引起再侵染，使病害在田間擴(kuò)展蔓延。病害發(fā) 生與品種的抗病性有密切關(guān)系，在干旱少雨、氣溫偏高時(shí)發(fā)病重，晚栽的比適時(shí)早栽的發(fā)病 重，前茬或本茬套種馬鈴薯、番茄、油菜、蘿卜等地塊發(fā)病重(許志剛主編.普通植物病理學(xué) [M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997.)。 TMV寄主范圍非常廣，其寄主有33科236種，除侵染煙草 外，還危害番茄、馬鈴薯、茄子、辣椒、菠菜、地黃和油菜等作物，人工接種可侵染十字花科、 覓科、茄科、菊科、豆科等36科，350余種物。 當(dāng)今植物病毒病的防治主要是依靠化學(xué)制劑，雖然具有一定的控制作用，但容易 產(chǎn)生藥害和抗藥性，嚴(yán)重影響抗植物病毒制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。隨著生活水平的提高、 環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，植物源農(nóng)藥的研究與開(kāi)發(fā)廣泛受到人們重視。我國(guó)地域遼闊，植物資源豐富，因而在我國(guó)進(jìn)行植物源生物農(nóng)藥的研制具有明顯的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。植物源活 性物質(zhì)易降解，造成環(huán)境污染和毒性殘留問(wèn)題較小，因此，充分利用豐富的植物資源，研究 開(kāi)發(fā)高效、無(wú)毒或低毒、廣譜的抗植物病毒劑和真菌抑制劑具有重要的意義。
植物源抗病毒劑的開(kāi)發(fā)研究始于20世紀(jì)初，1913年ALLARD首次發(fā)現(xiàn)TMV侵染商 陸(Phytolaccacea)后，不能用它的汁液摩擦接種到煙葉上，其后又發(fā)現(xiàn)CMV侵染商陸后不 能接種到黃瓜上(候玉霞，李重九，馬力新.中草藥中抗植物病毒TMV活性物質(zhì)PZ1作用機(jī) 理研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 5(1) ;21-24.)。 1925年DUGGER發(fā)現(xiàn)商陸中有一種抗病 毒物質(zhì)，用它來(lái)處理TMV或黃瓜花葉病毒(Cucumber MosaicVirus， CMV)，就能使病毒失去
對(duì)非商陸寄主的侵染力，由此引發(fā)了對(duì)病毒浸染活性抑制的一系列研究，并將植物病毒病 的防控引向了生物防治的軌道。到1988年已發(fā)現(xiàn)180多種被子植物具有強(qiáng)烈的抑制植物 病毒侵染作用，它們主要分布于商陸科、藜科、莧科、紫茉莉科等植物中(邱并生，王敏.植 物病毒學(xué)研究進(jìn)展.中國(guó)病毒學(xué)，2004，19(3) :309-312) ，20世紀(jì)90年代以來(lái)又不斷有新 的發(fā)現(xiàn)。我國(guó)科研工作者已從500余種中草藥中篩選出近30種對(duì)植物病毒病有明顯治療 和保護(hù)作用的品種。 紫莖澤蘭(Eupatorium adenophrum)又名飛機(jī)草，屬菊科澤蘭屬，原產(chǎn)于美洲的墨 西哥至哥斯達(dá)黎加一帶，現(xiàn)已廣泛分布于亞、澳、美大陸和加列那等群島的70多個(gè)國(guó)家，成 為危害嚴(yán)重的世界性惡性雜草。紫莖澤蘭大約在20世紀(jì)40年代由中緬邊境傳入我國(guó)云 南南部，目前在云南、貴州、廣西、四川、西藏、臺(tái)灣、重慶等7個(gè)省(市、區(qū))的108個(gè)縣、市 (區(qū))發(fā)生并造成嚴(yán)重危害，是國(guó)家環(huán)保局公布的我國(guó)首批16種外來(lái)入侵性有害生物之一， 其入侵性位居前列(候太平，劉世貴.有毒植物紫莖澤蘭研究進(jìn)展[J].國(guó)外畜牧學(xué)-草原 與牧草，1999， (4) :8.)。 由于紫莖澤蘭具有廣泛的適應(yīng)性、適生性、競(jìng)爭(zhēng)性、抗逆性和毒害性，因此對(duì)農(nóng)業(yè)、 林業(yè)和畜牧業(yè)及生態(tài)環(huán)境造成了極大的危害。紫莖澤蘭在入侵耕地、輪歇地后造成耕作困 難，成本加大，入侵田邊地埂與莊稼爭(zhēng)水、爭(zhēng)肥、爭(zhēng)陽(yáng)光，造成糧食減產(chǎn)；入侵林地后，導(dǎo)致更 新造林保存率明顯下降，影響苗木生長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)林推遲投產(chǎn)；侵占草場(chǎng)后，造成牧草嚴(yán)重減產(chǎn)， 載畜量下降，天然草地失去放牧利用價(jià)值，給畜牧業(yè)發(fā)展造成了極大的阻礙。目前人們主要
