專利名稱：用于改善植物的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備具有改善的生物量和/或種子產(chǎn)量和/或應(yīng)激耐受性的植物 的組合物和方法。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的增長，農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)是改善農(nóng)作物和飼料植物品種的生物
量產(chǎn)量和種子產(chǎn)量。直到現(xiàn)在這樣的改善依賴于為了所需特性選擇性地培育植物。但是對于許多植 物，后代中產(chǎn)生的雜種遺傳互補體不產(chǎn)生與其親代相同的所需性狀，因此限制了選擇性培 育方法的效果。現(xiàn)在分子生物學(xué)的進(jìn)步使得遺傳操作植物和動物的種質(zhì)成為可能。植物的遺傳工 程化包括分離和操作遺傳材料，隨后將這樣的材料引入植物中。該技術(shù)已經(jīng)開發(fā)了能夠表 達(dá)藥物和其它化學(xué)品的植物、具有增加害蟲抗性、增加應(yīng)激耐受性的植物和表達(dá)其它有益 性狀的植物。本領(lǐng)域中已知某些生長因子可以應(yīng)用于增加的植物大小，這樣的生長因子的應(yīng)用 是昂貴和耗時的。因此，存在相對于植物種植的對應(yīng)物而言具有增加生物量的植物的需求。植物農(nóng)作物植物谷粒產(chǎn)量的改善可以通過研發(fā)相對于同等野生型植物產(chǎn)生更多 種子或谷粒的植物而實現(xiàn)。因此，存在相對于植物正常種植對應(yīng)物而言具有增加種子產(chǎn)量的植物的需求。環(huán)境無生命應(yīng)激，包括干旱應(yīng)激、寒冷應(yīng)激、冰凍應(yīng)激、熱應(yīng)激和鹽分應(yīng)激是限制 植物生長和繁殖力的主要因素。由這樣的應(yīng)激造成的主要農(nóng)作物包括玉米、小麥和稻米的 生物量的農(nóng)作物損失和減少代表了重要的經(jīng)濟(jì)問題，還導(dǎo)致幾個不發(fā)達(dá)國家的食品短缺。研發(fā)應(yīng)激耐受植物具有減少或解決至少一些這些問題的潛力。使用傳統(tǒng)植物培育 策略以產(chǎn)生顯示對這些類型應(yīng)激耐受的植物新系是緩慢的。缺少足夠的種質(zhì)來源和遠(yuǎn)緣植 物物種之間的不相容性代表了常規(guī)培育中的重要問題。另外，引起對這樣應(yīng)激耐受的細(xì)胞 過程是復(fù)雜的且包括多個細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制和許多代謝途徑。這限制了傳統(tǒng)培育和遺傳工程方 法研發(fā)應(yīng)激耐受植物的成功。鑒別涉及控制引起應(yīng)激耐受的復(fù)雜過程的基因和蛋白質(zhì)將是 有益的。涉及控制應(yīng)激耐受的基因表達(dá)調(diào)節(jié)子如轉(zhuǎn)錄因子在植物遺傳工程中特別有用，因 為單個基因可以控制基因的整個級聯(lián)，引起耐受表型。另外，有時在上面提到的不同類型應(yīng) 激耐受反應(yīng)的許多方面中有共同性。例如，增加對寒冷或鹽分耐受的基因還可以改善干旱 應(yīng)激耐受性。這已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄因子At CBF/DREB 1 (Kasuga等人，1999 Nature Biotech 17: 287-91)和液泡焦磷酸酶AVPl (feixiola等人，2001 PNAS 98:11444-19)的情況中得到證 實。雖然已經(jīng)鑒別了一些潛在有用的基因，給予對應(yīng)激耐受的植物基因的鑒別和克隆 仍然是片段化的和不完整的。雖然假定應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)在應(yīng)激耐受中有作用，仍然缺乏證據(jù)，且許多這樣的應(yīng)激反應(yīng)性基因的功能是未知的。鑒別應(yīng)激敏感性植物物種中具有給予應(yīng)激耐受能力的基因?qū)⑹怯幸娴?。?yīng)激耐受 農(nóng)作物的研發(fā)將提供許多優(yōu)勢如增加生物量和產(chǎn)生可以在先前不適的環(huán)境條件中種植的 植物。因此，存在用于產(chǎn)生相對于種植對應(yīng)物而言具有改善應(yīng)激耐受的植物的組合物和方 法的需求。本發(fā)明的目標(biāo)是提供為了研發(fā)具有至少一種下列性狀的植物品種的改善的組合 物和/或方法i)改變的生物量，ii)改變的種子產(chǎn)量，和iii)改變的對至少一種下列應(yīng)激的耐受性干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽分，或至少 給公眾提供有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
編碼多肽的多核苷酸在一個方面，本發(fā)明提供了編碼具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其變體的分離的 多核苷酸，其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中至少一種下列性狀的多肽i)生物量，ii)種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)生物量和種子產(chǎn)量。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)生物量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)生物量、種子產(chǎn)量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其變體的分離 的多核苷酸，其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中生物量的多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其變體的分離 的多核苷酸，其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中種植產(chǎn)量的多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其變體的分離 的多核苷酸，其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán) 境應(yīng)激的耐受性的多肽。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)至少兩種，優(yōu)選至少三種，更優(yōu)選至少四種和最優(yōu)選所有五種 所述的環(huán)境應(yīng)激。在上面三個方面每個的一個具體實施方案中，分離的多核苷酸編碼具有與序列 SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。在另一個具體實施方案中，多肽含有A20型鋅指結(jié)構(gòu)域和ANl型鋅指結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域在多肽的N末端一半中。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域在多肽的C末端一半中。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意
氨基酸。優(yōu)選Am 型結(jié)構(gòu)域具有通式C-X2-C-X (9-12)-C-X (1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選A20結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 16組成。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :19。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID N0:19。優(yōu)選Am型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 18組成。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸編碼具有序列SEQ ID NO 1的多肽。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有具有與SEQ ID NO 7的編碼序列 至少70%同一性的序列。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有SEQ ID NO 7的編碼序列。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO 7的編碼序列雜交的序列。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有SEQ ID NO 7的編碼序列。多核苷酸在另一個方面本發(fā)明提供了含有序列SEQ ID NO 7或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體編碼能夠調(diào)節(jié)植物中至少一種以下性狀的多肽i)生物量，ii)種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。優(yōu)選肽能夠調(diào)節(jié)生物量和種子產(chǎn)量。優(yōu)選肽能夠調(diào)節(jié)生物量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性。優(yōu)選肽能夠調(diào)節(jié)生物量、種子產(chǎn)量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性。在另一個方面，本發(fā)明提供了含有序列SEQ ID NO :7或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體編碼能夠調(diào)節(jié)植物中生物量的多肽。在另一個方面本發(fā)明提供了含有序列SEQ ID NO 7或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體編碼能夠調(diào)節(jié)植物中種子產(chǎn)量的多肽。在另一個方面本發(fā)明提供了含有序列SEQ ID NO 7或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體編碼能夠調(diào)節(jié)植物中對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激的耐受 性的多肽。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)至少兩種，通常至少三種，更優(yōu)選至少四種和最優(yōu)選所有五種 所述的環(huán)境應(yīng)激。在上面三個方面每個的一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有具有與SEQ ID NO 7的編碼序列至少70%同一性的序列。在另一個具體實施方案中，多肽含有A20型鋅指結(jié)構(gòu)域和ANl型鋅指結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域在多肽的N末端一半中。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域在多肽的C末端一半中。
優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意
氨基酸。優(yōu)選Am 型結(jié)構(gòu)域具有通式C-X2-C-X(9-12)-C-X(l-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)體含有序列SEQ ID N0:17。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 16組成。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :19。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :19。優(yōu)選Am型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 18組成。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO 7的編碼序列雜交的序列。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸含有SEQ ID NO 7的編碼序列。多月太在另一個方面本發(fā)明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中至少一種以下性狀的多肽i)生物量，ii)種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。優(yōu)選肽能夠調(diào)節(jié)生物量和種子產(chǎn)量。優(yōu)選肽能夠調(diào)節(jié)生物量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性。優(yōu)選肽能夠調(diào)節(jié)生物量、種子產(chǎn)量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性。在另一個方面本發(fā)明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中生物量的多肽。在另一個方面本發(fā)明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中種子產(chǎn)量的多肽。在另一個方面本發(fā)明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其變體的分離的多核苷酸， 其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激耐受性的 多肽。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)至少兩種、通常至少三種、更優(yōu)選至少四種和最優(yōu)選所有五種 所述的環(huán)境應(yīng)激。在上面三個方面每個的一個具體實施方案中，分離的多肽具有與序列SEQ ID NO 1至少70%的同一性。在另一個具體方案中，多肽含有A20型鋅指結(jié)構(gòu)域和ANl型鋅指結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域在多肽的N末端一半中。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域在多肽的C末端一半中。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選Am 型結(jié)構(gòu)域具有通式 C-X2-C-X (9-12) -C-X (1-2) -C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C， 其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID N0:17。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 16組成。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID N0:19。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID N0:19。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 18組成。在另一個具體實施方案中，分離的多肽含有序列SEQ ID NO :1。在另一個方面本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的多核苷酸的至少50個核苷酸長度片段 的分離的多核苷酸。在一個具體實施方案中環(huán)境應(yīng)激是干旱。在另一個具體實施方案中環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在另一個具體實施方案中環(huán)境應(yīng)激是冰凍。在另一個具體實施方案中環(huán)境應(yīng)激是熱。在另一個具體實施方案中環(huán)境應(yīng)激是鹽分。在另一個方面本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的多核苷酸的遺傳構(gòu)建體。在一個具體實施方案中遺傳構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。在另一個方面本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的多核苷酸、遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體的 載體。在另一個方面本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的多核苷酸、遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體的 宿主細(xì)胞。在另一個方面本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的宿主細(xì)胞。在另一個方面本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞。在另一個方面本發(fā)明提供了經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的植物細(xì)胞。在另一個方面本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的植物細(xì)胞的植物。使用多核苷酸的方法在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有至少一種下列性狀的植物的方法i)改變的生物量，ii)改變的種子產(chǎn)量，和iii)改變的對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其變體，其中變體編碼能夠改變 生物量和/或?qū)χ参镏兄辽僖环N所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽。b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。
在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有改變的生物量的植物的方法，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其變體，其中變體編碼能夠改變 植物中生物量的多肽。b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有改變的種子產(chǎn)量的植物的方法，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其變體，其中變體編碼能夠改變 植物中種子產(chǎn)量的多肽；b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有改變耐受性的植物的方法，所述植物具有對 至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性，所述方法包括用以下成分 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其變體，其中變體編碼能夠增加 對植物中至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽；b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。改變可以是增加或減少。優(yōu)選改變是增加。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)至少兩種，通常至少三種，更優(yōu)選至少四種和最優(yōu)選所有五種 所述的環(huán)境應(yīng)激。在三個方面中每個的一個具體實施方案中，分離的多核苷酸編碼具有與序列SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。在另一個具體實施方案中，多肽含有A20型鋅指結(jié)構(gòu)域和ANl型鋅指結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域在多肽的N末端一半中。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域在多肽的C末端一半中。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選Am 型結(jié)構(gòu)域具有通式 C-X2-C-X (9-12) -C-X (1-2) -C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C， 其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID N0:17。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 16組成。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :19。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :19。