采取人工防除、植被替代、化學(xué)防除、昆蟲控制、病原菌防除等幾種方法對(duì)紫莖澤蘭進(jìn)行治 理。同時(shí)也積極地尋求方法對(duì)紫莖澤蘭進(jìn)行利用，現(xiàn)階段已經(jīng)運(yùn)用紫莖澤蘭成功研制了殺 蟲劑，制作染料，生產(chǎn)人造板、精油、白僵菌等。 而隨著對(duì)植物源生物農(nóng)藥的不斷研究與開(kāi)發(fā)，又為紫莖澤蘭的利用提供了新的思 路。由于該外來(lái)入侵生物的抗逆性強(qiáng)，體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，因此可以考慮利用其活 性物質(zhì)來(lái)開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥而防治我國(guó)主要的病毒病。目前，已有關(guān)于此方面的初步研究(傅 軍，宋啟示，方綺軍.紫莖澤蘭化學(xué)成分及其生物學(xué)活性研究進(jìn)展.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1999,14(4) :411-414.)，對(duì)生長(zhǎng)紫莖澤蘭的土壤所作的抑菌分析表明它對(duì)土壤中細(xì)菌類
抑制作用最大，真菌次之，這表明紫莖澤蘭中確實(shí)存在生物活性物質(zhì)；另?yè)?jù)報(bào)道(李麗，尹 芳.張無(wú)敵.紫莖澤蘭不同水提物抑制植物病原菌的研究.農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2008(4): 22-23.)，利用紫莖澤蘭提取物來(lái)防治病蟲害也具有較好的殺毒作用；戴元寧等用紫莖澤蘭 為原料開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥，已完成小試和中試(戴元寧，紫莖澤蘭生物農(nóng)藥的制造，2003)。實(shí)際 應(yīng)用中，有關(guān)利用紫莖澤蘭提取物來(lái)抑制植物病原菌的報(bào)道還比較少，張培花等利用紫莖
4澤蘭汁液及其萃取物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用進(jìn)行了研究；云南師范大學(xué)云南省農(nóng)村 能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭提取液對(duì)某些植物病原菌具有很好的抑制效果；田 宇等發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭揮發(fā)油提取液在濃度為3000mg/kg時(shí)對(duì)4種真菌的抑制率均大于60%， 其中對(duì)番茄灰霉菌抑制作用最強(qiáng)，其EC50值為580. 15mg/kg(田宇，何蘭，曹坳程.紫莖澤 蘭揮發(fā)性成分及抑菌活性研究.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，9(2) :137-142.)。但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn) 有關(guān)紫莖澤蘭提取物抗植物病毒活性研究的報(bào)道，因此有必要利用紫莖澤蘭不同有機(jī)相提 取物對(duì)植物病毒進(jìn)行更加深入的探究，研發(fā)出新型的抗病毒制劑，為豐富植物源的生防制 劑品種，綜合開(kāi)發(fā)利用紫莖澤蘭提供重要的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決已有傳統(tǒng)化學(xué)試劑農(nóng)藥在防治植物病毒時(shí)會(huì)對(duì)環(huán)境造 成破環(huán)，且農(nóng)藥本身不易降解；而現(xiàn)有的一些植物來(lái)源的生物農(nóng)藥本身并不是一些入侵性 的植物，對(duì)環(huán)境和農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)并未有嚴(yán)重威脅，應(yīng)用價(jià)值意義不大的缺陷，提供一種利用侵 入性植物紫莖澤蘭來(lái)制作的生物農(nóng)藥及其制備方法。 