優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 18組成。在另一個具體實施方案中，分離的多核苷酸編碼具有序列SEQ ID NO 1的多肽。優(yōu)選植物用含有所述多核苷酸的遺傳構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化。在一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是干旱。在另一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在另一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是冰凍。在另一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是熱。在另一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是鹽分。在另一個具體實施方案中，變體含有SEQ ID NO 8至12中任一個的序列。在另一個具體實施方案中，a)中多核苷酸含有序列SEQ ID NO :1。方法-使用編碼多肽的多核苷酸在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有至少一種下列性狀的植物的方法i)改變的生物量，ii)改變的種子產(chǎn)量，和iii)改變的對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激的耐受性，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物a)編碼具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽變體的多核苷酸，其中變體 能夠改變生物量和/或?qū)χ参镏兄辽僖环N選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐 受性。b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有改變的生物量的植物的方法，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物a)編碼具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽變體的多核苷酸，其中變體 能夠改變植物中的生物量；b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有改變的種子產(chǎn)量的植物的方法，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物a)編碼具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽變體的多核苷酸，其中變體 能夠改變植物中的種子產(chǎn)量；b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。在另一個方面本發(fā)明提供了制備具有至少一種改變的耐受性的植物的方法，所述 耐受性是對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物a)編碼具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽變體的多核苷酸，其中變體 能夠改變植物中對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性；b)含有至少15個核苷酸長度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或
c)含有a)或b)中多核苷酸的互補物的多核苷酸。在上面三個方面中每個的一個具體實施方案中，分離的多核苷酸編碼具有與序列 SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。在另一個具體實施方案中，多肽含有A20型鋅指結(jié)構(gòu)域和ANl型鋅指結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域在多肽的N末端一半中。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域在多肽的C末端一半中。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有通式X3-C-X (2-4) -C-Xl 1-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選Am 型結(jié)構(gòu)域具有通式 C-X2-C-X (9-12) -C-X (1-2) -C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C， 其中X可以是任意氨基酸。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :17。優(yōu)選A20型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 16組成。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。優(yōu)選ANl型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQ ID NO :19。優(yōu)選多肽含有序列SEQ ID NO :19。優(yōu)選Am型結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID NO 18組成。優(yōu)選多肽能夠調(diào)節(jié)至少兩種，通常至少三種，更優(yōu)選至少四種和最優(yōu)選所有五種 所述的環(huán)境應(yīng)激。在另一個具體實施方案中，多肽含有序列SEQ ID NO :1。優(yōu)選植物用含有所述多核苷酸的遺傳構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化。在一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是干旱。在一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是寒冷。在一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是冰凍。在一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是熱。在一個具體實施方案中，環(huán)境應(yīng)激是鹽分。在更優(yōu)選的具體實施方案中，a)中多核苷酸編碼具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列 的多肽。方法-選擇在另一個方面本發(fā)明提供了用于選擇具有至少一種下列性狀的植物的方法相對于合適的對照植物，i)改變的生物量，ii)改變的種子產(chǎn)量，和iii)改變的對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性，所述方法包括測試植物改變的本發(fā)明多核苷酸或多肽的表達(dá)。在另一個方面本發(fā)明提供了用于選擇相對于合適的對照植物具有改變的生物量 的植物的方法，所述方法包括測試植物改變的本發(fā)明多核苷酸或多肽的表達(dá)。在另一個方面本發(fā)明提供了用于選擇相對于合適的對照植物具有改變的種子產(chǎn)量的植物，所述方法包括測試植物改變的本發(fā)明多核苷酸或多肽的表達(dá)。在另一個方面本發(fā)明提供了用于選擇相對于合適的對照植物具有增加的對至少 一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激的耐受性的植物的方法，所述方法包括測試 植物改變的本發(fā)明多核苷酸或多肽的表達(dá)。植物在另一個方面本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法制備的植物細(xì)胞或植物。在另一個方面本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法選擇的植物群組或群體。本發(fā)明的多核苷酸的來源本發(fā)明的多核苷酸和多核苷酸變體可以源自任何物種和/或可以合成或重組制備。在一個具體實施方案中，多核苷酸或變體源自植物物種。在另一個具體實施方案中多核苷酸或變體源自裸子植物物種。在另一個具體實施方案中多核苷酸或變體源自被子植物物種。在另一個具體實施方案中多核苷酸或變體源自雙子葉植物物種。在另一個具體實施方案中多核苷酸或變體源自單子葉植物物種。本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物的來源本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物可以源自任何物種。在一個具體實施方案中植物細(xì)胞或植物源自裸子植物物種。在另一個具體實施方案中植物細(xì)胞或植物源自被子植物物種。在另一個具體實施方案中植物細(xì)胞或植物源自雙子葉植物物種。在另一個具體實施方案中植物細(xì)胞或植物源自單子葉植物物種。優(yōu)選的雙子葉植物屬包括桃屬(Amygdalus)、檟如樹屬(Anacardium)、銀蓮花屬 (Anemone)、花生屬(Arachis)、蕓苔屬(Brassica)、木豆屬(Cajanus)、大麻屬(Cannabis)、 紅花屬(Carthamus)、山核桃屬(Carya)、吉貝屬(Ceiba)、鷹嘴豆屬(Cicer)、春美草屬 (Claytonia)、芫荽屬(Coriandrum)、小冠花屬(Coronilla)、紫堇屬(Corydalis)、豬屎 豆屬(Crotalaria)、櫻草屬(Cyclamen)、石竹花屬(Dentaria)、荷包牡丹屬(Dicentra)、 扁豆屬(Dolichos)、英葵屬(Eranthis)、大豆屬(Glycine)、棉花屬(Gossypium)、向 日葵屬(Helianthus)、香豌豆屬(Lathyrus)、兵豆屬(Lens)、胡枝子屬(Lespedeza)、 亞麻屬(Linum)、蓮屬(Lotus)、羽扇豆屬(Lupinus)、澳洲堅果屬(Macadamia)、苜蓿 屬(Medicago)、草木犀屬(Melilotus)、黎豆屬(Mucuna)、木犀欖屬(Olea)、驢食草屬 (Onobrychis)、料豆屬(Ornithopus)、酢漿草屬(Oxalis)、罌粟屬(Papaver)、菜豆屬 (Phaseolus)、刺葵屬(Phoenix)、黃連木屬(Pistacia)、豌豆屬(Pisum)、櫻桃屬(Prunus)、 葛屬(Pueraria)、茶薦子屬(Ribes)、蓖麻屬(Ricinus)、胡麻屬(Sesamum)、唐松草屬 (Thalictrum)、可可屬(Theobroma)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、蠶豆 屬(Vicia)和豇豆屬(Vigna)。優(yōu)選的雙子葉植物物種包括扁桃(Amygdalus communis)、腰果(Anacardium occidentale)、美洲銀蓮花(Anemone americana)、西方銀蓮花(Anemone occidentalis)、 花生(Arachis hypogaea)、花生(Arachis hypogea)、油菜(Brassica napus Rape)、 H (Brassicanigra)、白胃(Brassica campestris)、 7^ (Cajanuscajan)、木曰(Cajanus indicus)、；^ 0 (Cannabis sativa)、^1 (Carthamus tinctorius)、_ 15 ill 核桃(Carya illinoinensis)、吉貝(Ceiba pentandra)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)、 (Claytonia exigua) Λ M ill # ^ A (Claytonia megarhiza) λ ^ ^ (Cor i an drum sativum)、繡球小冠花(Coronilla varia)、紫堇(Corydalis flavula)、常綠紫堇 (Corydalis sempervirens)、菽麻(Crotalaria juncea)、小花仙客來(Cyclamen coum)、 裂葉石芥花(Dentaria laciniata)、縫毛荷包牡丹(Dicentra eximia)、美麗荷包牡 丹(Dicentra formosa)、扁豆(Dolichos lablab) Λ ^iM (Eranlhis hyemalis)、亞洲棉 (Gossypium arboreum)、中棉(Gossypium nanking)、海島棉(Gossypium barbadense)、草 棉(Gossypium herbaceum)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、野大豆 (Glycine ussuriensis)、寬葉蔓豆(Glycine gracilis)、向日葵(Helianthus annus)、窄 葉羽扇豆(Lupinus angustifolius)、黃羽扇豆(Lupinus luteus)、珍珠羽扇豆(Lupinus mutabilis)、鐵掃帚(Lespedeza sericea)、雞目艮草(Lespedeza striata)、大百脈根 (Lotus uliginosus)、山黧豆(Lathyrus sativus)、兵豆(Lens culinaris)、長萼約目艮草 (Lespedeza stipulacea)、亞麻(Linum usitatissimum)、百脈根(Lotus corniculatus)、 白習(xí)習(xí)扇豆(Lupinus albus)、木本苜猜(Medicago arborea)、黃花苜猜(Medicago falcate)、金花菜(Medicago hispida)、黃香草木犀(Medicago officinalis)、紫花苜蓿 (Medicago sativa (alfalfa))、硬果苜蓿(Medicago tribuloides)、澳洲堅果(Macadamia integrifolia)、褐斑苜蓿(Medicago arabica)、白花草木樨(Melilotus albus)、剌毛黎豆 (Mucuna pruriens)、油(Oleaeuropaea)、紅豆胃(Onobrychis viciifolia)、|居^■胃 (Ornithopus sativus)酉乍醫(yī)草(Oxalis tuberosa)、參錄豆(Phaseolus aureus)、紅卩十 李(Prunus cerasifera)、歐效、1、|酸樓^IK (Prunus cerasus)、荷包豆(Phaseolus coccineus)、 歐洲李(Prunusdomestica) ^iSS (Phaseolus lunatus)、馬哈利櫻桃(Prunu. maheleb)、 參錄豆(Phaseolusmungo)、(Prunus. persica)、樓 ^IK (Prunus. pseudocerasus)、菜豆 (Phaseolusvulgaris)、§|^ (Papaver somniferum)、寬卩十胃豆(Phaseolus acutifolius)、 海專(Phoenix dactylifera)、阿月渾子(Pistacia vera)、豌豆(Pisum sativum)、舌甘扁 (Prunus amygdalus)、杏(Prunus armeniaca)、里予葛(Pueraria thunbergiana) λ M^fJl 子(Ribes nigrum)、紅荼薦子(Ribes rubrum)、鵝莓(Ribes grossularia)、蓖麻(Ricinus communis)、芝麻(Sesamum indicum)、異株唐松草(Thalictrum dioicum)、黃唐松草 (Thalictrum flavum)、憂傷銀蓮(Thalictrum thalictroides)、可可(Theobroma cacao)、 狹葉三葉草(Trifolium augustifolium)、分散三葉草(Trifolium diffusum)、雜種車軸 草(Trifolium hybridum)、降車軸草(Trifolium incarnatum)、球花車軸草(Trifolium ingrescens)、紅車軸草(Trifolium pratense)、白車軸草(Trifolium repens)、波斯 三葉草(Trifolium resupinatum)、地三葉草(Trifolium subterraneum)、士矣及車軸草 (Trifolium alexandrinum)、古月戸巴(Trigonella foenumgraecum)、窄葉野豌豆(Vicia angustifolia)、深紫花野豌豆(Vicia atropurpurea)、距花豌豆(Vicia calcarata)、 廣布里予豌豆(Vicia dasycarpa)、苦里予豌豆(Vicia ervilia)、紅莓苔子(Vaccinium oxycoccos)、褐毛野豌豆(Vicia pannonica)、長豆工豆(Vigna sesquipedalis)、豆工豆(Vigna sinensis)、長柔毛里予豌豆(Vicia villosa)、蠶豆(Vicia faba)、里予碗豆(Vicia sative) 禾口赤豆(Vigna angular is)。
優(yōu)選的單子葉植物屬包括冰草屬(Agropyron)、蔥屬(Allium)、看麥娘 屬(Alopecurus)、須芒草屬(Andropogon)、燕麥草屬(Arrhenatherum)、天門冬屬 (Asparagus)、燕麥屬(Avena)、簕竹屬(Bambusa)、羅馬風(fēng)信子屬(Bellavalia)、風(fēng)鈴百合 屬(Brimeura)卜若地屬(Brodiaea)、水仙屬(Bulbocodium)、孑L穎草屬(Bothrichloa)、格 蘭馬草屬(Bouteloua)、雀麥屬(Bromus)、沙茅屬(Calamovilfa)、卡馬夏屬(Camassia)、蒺 藜草屬(Cenchrus)、雪光花屬(Chionodoxa)、虎尾草屬(Chloris)、秋水仙屬(Colchicum)、 番紅花屬(Crocus)、香茅屬(Cymbopogon)、狗牙根屬(Cynodon)、杓蘭屬(Cypripedium)、鴨 茅屬(Dactylis)、毒鼠子屬(Dichmthium)、馬唐屬(Digitaria)、油棕屬(Elaeis)、糝屬 (Eleusine)、_眉草屬(Eragrostis)、獨尾草屬(Eremurus)、赤蓮屬(Erythronium)、養(yǎng)麥 屬(Fagopyrum)、羊茅屬(Festuca)、貝母屬(Fritillaria)、雪花蓮屬(Galmthus)、向日葵 屬(Helianthus)、大麥屬(Hordeum)、風(fēng)信子屬(Hyacinthus)、藍(lán)鈴花屬(Hyacinthoides)、 紫星花屬(Ipheion)、鳶尾屬(Iris)、雪片蓮屬(Leucojum)、蛇鞭菊屬(Liatris)、黑麥草 屬(Lolium)、石蒜屬(Lycoris)、芒屬(Miscanthis)、芒屬(Miscanthus χ giganteus)、葡 萄風(fēng)信子屬(Muscari)、虎眼萬年青屬(Ornithogalum)、稻屬(Oryza)、黍?qū)?Panicum)、雀 稗屬O^aspalum)、狼尾草屬(Pennisetum)、藹草屬(Wialaris)、梯牧草屬(Phleum)、早熟 禾屬(Poa)、藍(lán)條海蔥屬O^uschkinia)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬Gecale)、狗尾草屬 (Setaria)、印第安草屬(Sorghastrum)、高粱屬(Sorghum)、偃麥草屬(Thinopyrum)、小麥 屬(Triticum)、香莢蘭屬(Vanilla)、小黑麥屬(X Triticosecale Triticale)和玉蜀黍?qū)?(Zea) ο優(yōu)選的單子葉植物物種包括冰草(Agropyron cristatum)、沙生冰草 (Agropyron desertorum)、長穗偃麥草(Agropyron elongatum)、中間偃麥草(Agropyron intermedium)、藍(lán)蓮冰草(Agropyron smithii)、叢生小麥草(Agropyron spicatum)、細(xì) 蓮冰草(Agropyron trachycaulum)、毛冰草(Agropyron trichophorum)、古月蔥(Allium ascalonicum)、洋蔥(Allium cepa)、萬頭(Allium chinense)、韭蔥(Allium porrum)、北 蔥(Allium schoenoprasum)、大蔥(Allium f istulosum)、大蒜(Allium sativum)、大看 麥娘(Alopecurus pratensis)、須芒草(Andropogon gerardi)、大須芒草(Andropogon Gerardii)、小須芒草(Andropogon scoparious)、燕麥草(Arrhenatherum elatius)、 石習(xí)桕(Asparagus officinalis)、裸燕麥(Avena nuda)、燕麥(Avena sativa)、大 佛肚竹(Bambusa vulgaris)、(Bellevalia trifoliate)、白花風(fēng)鈴百合(Brimeura amethystina)、卜胃 iik (Brodiaea californica) λ ^ ^ ^ Mfe (Brodiaea coronaria)、 優(yōu)雅卜若地(Brodiaea elegans)、多色水仙(Bulbocodium versicolor)、藤莖須芒草 (Bothrichloa barbinodis)Λ 白羊草(Bothrichloa ischaemum)、針草(Bothrichloa saccharoides)、垂穗草(Bouteloua curipendula)、漂格蘭馬草(Bouteloua eriopoda)、 格蘭馬草(Bouteloua gracilis)、直立雀麥(Bromus erectus)、無芒雀麥(Bromus inermis)、草地雀麥(Bromus riparius)、沙拂子茅(Calamovilfa longifilia)、大西洋 卡馬夏(Camassia scilloides)、纖毛漠藜草(Cenchrus ciliaris)、粉光花(Chionodoxa forbesii)^ # rill ^ M ^ (Chloris gayana)(Colchicum autumnal e) Λ (Crocus sativus)、香茅(Cymbopogon nardus)、狗牙豐艮(Cynodon dactylon)、粉紅t勺蘭 (Cypripedium acaule)、甲鳥茅(Dactylis glomerata)、雙花草(Dichanthium annulatum)、毛梗雙花草(Dichanthium aristatum)、昆士蘭藍(lán)草(Dichanthium sericeum)、俯仰馬唐 (Digitaria decumbens)、南非馬唐(Digitaria smutsii)、油掠(Elaeis guineensis)、美 洲油棕櫚(Elaeis oleifera)、禾參子(Eleusine coracan)、窄穎新麥草(Elymus angustus)、 俄羅斯新麥草(Elymus junceus)、彎葉畫眉草(Eragrostis curvula)、埃塞俄比亞畫 眉草(Eragrostis tef)、巨獨尾草(Eremurus robustus)、秀 HI3 豬牙花(Erythronium