實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明的技術(shù)方案為，一種來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，該農(nóng) 藥是將紫莖澤蘭粉末通過(guò)有機(jī)溶劑浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容后得到的提取物，該提取物是質(zhì)量 濃度為lg/ml。 對(duì)紫莖澤蘭粉末浸提采用的有機(jī)溶劑可以是乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇、丙酮、氯仿或二氯甲烷。 該紫莖澤蘭的提取物用水稀釋后可以用于防治煙草花葉病毒，用水稀釋的濃度以 2倍為最佳。 本發(fā)明的技術(shù)方案還包括一種來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，該生 物農(nóng)藥按以下步驟制備， (1)紫莖澤蘭鮮葉經(jīng)陰干，烘至恒重，粉碎為粉末； (2)在紫莖澤蘭粉末中按體積比為1 : 10加入有機(jī)溶劑后超聲波浸提得到濾液；
(3)將步驟(2)得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為膏狀物提取物； (4)將(3)步的膏狀提取物定容得到質(zhì)量濃度為lg/ml的紫莖澤蘭提取物。 上述步驟(1)中的紫莖澤蘭粉末是40目。 上述步驟(2)中的浸提次數(shù)為3次，每次浸提時(shí)間是30分鐘。 上述步驟(2)中浸提有機(jī)溶劑可以采用乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁
醇、丙酮、氯仿或二氯甲烷，其中，經(jīng)過(guò)乙醇浸提后得到的紫莖澤蘭提取物防治煙草花葉病
毒的效果最佳。 本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)，利用本發(fā)明所述的來(lái)源于紫莖澤蘭來(lái)源的生物 農(nóng)藥，對(duì)煙草花葉病毒枯斑寄主抑制率高，易重復(fù)。本發(fā)明所述農(nóng)藥的實(shí)施中，對(duì)煙草花葉 病毒系統(tǒng)寄主進(jìn)行了抗病毒活性試驗(yàn)和田間小試以及抗病機(jī)理分析，證明該來(lái)源生物農(nóng)藥 可成功的進(jìn)行對(duì)煙草花葉病毒的防治，本發(fā)明所述來(lái)源紫莖澤蘭的生物農(nóng)藥，制備方法簡(jiǎn) 單，生產(chǎn)成本低，無(wú)任何毒害污染。



具體實(shí)施例方式圖1是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化前的結(jié)構(gòu)照片圖；
圖2是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化30min的結(jié)構(gòu)照片圖；
圖3是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化60min的結(jié)構(gòu)照片圖；
圖4是紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化90min的結(jié)構(gòu)照片圖；
下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行具體描述，(1)來(lái)源紫莖澤蘭生物農(nóng)藥的制備過(guò)程， 紫莖澤蘭鮮葉陰干處理后，6(TC烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40目篩，得到的粉末于4t: 保存?zhèn)溆?。?0g紫莖澤蘭粉末加入10倍體積(100ml)的供試有機(jī)試劑，實(shí)驗(yàn)中分別采 用了乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、氯仿和二氯甲烷9種有機(jī)試劑分 別實(shí)驗(yàn)，超聲波提取30min，之后用循環(huán)式真空泵進(jìn)行抽濾，收集濾液，然后再向?yàn)V渣中注 入100ml有機(jī)溶劑，進(jìn)行第二次提取，超聲波浸提30min后抽濾，收集濾液，按照同樣的方 法共提取三次，之后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸發(fā)掉得到膏狀物，再將其定容到 10ml，即得到質(zhì)量濃度為lg/ml的紫莖澤蘭提取物，保存于4t:備用。(2)紫莖澤蘭提取物