elegans)、圣赫勒那豬牙花(Erythronium helenae)、養(yǎng)麥(Fagopyrum esculentum)、 苦養(yǎng)麥(Fagopyrum tataricum)、蘋狀羊茅(Festuca arundinacea)、羊茅(Festuca ovina)、草甸羊茅(Festuca pratensis)、紫羊茅(Festuca rubra)、川貝母(Fritillaria cirrhosa)、雪花蓮(Galanthus nivalis)、向日葵(Helianthus annuus sunflower)、二列 大麥(Hordeum distichum)、大麥(Hordeum vulgare)、風(fēng)信子(Hyacinthus orientalis)、 西班牙藍(lán)鈴花(Hyacinthoides hispanica)、藍(lán)鈴花(Hyacinthoides non-scripta)、白 花韭(Ipheion sessile)、高原鸞尾(Iris collettii)、丹佛鸞尾(Iris danfordiae)、 N^M (Iris reticulate) λ S W >t ^ (Leucojum aestivum) λ tt ^ I ^r (Liatris cylindracea)、幽雅蛇鞭菊(Liatris elegans)、廣香百合(LiIium longiflorum)、多 花漂麥草(Lolium multiflorum)、多年生漂麥草(Lolium perenne)、石蒜(Lycoris radiata)、中國銀色草(Miscanthis sinensis)、奇崗(Miscanthus χ giganteus)、葡萄 風(fēng)信子(Muscari armeniacum)、大果串鈴花(Muscari macrocarpum)、洋水仙(Narcissus pseudonarcissus)、虎目艮萬年青(Ornithogalum montanum)、水禾 § (Oryza sativa)、 禾術(shù)米(Panicum italicium)、大黍(Panicum maximum)、稷(Panicum miliaceum)Λ 紫 黍草(Panicum purpurascens)、柳枝稷(Panicum virgatum)、毛花雀禾卑(Paspalum dilatatum)Λ 百喜草(Paspalum notatum)、狼尾草(Pennisetum clandestinum)、珍 珠狼尾草(Pennisetum glaucum)、象草(Pennisetum purpureum)、御谷(Pennisetum spicatum)、|H (Phalaris arundinacea)(PhIeum bertolinii)(PhIeum
pratense)、羊肉早熟禾(Poa fendleriana)、草地早熟禾(Poa pratensis)、林地早熟禾 (Poa nemoralis)、藍(lán)條海蔥(Puschkinia scilloides)、甘蔴(Saccharum officinarum)、 大蓮野生庶(Saccharum robustum)、竹庶(Saccharum sinense)、害！]手密(Saccharum spontaneum)、 ^MItiS (Scilla autumnalis) λ ^MItiS (Scilla peruviana) Λ 麥(Secale cereale)、小米(Setaria italica)、非洲狗尾草(Setaria sphacelata)、￡口 第安草(Sorghastrum nutans)、高梁(Sorghum bicolor)、舌甘高梁(Sorghum dochna)、 ifxMMi (Sorghum halepense)、蘇丹草(Sorghum sudanense)、長Hf匿麥草(Thinopyrum ponticum)、白花延齡草(Trillium grandiflorum)、小麥(Triticum aestivum)、二粒小麥 (Triticum dicoccum)、硬粒小麥(Triticum durum)、一粒小麥(Triticum monococcum)、 巴塔林郁金香(Tulipa batalinii)、郁金香(Tulipa clusima)、毛蕊郁金香(Tulipa dasystemon)、郁金香(Tulipa gesneriana)、格里郁金香(Tulipa greigii)、水百合郁 (Tulipa kaufmanniana) λ^ ^^ (Tulipa sylvestris)、±胃胃有(Tulipa turkestanica)、香莢蘭(Vanilla fragrans)、小漂麥(X Triticosecale)禾口玉米(Zea mays). 其它優(yōu)選的植物來自下列屬但不限于下列屬的飼料植物物種黑麥草 屬(Lolium)、羊茅屬O^estuca)、鴨茅屬(Dactylis)、雀麥屬(Bromus)、偃麥草屬(Thinopyrum)、三葉草屬(Trifolium)、苜蓿屬(Medicago)、梯牧草屬(Pheleum)、薦草屬 (Phalaris)、絨毛草屬(Holcus)、蓮屬(Lotus)、車前屬(Plantago)和菊苣屬(Cichorium)。特別優(yōu)選的屬是黑麥草屬或三葉草屬。特別優(yōu)選的是多年生黑麥草和白車軸草物 種。最優(yōu)選的是多年生黑麥草物種。術(shù)語“植物”預(yù)期包括整個植物、植物的任何部分、植物的繁殖體和后代。術(shù)語“繁殖體”意思是可以用于再生或繁殖(有性或無性)的植物任何部分，包括 種子和插條。本發(fā)明的植物可以生長和自交或與不同的植物品系雜交，可以鑒別具有所需表型 特征的所得雜種?？梢陨L兩代或兩代以上從而保證所述表型特征穩(wěn)定地保持和遺傳。從 這樣的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法獲得的植物也形成本發(fā)明的一個方面。優(yōu)選植物、植物部分、植物繁殖體或植物后代含有轉(zhuǎn)化進(jìn)入親代植物的多核苷酸。 優(yōu)選植物、植物部分、植物繁殖體或植物后代表達(dá)轉(zhuǎn)化進(jìn)入親代植物的多核苷酸。


圖1顯示用于植物轉(zhuǎn)化的載體C0RF136的圖，其含有與組成性雙CaMV35S啟動子 (D35S P)可操作地連接的0RF136。圖2顯示用于植物轉(zhuǎn)化的載體D0RF136的圖，其含有與黑麥草脫水素樣啟動子可 操作地連接的0RF136。圖3顯示了展示在圖1中的CORF載體的序列。0RF136編碼序列以黑體顯示。雙 CaMV35S啟動子以斜體顯示。UTR(非翻譯區(qū))序列用下劃線顯示。圖4顯示了展示在圖2中的D0RF136載體的序列。0RF136編碼序列以黑體顯示。 脫水素樣啟動子以斜體顯示。UTR(非翻譯區(qū))序列用下劃線顯示。圖5顯示了 0RF136多肽和其變體的比對。完全保守殘基用星號突出顯示。還顯示 的是 0RF136 中 A20 型鋅指基序 ITLCANRCGFPGNPATQNLCQNCFL(SEQ ID NO :16)的位置。還 顯示的是0RF136 中 Ml 型鋅指基序CSSCWKRVGLTGFRCRCGELFCGAHRYSDRHGC(SEQ ID NO :18) 的位置。還突出顯示的是在所有序列中完全保守的A20型基序內(nèi)的基序(CGFPGNPAT-SEQ ID NO 17)。還突出顯示的是在所有序列中完全保守的ANl型基序內(nèi)的基序(RVGLTGFRCRC-SEQ ID NO 19)。圖6顯示了圖5中比對的蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)生圖。圖7顯示了應(yīng)用干旱應(yīng)激前轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的情況。圖8顯示了在10天干旱應(yīng)激和4天恢復(fù)的末尾未應(yīng)激植物(頂部左背景)和應(yīng) 激植物(前景)的情況。圖9顯示描述了干旱后的恢復(fù)過程中轉(zhuǎn)基因植物中相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏母淖?生物量的圖。植物系7ael至7ael7也分別被描述為D0RF136-1至D0RF136-17 ；⑶S系也被 描述為表達(dá)D35S: GUS (細(xì)菌UidA基因)的系，其作為“無基因”的轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。圖10顯示描述了完全加水條件的過程中轉(zhuǎn)基因植物中相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏母?變生物量的圖。植物系7ael至7ael7也被分別描述為D0RF136-1至D0RF136-17。圖11顯示了用于基因整合數(shù)目確定的Southern印跡分析。圖12顯示由于含有鋅指TF 0RF136( = ORF138)的Ml和A20表達(dá)改變引起的T1轉(zhuǎn)化植物中種子產(chǎn)量增加的圖解表示。
具體實施例方式定義本說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“含有(comprising)”意思是“由至少一 部分組成”，就是說當(dāng)解釋包括“含有”的本說明書和權(quán)利要求書中的陳述時，在每個陳述 中以該術(shù)語開始的特征都需要出現(xiàn)，但是其它的特征也可以出現(xiàn)。相關(guān)的術(shù)語如“含有 (comprise) ”和“含有(comprised) ”以相似的方式解釋。術(shù)語“環(huán)境應(yīng)激”包括至少一種下列應(yīng)激干旱、寒冷、冰凍、熱和鹽分。術(shù)語“對干旱應(yīng)激的耐受性或耐受”預(yù)期描述在欠佳水合條件下或在欠佳水合條 件后相對于相同條件下的合適的對照植物，在生長和發(fā)育的任何方面表現(xiàn)更有利的植物。術(shù)語“對寒冷應(yīng)激的耐受性或耐受”預(yù)期描述在欠佳減少的減少的溫度條件下或 在欠佳減少的減少的溫度條件后相對于相同條件下的合適的對照植物，在生長和發(fā)育的任 何方面表現(xiàn)更有利的植物。術(shù)語“對冰凍應(yīng)激的耐受性或耐受”預(yù)期描述在小于或等于0°C的溫度條件下或在 小于或等于0°c的溫度條件后相對于相同條件下的合適的對照植物，在生長和發(fā)育的任何 方面表現(xiàn)更有利的植物。術(shù)語“對熱應(yīng)激的耐受性或耐受”預(yù)期描述在欠佳的提高溫度條件下或在欠佳的 提高溫度條件后相對于相同條件下的合適的對照植物，在生長和發(fā)育的任何方面表現(xiàn)更有 利的植物。術(shù)語“對鹽分的耐受性或耐受”預(yù)期描述在欠佳的提高鹽分條件下或在欠佳的提 高鹽分條件后相對于相同條件下的合適的對照植物，在生長和發(fā)育的任何方面表現(xiàn)更有利 的植物。提及本發(fā)明的選擇方法時，對環(huán)境應(yīng)激具有增加耐受性的植物是選自以下的植物 群體的植物在應(yīng)激條件下相對于相同條件下的群體的一般成員，在生長和發(fā)育的任何方 面表現(xiàn)更有利。更有利的表現(xiàn)是指上面包括去除環(huán)境應(yīng)激后，在環(huán)境應(yīng)激一段時間后改善恢復(fù)的 改善表現(xiàn)。術(shù)語“生物量”指示特殊年齡或發(fā)育階段中植物營養(yǎng)器官的大小和/或質(zhì)量和/或 數(shù)目。因此具有增加生物量的植物相對于相同年齡或同等發(fā)育階段的合適的對照植物具有 增加大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目的營養(yǎng)器官。相反，具有減少生物量的植物相對于合適的 對照具有減少大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目的營養(yǎng)器官。改變的生物量還包括在植物的一些 或所有的生命循環(huán)時期內(nèi)，相對于合適的對照，生長速率和/或營養(yǎng)器官形成速率的改變。 因此改變的生物量可以引起這樣的植物達(dá)到某種發(fā)育階段所需時間的提前或延后。術(shù)語“種子產(chǎn)量”是指植物產(chǎn)生的種子或谷粒的大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目。因 此具有增加的種子產(chǎn)量的植物相對于相同年齡或同等發(fā)育階段的合適對照植物，具有增加 大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目的種子或谷粒。相反，具有減少種子產(chǎn)量的植物相對于相同年 齡或同等發(fā)育階段的合適對照植物，具有增加大小和/或質(zhì)量和/或數(shù)目的種子或谷粒。提及種子產(chǎn)量的術(shù)語“改變的”預(yù)期包括種子產(chǎn)量的減少或增加。