抗病毒活性測(cè)定，利用半葉枯斑法進(jìn)行紫莖澤蘭提取物抗病毒活性測(cè)定，具體操作如下選 取生長(zhǎng)一致，6-8葉期的三生煙，用濕潤(rùn)的紗布包裹住葉柄位置，用喉頭噴霧器對(duì)準(zhǔn)葉脈中 央噴灑200目金剛砂，之后左半葉接種處理液，右半葉接種對(duì)照液，每個(gè)處理作10個(gè)重復(fù)，3 天后待枯斑顏色和數(shù)目穩(wěn)定后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)目，計(jì)算抑制率。其中病毒粗提液是將TMV病葉 加10倍體積PBS緩沖液研磨過(guò)濾制得，而處理液是將病毒粗提液與不同稀釋倍數(shù)的紫莖澤 蘭提取液混合配成，以清水代替紫莖澤蘭提取液作為對(duì)照。抑制率=(對(duì)照半葉枯斑數(shù)-處 理半葉枯斑數(shù))/對(duì)照半葉枯斑數(shù)X100% 具體不同有機(jī)溶劑的提取結(jié)果對(duì)抑制率的影響如下表 由上表可以看出，在供試濃度為O. 5g/ml時(shí)，紫莖澤蘭各有機(jī)相提取物對(duì)TMV病毒 均表現(xiàn)出一定的鈍化作用，乙醇、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和氯仿提取液抑制率在50%以上， 其它石油醚、丙酮、甲醇和二氯甲烷等四種提取物的抑制率在50%以下。其中效果最弱的 是丙酮提取物，抑制率為35. 7% ;而鈍化效果最好的是乙醇提取物，抑制率達(dá)到了 92. 8%。 因此，紫莖澤蘭來(lái)源抗煙草花葉病毒生物農(nóng)藥最佳劑型為乙醇且其可有效在體外對(duì)煙草花
葉病毒進(jìn)行鈍化。
提取試劑接種葉數(shù)處理半葉平均枯斑數(shù)對(duì)照半葉平均枯斑數(shù)抑制率
乙醇1081121692.8%
石油醚10591104443.3%
乙醚1025755653.8%
乙酸乙酯1043691852.5%
丙酮1046672535.7%
正丁醇1025588171.1%
甲醇1047977638.3%
氯仿1021764266.2%
二氯甲垸1028544736.2%
6
對(duì)來(lái)源紫莖澤蘭生物農(nóng)藥的抗煙草花葉病毒有效性進(jìn)行驗(yàn)證
2. 1紫莖澤蘭提取物對(duì)系統(tǒng)寄主的預(yù)防效果試驗(yàn)
2. 1. 1方法 選取生長(zhǎng)健壯的TMV系統(tǒng)寄主普通煙植株，噴灑不同濃度的紫莖澤蘭乙醇提取液 進(jìn)行第一次處理，5天后噴灑藥劑進(jìn)行第二次處理，再過(guò)5天進(jìn)行第三次處理，3次處理后的 第2天接種TMV病毒，3周后調(diào)查病級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和防效。 病情指數(shù)二E [(各級(jí)病葉數(shù)X相對(duì)級(jí)數(shù)值)]/(調(diào)查總?cè)~數(shù)X9) X100%
防治效果(％ ) = (CK 0_ptl)/CK0X100% CKO:空白對(duì)照藥后病情指數(shù)










Ptl :藥劑處理藥后病情指數(shù) 2. 1.2結(jié)果
稀釋倍數(shù)
1
病情指數(shù)
2
平均預(yù)防效果
3
2倍 5倍 10倍 CK
預(yù)防效果 1 2 3
39.77 38.01 33.33 33.98% 31.58% 42.31% 35.96% 43.86 37.22 37.22 27.18% 33.00% 35.58% 31.92% 46.20 40.35 42.78 23.30% 27.37% 25.96% 25.54% 60. 23 55. 56 57. 78 _— —— —— ——
2. 2紫莖澤蘭提取物對(duì)系統(tǒng)寄主的治療效果試驗(yàn) 2. 2. 1方法
選取生長(zhǎng)健壯的TMV系統(tǒng)寄主普通煙植株，接種TMV病毒，第二天噴灑不同濃度的 紫莖澤蘭乙醇提取液作為第一次處理，5天后噴灑藥劑進(jìn)行第二次處理，再過(guò)5天進(jìn)行第三 次處理，3周后調(diào)查病級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)和防效。