提及種子產(chǎn)量的術(shù)語“調(diào)節(jié)”預(yù)期包括減少或增加種子產(chǎn)量。合適的對照植物包括相同物種或品種的非轉(zhuǎn)化植物或用對照構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的相同 物種或品種的植物。多核苷酸和片段本文使用的術(shù)語“多核苷酸”意思是任何長度但優(yōu)選至少15個核苷酸的單鏈或 雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且包括(作為非限制性例子)基因的編碼和非 編碼序列、正義和反義序列互補物、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、 siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多肽、分離和純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA 和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文提供的多核苷酸序列的“片段”是能夠與目的靶向特異性雜交的連續(xù)核苷酸， 例如至少15個核苷酸長度的序列。本發(fā)明的片段含有本發(fā)明多核苷酸的連續(xù)核苷酸的15 個核苷酸，優(yōu)選至少20個核苷酸，更優(yōu)選至少30個核苷酸，更優(yōu)選至少50個核苷酸，更優(yōu) 選至少50個核苷酸，更優(yōu)選至少60個核苷酸，更優(yōu)選至少70個核苷酸，更優(yōu)選至少80個 核苷酸，更優(yōu)選至少90個核苷酸，更優(yōu)選至少100個核苷酸，更優(yōu)選至少150個核苷酸，更 優(yōu)選至少200個核苷酸，更優(yōu)選至少250個核苷酸，更優(yōu)選至少300個核苷酸，更優(yōu)選至少 350個核苷酸，更優(yōu)選至少400個核苷酸，更優(yōu)選至少450個核苷酸。多核苷酸序列的片段 可以用于反義、基因沉默、三螺旋或核酶技術(shù)，或作為包括在微陣列中的引物、探針，或用于 本發(fā)明基于多核苷酸的選擇方法中。術(shù)語“引物”是指短的多核苷酸，通常具有游離的3’ OH基團(tuán)，與模板雜交并用于與 靶向互補的多核苷酸的起始聚合。術(shù)語“探針”是指在基于雜交的分析中用于檢測多核苷酸序列，與探針互補的短多 核苷酸。探針可以由本文定義的多核苷酸的“片段”組成。多肽和片段本文使用的術(shù)語“多肽”包括任何長度但優(yōu)選至少5個氨基酸的氨基酸鏈，包括全 長蛋白質(zhì)，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。本發(fā)明的多肽可以從天然產(chǎn)物中純化，或可 以部分或全部使用重組或合成技術(shù)產(chǎn)生。該術(shù)語可以指多肽、多肽的聚集體如二聚體或其 它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體或其衍生物。多肽的“片段”是實現(xiàn)生物活性所需的功能和/或提供多肽的三維結(jié)構(gòu)的順序多 肽。該術(shù)語可以指多肽、多肽聚集體如二聚體或其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體 或能夠?qū)崿F(xiàn)上面酶活性的其衍生物。應(yīng)用于本文公開的多核苷酸或多肽序列的術(shù)語“分離的”用于指從其天然細(xì)胞環(huán) 境中移出的序列。分離的分子可以通過任何方法或方法的組合包括生物化學(xué)、重組和合成 技術(shù)獲得。術(shù)語“重組體”是指從序列的天然環(huán)境中包圍其的序列中移出的多核苷酸序列和 /或與其天然環(huán)境中不存在的序列重組的多核苷酸序列。“重組”多肽序列通過從“重組”多核苷酸序列的翻譯產(chǎn)生。關(guān)于源自特殊屬或物種的本發(fā)明的多核苷酸或多肽的術(shù)語“源自”意思是多核苷 酸或多肽具有所述屬或物種中天然找到的多核苷酸或多肽的相同序列。因此源自特殊屬或 物種的多核苷酸或多肽可以通過合成或重組制備。
變體如本文使用的，術(shù)語“變體”是指與明確鑒別的序列不同的多核苷酸或多肽序列， 其中一個或多個核苷酸或氨基酸殘基被刪除、置換或添加。變體可以是天然存在的等位基 因變體或非天然存在的變體。變體可以來自相同或來自其它的物種且可以包括同源物、旁 系同源物和直系同源物。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸和多肽的變體具有與 那些本發(fā)明的多核苷酸或多肽相同或相似的生物活性。提及多核苷酸和多肽的術(shù)語“變體” 包括所有形式的本文定義的多核苷酸和多肽。多核苷酸變體變體多核苷酸序列優(yōu)選顯示與特定的多核苷酸序列至少50%，更優(yōu)選至少51%， 更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選至少53%，更優(yōu)選至少M %，更優(yōu)選至少55%，更優(yōu)選至少56%， 更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少61 %， 更優(yōu)選至少62 %，更優(yōu)選至少63 %，更優(yōu)選至少64 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少66 %， 更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少71 %， 更優(yōu)選至少72 %，更優(yōu)選至少73 %，更優(yōu)選至少74 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %， 更優(yōu)選至少77 %，更優(yōu)選至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少81 %， 更優(yōu)選至少82 %，更優(yōu)選至少83 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少86 %， 更優(yōu)選至少87 %，更優(yōu)選至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91 %， 更優(yōu)選至少92 %，更優(yōu)選至少93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %， 更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，和最優(yōu)選至少99%的同一性。在特定多核苷酸序列的 至少20個核苷酸位置，優(yōu)選至少50個核苷酸位置，更優(yōu)選至少100個核苷酸位置的比較窗 口上和最優(yōu)選在全長上找到同一性。多核苷酸序列的同一性可以以下列方式確定。使用BLASTN (來自blkeq中BLAST 程序組，版本2. 2. 5 [Nov 2002]) ((Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999)，" Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences" , FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250)，可以從 NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)公開獲 得)將所述多核苷酸序列與候選多核苷酸序列比較。除了低復(fù)雜性部分的過濾應(yīng)該關(guān)掉以 外，使用blkeq的缺省參數(shù)。可以使用下列imix命令行參數(shù)檢查多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p blastn參數(shù)FF :關(guān)掉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)ρ 選擇序列對的合適算法。blkeq程 序用行“同一性=”中相同核苷酸的數(shù)目和百分比報告序列的同一性。多核苷酸序列同一性還可以使用整體序列比對程序(例如Needleman，S. B.和 ffunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)在候選和所述多核苷酸序列之間的重疊全 長上計算。Needleman-Wunsch整體比對算法的完全實現(xiàn)在EMBOSS程序包中的needle程 序(Rice, P.Longden, I.禾口 Bleasby, A. EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000，vol 16，No 6. pp. 276—277)中可以找 到，所述程序可以從http://www. hRmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/獲得。歐洲生物信息 學(xué)研究所服務(wù)器還提供工具從而進(jìn)行在http:/WWW. ebi. ac. uk/emboss/align/上在線的 兩個序列間的EMBOSS-needle整體比對。