2. 2. 2結(jié)果 稀釋倍數(shù) 病情指數(shù) 治療效果 平均治療效果
1231 2 3
43.21 39.18 35.80 31.37% 31.01% 38.30% 33.56% 47.53 40.35 38.01 24.51% 28.95% 34.49% 29.32% 48.77 43.82 42.78 22.55% 22.83% 26.28% 23.89% 62. 96 56. 79 58. 02—— —— —— ——
綜合以上對(duì)系統(tǒng)寄主的治療和預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果，可見(jiàn)在適宜的條件下施用紫莖澤蘭 可以達(dá)到35. 96%的防效。這樣的防效的確比國(guó)內(nèi)報(bào)導(dǎo)的商品抗病毒藥劑都低，但是商品抗 病毒藥劑的防治效果大多是大田應(yīng)用數(shù)據(jù)，并且藥劑經(jīng)過(guò)復(fù)配，存在多種成分。大田施用， 因?yàn)榻臃N不均一或無(wú)人為接種等原因，會(huì)導(dǎo)致藥劑防治效果偏高。而最為一種新的植物源 抗TMV制劑，其在溫室接種TMV條件下能達(dá)到35. 96%的防治效果，應(yīng)該說(shuō)是一種十分有希 望的抗TMV藥齊U，在今后的大田施用中將可能會(huì)有很高的應(yīng)用價(jià)值。
2. 3紫莖澤蘭提取物對(duì)煙草花葉病毒病的大田防病試驗(yàn)
2. 3. 1方法 在田間選取生長(zhǎng)健壯的TMV寄主番茄若干株，噴灑不同濃度紫莖澤蘭乙醇提取物 進(jìn)行處理，每隔5天噴灑一次，共處理4次，以不噴灑藥劑的的作為對(duì)照，最后一次噴灑后待




2倍 5倍 10倍 CK其在田間自然發(fā)病，調(diào)查病級(jí)計(jì)算病情指數(shù)和防效c





2. 3. 2結(jié)果
植株數(shù)0 2倍 0 5倍 0 10倍 0 CK 0
1 7 6 4
2
3 5
4 4 3
5 3 3 5 3
7
0
1
2 5
9
0
1 0 2
病情指數(shù)
27. 41
36. 30
40. 74 58. 52
防效 53. 16% 37. 97% 30. 38%
由上表可以看出，紫莖澤蘭乙醇提取物對(duì)TMV番茄大田防效隨著提取液濃度的增 大而增強(qiáng)，將提取液進(jìn)行10倍稀釋時(shí)，防效為30. 38% ;5倍稀釋時(shí)，防效為37. 97% ;2倍稀 釋時(shí)，防效可達(dá)53. 16%，可見(jiàn)紫莖澤蘭乙醇提取物的大田實(shí)施效果較好。
此試驗(yàn)結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物大田實(shí)施效果要好于溫室對(duì)系統(tǒng)寄主的防效， 這也與之前的預(yù)測(cè)結(jié)果一致，可能由于田間無(wú)人為接種而是待其自然發(fā)病的原因，導(dǎo)致藥 劑防治效果比溫室對(duì)系統(tǒng)寄主的防效偏高，這一結(jié)果也為繼續(xù)利用紫莖澤蘭來(lái)源的生物農(nóng) 藥提供了一種新的可能。 2. 4紫莖澤蘭提取物對(duì)煙草花葉病毒粒子形態(tài)的影響
2. 4. 1方法 取已稀釋的提純病毒滴于parafilm上，將鋪有Formar膜的銅網(wǎng)倒置在液滴上，吸 附5min后用濾紙吸去多余液體，雙蒸水洗滌；銅網(wǎng)(有膜的一面向上)用2%磷鎢酸(PTA) 負(fù)染3-5min，吸去多余溶液。待銅網(wǎng)干燥后立即置JEM-1200EX型透射電鏡下觀察病毒粒體 形態(tài)。 其中紫莖澤蘭提取物與TMV病毒鈍化時(shí)間進(jìn)行一個(gè)梯度試驗(yàn)，鈍化時(shí)間分別為 30min、60min、90min。
2. 4. 2結(jié)果 如圖1、圖2、圖3和圖4所示，經(jīng)紫莖澤蘭乙醇提取物處理后，TMV病毒粒子受到
一定程度破壞，粒體明顯變短，有解聚現(xiàn)象，且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)作用效果越明顯。這可能是
破壞了某些化學(xué)鍵，從而影響了 TMV病毒粒子對(duì)寄主的侵入和病毒的復(fù)制。 2. 5紫莖澤蘭提取液對(duì)病毒外殼蛋白的影響 2. 5. 1紫莖澤蘭提取物對(duì)病毒外殼蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)的影響 2. 5. 1. 2方法 提純TMV粒體與紫莖澤蘭提取液混合作為抗原，將TMV病毒與等體積蒸餾水混合 作為陽(yáng)性對(duì)照，將紫莖澤蘭提取液與等體積蒸餾水混合作為陰性對(duì)照，以ELISA法測(cè)定紫 莖澤蘭提取物對(duì)TMV外殼蛋白抗原位點(diǎn)的影響