或者可以使用GAP程序，其不對末端空隙進(jìn)行罰分而計算兩個序列的最佳整體比 對。GAP 在下列文章中有描述Huang，X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。本發(fā)明的多核苷酸變體還包括那些與一個或多個具體確定的序列顯示相似性的 序列，其有可能保留那些序列的功能等同性且不能被合理地預(yù)期為隨機(jī)出現(xiàn)。這些序列關(guān) 于多肽的相似性可以使用來自NCBI的BLAST程序組(版本2. 2. 5 [Nov2002]) (ftp //ftp. ncbi.nih. Rov/blast/)中可以公開獲得的blkeq程序而確定。多核苷酸序列的相似性可以使用下列imix命令行參數(shù)檢查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p tblastx參數(shù)FF:關(guān)掉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)P:選擇序列對的合適算法。該程序在 序列間找到相似性的區(qū)域并對每個這樣的區(qū)域報告“E值”，所述“E值”是人們在含有隨機(jī) 序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中預(yù)期隨機(jī)見到這樣匹配的預(yù)期次數(shù)。該數(shù)據(jù)庫的大小被設(shè) 定為blkeq程序中的缺省值。對于較小的遠(yuǎn)小于1的E值，E值大約是這樣隨機(jī)匹配的概 率。當(dāng)與任一個具體確定的序列相比，變體多核苷酸序列優(yōu)選顯示1x10,以下，優(yōu)選 IxlO-20以下，更優(yōu)選lxl(T3°以下，更優(yōu)選lxl(T4°以下，更優(yōu)選1χ1(Γ5°以下，更優(yōu)選1x10, 以下，更優(yōu)選lxl0_7°以下，更優(yōu)選1χ10_8°以下，更優(yōu)選1χ10_9°以下，更優(yōu)選1x10,°以下， 更優(yōu)選IxKTiki以下和最優(yōu)選1χ10_12°以下的E值?；蛘?，本發(fā)明的變體多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與特定的多核苷酸序列或其互補物雜 、-父。術(shù)語“在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交”和其語法等同物是指多核苷酸分子與靶多核苷酸分子 (如固定在DNA或RNA印跡如Southern印跡或Northern印跡上的靶多核苷酸分子)在限 定的溫度和鹽濃度的條件下雜交的能力。在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交的能力可以通過在較不嚴(yán) 謹(jǐn)條件下最初雜交然后將嚴(yán)謹(jǐn)度增加至所需嚴(yán)謹(jǐn)度而確定。關(guān)于大于約100個堿基長度的多核苷酸分子，通常的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為不高于天然 雙鏈的解鏈溫度(Tm)以下25至30°C (例如10°C )(通常見Sambrook等人，Eds，1987， Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Ausubel 等人，1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,)。大于 約100個堿基的多核苷酸分子的Tm可以通過公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)計 算(Sambrook 等人，Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy，1962，PNAS84 :1390)。大于約 100 個堿基長 度的多核苷酸的通常嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交條件如在6XSSC，0. 2% SDS的溶液中預(yù)洗；在65°C， 6X SSC，0. 2% SDS雜交過夜；然后是65°C1X SSC，0. 1 % SDS中兩次洗滌，每次30分鐘和在 65°C，0. 2X SSC,0. 1% SDS中兩次洗滌，每次30分鐘。關(guān)于具有長度在100個堿基以下的多核苷酸分子，示例性的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為Tm以 下5至10°C。平均，長度在IOObp以下的多核苷酸分子的Tm減少約(500/寡核苷酸長度)°C關(guān)于稱為肽核酸(PNA)的DNA模擬物(Nielsen等人，kience. 1991 Dec6 ； 254(5037) =1497-500), Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA雜交體的Tm值，且可以使用 Giesen 等人，Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1 ；26 (21) :5004-6 中所述的公式計算。具有長度在100個堿基以下的DNA-PNA雜交體的示例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為Tm以下5至10°C。本發(fā)明的變體多核苷酸還包括與本發(fā)明的序列不同的多核苷酸，但是由于遺傳密 碼的簡并性，編碼了與本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽具有相似活性的多肽。不改變多肽氨基 酸序列的序列改變是“沉默變異”。除了 ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，相同氨基酸的 其它密碼子可以通過本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)例如在特殊宿主生物中優(yōu)化密碼子表達(dá)而改變。不顯著改變其生物學(xué)活性而引起編碼的多肽序列中一個或幾個氨基酸的保守性 置換的多核苷酸序列的改變也包括在本發(fā)明中。技術(shù)人員知道制備表型沉默的氨基酸置換 的方法(見例如 Bowie 等人，1990，Science 247，1306)。由于編碼的多肽序列中沉默變異和保守性置換引起的變體多核苷酸可以使用來 自 NCBI 的 BLAST 程序組(版本 2. 2. 5 [Nov 2002]) (ftp //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)中 可以公開獲得的blkeq程序通過先前所述的tblastx算法而確定。調(diào)節(jié)生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng)激植物耐受性的本發(fā)明變體多核苷酸的功能可以通 過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法評估且在實施例部分有描述。功能可以通過以下評估，例如 通過本領(lǐng)域中已知的方法和/或本文所述的方法改變植物中多核苷酸的表達(dá)，并在環(huán)境應(yīng) 激條件下或在環(huán)境應(yīng)激條件后分析轉(zhuǎn)化的植物相對于對照植物的表現(xiàn)；以及在非應(yīng)激條件 中評估改變的生物量。幾個物種的另外的植物轉(zhuǎn)化規(guī)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文提 供了這樣的規(guī)程的列表。多肽變體提及多肽的術(shù)語“變體”是指多肽包括天然存在的、重組和合成產(chǎn)生的多肽。變體 多肽序列優(yōu)選顯示與本發(fā)明的序列至少50%，更優(yōu)選至少51%，更優(yōu)選至少52%，更優(yōu)選 至少53 %，更優(yōu)選至少M %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少56 %，更優(yōu)選至少57 %，更優(yōu)選 至少58 %，更優(yōu)選至少59 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少61 %，更優(yōu)選至少62 %，更優(yōu)選 至少63 %，更優(yōu)選至少64 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少66 %，更優(yōu)選至少67 %，更優(yōu)選 至少68 %，更優(yōu)選至少69 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少71 %，更優(yōu)選至少72 %，更優(yōu)選 至少73 %，更優(yōu)選至少74 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少76 %，更優(yōu)選至少77 %，更優(yōu)選 至少78 %，更優(yōu)選至少79 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少81 %，更優(yōu)選至少82 %，更優(yōu)選 至少83 %，更優(yōu)選至少84 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少86 %，更優(yōu)選至少87 %，更優(yōu)選 至少88 %，更優(yōu)選至少89 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少91 %，更優(yōu)選至少92 %，更優(yōu)選 至少93 %，更優(yōu)選至少94 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選 至少98 %，和最優(yōu)選至少99 %的同一性。在本發(fā)明多肽的至少20個氨基酸位置，優(yōu)選至少 50個氨基酸位置，更優(yōu)選至少100個氨基酸位置的比較窗口上和最優(yōu)選在全長上找到同一 性。多肽序列的同一性可以以下列方式確定。使用bIkeq中的BLASTP(來自BLAST 程序組，版本2. 2. 5[Nov 2002])將所述多肽序列與候選多肽序列比較，所述BLASTP可以從 NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)中公開獲得。除了低復(fù)雜性區(qū)域的過濾應(yīng)該關(guān)掉 以外，使用bl2seq的缺省參數(shù)。多肽序列的同一性還可以使用整體序列比對程序在候選和所述多核苷酸序列間 的重疊全長上計算。上述的 EMB0SS-needle(可以從 http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/ 獲得)禾口 GAP(Huang, X. (1994)On Global Sequence Alignment. Computer Applicationsin the Biosciences 10，227-235.)也是計算多肽序列同一性的合適的整體序列比對程序。上述BLASTP的用途優(yōu)選用于確定根據(jù)本發(fā)明的多肽變體。本發(fā)明的多肽變體還包括那些與一個或多個具體確定的序列顯示相似性的序列， 其有可能保留那些序列的功能等同性且不能被合理地預(yù)期為隨機(jī)出現(xiàn)。這些序列關(guān)于多肽 的相似性可以使用來自NCBI的BLAST程序組(版本2. 2. 5 [Nov 2002]) (ftp://ftp.ncbi. nih. Rov/blast/)中可以公開獲得的blkeq程序而確定。多肽序列的相似性可以使用下列 unix命令行參數(shù)檢查bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F_p blastp當(dāng)與任一個具體確定的序列比較時，變體多肽序列優(yōu)選顯示1x10,以下，更優(yōu)選 IxlO-20以下，更優(yōu)選lxl(T3°以下，更優(yōu)選lxl(T4°以下，更優(yōu)選1χ1(Γ5°以下，更優(yōu)選1x10, 以下，更優(yōu)選lxl0_7°以下，更優(yōu)選1χ10_8°以下，更優(yōu)選1χ10_9°以下，更優(yōu)選1x10,°以下， 更優(yōu)選1X10_"°以下，更優(yōu)選1χ10_12°以下，和最優(yōu)選1χ10_123以下的E值。