2. 5. 1. 2結(jié)果 ELISA法測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照與處理0D405值之比均大于2，結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物 對(duì)TMV外殼蛋白抗原位點(diǎn)有明顯作用，可能影響其抗原簇，使TMV抗體與抗原之間的反應(yīng)受 阻。 2. 5. 2紫莖澤蘭提取物對(duì)病毒外殼蛋白體外脫衣殼作用的影響 提純TMV與紫莖澤蘭提取液混合經(jīng)RNase處理后，用半葉枯斑法接種，結(jié)果表明，
RNase處理后TMV的侵染率為65. 54% ，枯斑抑制率為34. 46% ，表明紫莖澤蘭提取液對(duì)TMV的外殼蛋白具有明顯的破壞作用，使TMV的RNA暴露而被降解。
2. 5. 3紫莖澤蘭提取物對(duì)病毒外殼蛋白體外聚合作用的影響
2. 5. 3. 1方法 將外殼蛋白用磷酸鉀緩沖液配成相應(yīng)濃度，將紫莖澤蘭提取液加入到外殼蛋白溶 液中，以等濃度的病毒外殼蛋白溶液作對(duì)照，在UV-1600紫外分光光度計(jì)下測(cè)定320nm處的 OD值，在10°C _401:之間，每隔51:測(cè)定一次00320值
2. 5. 3. 2結(jié)果 結(jié)果表明，隨著溫度的升高，對(duì)照組TMV外殼蛋白在320nm下的吸光值逐漸升高， 體外聚合作用明顯，而在紫莖澤蘭提取物處理后，隨著溫度的升高，TMV-CP吸光值雖有升 高，但幅度沒(méi)有對(duì)照明顯，由此可見(jiàn)，紫莖澤蘭提取物對(duì)TMV-CP的體外聚合作用可能具有 一定程度的影響。 2.6.紫莖澤蘭提取物對(duì)病毒復(fù)制過(guò)程的影響
2. 6. 1不同濃度提取物抑制病毒增殖作用測(cè)定
2. 6. 1. 1方法 在健康的普通煙上接種病毒24h后，用打孔器從葉肉部分打取直徑為12mm的圓 片，分別飄浮于lg/ml，0. 5g/ml，0. 25g/ml，0. 125g/ml，4個(gè)濃度提取物和蒸餾水中作為處 理和對(duì)照，同時(shí)設(shè)置健康葉圓片飄浮于蒸餾水中作陰性對(duì)照，48h后用抽提緩沖液研磨葉圓 片，以ELI SA法測(cè)定0D405值，計(jì)算抑制率
2. 6.1.2結(jié)果 以葉碟法測(cè)定不同濃度紫莖澤蘭提取物對(duì)TMV增殖的抑制作用，結(jié)果表明，紫莖 澤蘭提取物對(duì)TMV在系統(tǒng)侵染普通煙體內(nèi)的增殖有很強(qiáng)的抑制活性，濃度為lg/ml時(shí)，紫莖 澤蘭提取物對(duì)TMV增殖的抑制率達(dá)到100% ，與抑制TMV侵染枯斑寄主三生煙一樣，紫莖澤 蘭提取物對(duì)TMV增殖的抑制作用也呈現(xiàn)明顯的劑量_效應(yīng)相關(guān)性，濃度越低，抑制活性越 弱。 2. 6. 2接種病毒不同時(shí)間后提取物抑制病毒增殖作用測(cè)定
2. 6. 2. 1方法 在普通煙上接種病毒12h，24h，36h和48h后，用打孔器從葉肉部分打取直徑為 12mm的圓片，分別用紫莖澤蘭提取物和蒸餾水作為處理和陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置健康葉圓片 飄浮于蒸餾水中作陰性對(duì)照，48h后用抽提緩沖液研磨葉圓片，以ELISA法測(cè)定0D4。5值，計(jì) 算抑制率 2. 6. 2. 2結(jié)果 在接種病毒12h，24h，36h和48h后的抗病毒作用測(cè)定結(jié)果表明，紫莖澤蘭提取物 在接種病毒后12_36h以內(nèi)處理對(duì)病毒增殖均有明顯的抑制作用，抑制率都在70%以上，隨 著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取物對(duì)病毒增殖的抑制作用逐漸下降，在接種48小時(shí)之后處理，提取物 對(duì)病毒增殖的抑制率僅為56%。由此可見(jiàn)，紫莖澤蘭提取物可能主要作用于病毒增殖的早 期階段，對(duì)病毒增殖后期抑制效果則不理想。
上述技術(shù)方案僅體現(xiàn)了本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)其 中某些部分所可能做出的一些變動(dòng)均體現(xiàn)了本發(fā)明的原理，屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
一種來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于該農(nóng)藥是將紫莖澤蘭粉末通過(guò)有機(jī)溶劑浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容后得到的提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，將紫莖澤蘭 粉末中加入有機(jī)溶劑后浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的膏狀物進(jìn)行定容為質(zhì)量濃度是lg/ml液體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，對(duì)紫莖澤蘭 粉末浸提采用的有機(jī)溶劑可以是乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、氯仿或 二氯甲烷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，該紫莖澤蘭 的提取物用水稀釋后可以用于防治煙草花葉病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，其特征在于，用于防治煙 草花葉病毒的紫莖澤蘭提取物用水稀釋的濃度以2倍為最佳。
6. —種來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于，該生物農(nóng)藥按以下 步驟制備，(1) 紫莖澤蘭鮮葉經(jīng)陰干，烘至恒重，粉碎為粉末；(2) 在紫莖澤蘭粉末中按體積比為1 : 10加入有機(jī)溶劑后浸提得到濾液；(3) 將步驟(2)得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為膏狀物提取物；(4) 將(3)步的膏狀提取物定容得到質(zhì)量濃度為lg/ml的紫莖澤蘭提取物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于， 步驟(1)中的紫莖澤蘭粉末是40目。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于， 步驟(2)中的浸提次數(shù)為3次，每次浸提時(shí)間是30分鐘。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于， 步驟(2)中浸提有機(jī)溶劑可以采用乙醇、石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、氯仿 或二氯甲烷，其中，經(jīng)過(guò)乙醇浸提后得到的紫莖澤蘭提取物防治煙草花葉病毒的效果最佳。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源紫莖澤蘭的抗病毒生物農(nóng)藥，該農(nóng)藥是將紫莖澤蘭粉末通過(guò)有機(jī)溶劑浸提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、定容后得到的提取物，該提取物的質(zhì)量濃度為1g/ml，該生物農(nóng)藥按以下步驟制備，(1)紫莖澤蘭鮮葉經(jīng)陰干，烘至恒重，粉碎為粉末；(2)在紫莖澤蘭粉末中按體積比為1∶10加入有機(jī)溶劑后浸提得到濾液；(3)將步驟(2)得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為膏狀物提取物；(4)將(3)步的膏狀提取物定容得到質(zhì)量濃度為1g/ml的紫莖澤蘭提取物。本發(fā)明的技術(shù)方案解決已有傳統(tǒng)化學(xué)試劑農(nóng)藥在防治植物病毒時(shí)會(huì)對(duì)環(huán)境造成破環(huán)的缺陷，且制備方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，無(wú)任何毒害污染。
文檔編號(hào)A01N65/12GK101790996SQ20091023787
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月12日
發(fā)明者張妙直, 曹坳成, 謝響明 申請(qǐng)人:謝響明