參數(shù)FF 關(guān)掉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)ρ 選擇序列對的合適算法。該程序在序 列間找到相似性的區(qū)域并對每個這樣的區(qū)域報告“E值”，所述“E值”是人們在含有隨機(jī)序 列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中預(yù)期隨機(jī)見到這樣匹配的預(yù)期次數(shù)。對于較小的遠(yuǎn)小于1的 E值，這大約是這樣隨機(jī)匹配的概率。不顯著改變生物學(xué)活性的所述多肽序列的一個或數(shù)個氨基酸的保守性置換也包 括在本發(fā)明中。技術(shù)人員知道制備表型沉默氨基酸置換的方法(見例如Bowie等人，1990， Science 247，1306)。構(gòu)建體、載體和其成分術(shù)語“遺傳構(gòu)建體”是指多核苷酸分子，通常是雙鏈DNA，其中可以插入另一個多核 苷酸分子(插入性多核苷酸分子)如但不限于cDNA分子。遺傳構(gòu)建體可以含有允許轉(zhuǎn)錄 插入性多核苷酸分子和可選地將轉(zhuǎn)錄本翻譯成多肽的必須元件。插入性多核苷酸分子可以 源自宿主細(xì)胞，或可以源自不同的細(xì)胞或生物和/或可以是重組的多核苷酸。一旦遺傳構(gòu) 建體在宿主細(xì)胞中，其可以整合進(jìn)入宿主的染色體DNA中。遺傳構(gòu)建體可以與載體相連。術(shù)語“載體”是指多核苷酸分子，通常是雙鏈DNA，其用于將遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)運至宿主 細(xì)胞中。載體能夠在至少一種另外的宿主系統(tǒng)中如大腸桿菌(E.coli.)中復(fù)制。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”是指包括允許轉(zhuǎn)錄插入性多核苷酸分子和可選地將轉(zhuǎn)錄本翻 譯成多肽的必需元件的遺傳構(gòu)建體。表達(dá)構(gòu)建體通常以5’至3’的方向含有a)在宿主細(xì)胞中有功能的啟動子，所述構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化，b)待表達(dá)的多核苷酸，和c)在宿主細(xì)胞中有功能的終止子，所述構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化。術(shù)語“編碼區(qū)”或“開放閱讀框”(ORF)是指在合適的調(diào)控序列控制下能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物和/或多肽的基因組DNA序列或cDNA序列的正義鏈。編碼序列通過5’翻譯起始密 碼子和3’翻譯終止密碼子的存在得到鑒別。當(dāng)“編碼序列”插入遺傳構(gòu)建體中時，當(dāng)其可 操作地與啟動子和終止子序列連接時，其能夠得到表達(dá)?！翱刹僮鞯剡B接”意思是將待表達(dá)的序列放置在包括啟動子、組織特異性調(diào)控元 件、瞬時調(diào)控元件、增強子、阻遏子和終止子的調(diào)控元件的控制下。
術(shù)語“非編碼區(qū)”是指在翻譯起始位點上游和翻譯終止位點下游的非翻譯序列。這 些序列也分別稱為5’UTR和3’UTR。這些區(qū)域包括轉(zhuǎn)錄起始和終止所需的和調(diào)控翻譯效率 所需的元件。終止子是終止轉(zhuǎn)錄且在可以在翻譯序列下游的基因3’非翻譯末端找到的序列。終 止子是mRNA穩(wěn)定性的重要決定因素，且在一些情況下發(fā)現(xiàn)具有空間調(diào)控功能。術(shù)語“啟動子”是指調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的編碼區(qū)上游的非轉(zhuǎn)錄順式調(diào)控元件。啟動子 含有規(guī)定轉(zhuǎn)錄起始位點的順式啟動子元件和保守盒如TATA盒以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序?！稗D(zhuǎn)基因”是取自一個生物并通過轉(zhuǎn)化引入不同生物的多核苷酸。轉(zhuǎn)基因可以源自 與所述轉(zhuǎn)基因引入的生物物種相同的物種或不同的物種。“反向重復(fù)序列”是其中重復(fù)的第二半在互補鏈中的重復(fù)序列，例如(5，) GATCTA.......TAGATC (3，)(3，) CTAGAT.......ATCTAG (5，)通讀轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生進(jìn)行互補堿基配對的轉(zhuǎn)錄本，從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，只要在重復(fù)區(qū) 之間有34bp的間隔子?！稗D(zhuǎn)基因植物”是指含有遺傳操作或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的新遺傳物質(zhì)的植物。所述新遺傳物 質(zhì)可以源自與獲得的轉(zhuǎn)基因植物相同物種的植物或源自不同的物種。本發(fā)明的多核苷酸或多肽的術(shù)語“改變...的表達(dá)”和“改變的表達(dá)”預(yù)期包括以 下的情況其中對應(yīng)于本發(fā)明多核苷酸的基因組DNA被修飾，因此引起本發(fā)明的多核苷酸 或多肽的表達(dá)改變。對基因組DNA的修飾可以通過遺傳轉(zhuǎn)化或引入突變的技術(shù)領(lǐng)域中已知 的其它方法?！案淖兊谋磉_(dá)”可以與產(chǎn)生的信使RNA和/或多肽量的增加或減少相關(guān)，且由 于產(chǎn)生的多核苷酸和多肽序列的改變，還可以引起多肽活性的改變。申請人:已經(jīng)從黑麥草屬中鑒別了多核苷酸(SEQ ID NO :7)，其編碼調(diào)節(jié)植物中生 物量和/或?qū)χ辽僖环N選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激的耐受性的多肽(SEQ ID NO :1)。申請人還鑒別了 SEQ ID NO 7的多核苷酸變體(SEQ ID NO :8_12)，其編碼SEQ ID NO :1的多肽變體(SEQ ID NO :2-6)，所述變體調(diào)節(jié)植物中的生物量和對至少一種選自干 旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激的耐受性。申請人:已經(jīng)鑒別了 SEQ ID NO 1多肽中A20型和ANl型鋅指基序和每個多肽變體 的存在。申請人還鑒別了所有多肽序列和變體中在每個鋅指基序中完全保守的序列基序。本發(fā)明提供了相對于合適的對照植物，改變了生物量和對至少一種選自干旱、寒 冷、冰凍、熱或鹽分環(huán)境應(yīng)激的耐受性的植物。本發(fā)明提供了具有增加的生物量和應(yīng)激耐受 性的植物以及具有減少的生物量和應(yīng)激耐受性的植物。本發(fā)明還提供了用于制備或選擇這 樣的植物的方法。用于分離或制備多核苷酸的方法本發(fā)明的多核苷酸分子可以通過使用各種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離。 以舉例的方式，這樣的多核苷酸可以通過使用Mullis等人，Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction，BirWiauser (通過引用并入本文)中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離。 本發(fā)明的多肽可以使用本文定義的源自本發(fā)明的多核苷酸序列的引物擴(kuò)增。本發(fā)明的或在本發(fā)明方法中有用的分離多核苷酸的另外方法包括使用作為雜交 探針在本文中列出的多核苷酸的全部或部分。將標(biāo)記的多核苷酸探針雜交至固定在固體支持物如硝酸纖維素膜或尼龍膜上的多核苷酸的技術(shù)可以用于篩選基因組或cDNA文庫。示 例性雜交和洗滌條件為在5. OX SSC,0. 5%十二烷基硫酸鈉，IX Denhardt氏溶液中65°C 雜交20小時；在1. OX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉中洗滌(55°C洗滌三次，每次20分 鐘)，和可選地在0. 5X SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉中60°C洗滌一次(20分鐘)?？梢?在60°C 0. IX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸鈉的條件下進(jìn)行可選的進(jìn)一步洗滌(20分鐘)。本發(fā)明的多核苷酸片段可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)如限制性內(nèi)切酶消化和寡核 苷酸合成制備。部分多核苷酸序列可以用于本領(lǐng)域中熟知的方法從而鑒定相應(yīng)的全長多核苷酸 序列。這樣的方法包括基于 PCR 的方法、5，RACE (Frohman ΜΑ, 1993,Methods Enzymol. 218 340-56)和基于雜交的方法、基于計算機(jī)/數(shù)據(jù)庫的方法。另外，以舉例的方式，反向PCR 允許從基于已知區(qū)域的引物開始，獲得本文公開的多核苷酸序列旁側(cè)的未知序列(Triglia 等人，1998，Nucleic Acids Res 16，8186，通過引用并入本文)。所述方法使用幾個限制性 酶產(chǎn)生基因已知區(qū)域中的合適片段。然后所述片段通過分子內(nèi)連接被環(huán)化并用作PCR模 板。從已知區(qū)域設(shè)計不同的引物。為了物理上組裝全長克隆，可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法 (Sambrook等人,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987)。當(dāng)從特定物種中制備轉(zhuǎn)基因植物時，用序列或源自該物種的序列轉(zhuǎn)化這樣的植物 是有益的。益處可以是減輕公眾對產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物中跨物種轉(zhuǎn)化的關(guān)注。另外，當(dāng)基因的 下調(diào)是所需的結(jié)果時，必須使用與植物中的序列相同(或至少高度相似)的序列，對于所述 植物來說表達(dá)的降低是所需的。為了這些和其它原因，希望的是能夠鑒別和分離幾個不同 植物物種中特定基因的直系同源物。變體(包括直系同源物)可以通過所述方法鑒別。鑒別變體的方法物理方法變體多核苷酸可以使用基于PCR的方法鑒別(Mullis等人，Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser)。通常，用于擴(kuò)增變體多核苷酸分子PCR的引物 的多核苷酸序列可以基于編碼相應(yīng)氨基酸序列保守區(qū)的序列?；蛘呖梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的文庫篩選方法(Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press，1987)。當(dāng)鑒別探針 序列的變體時，相對于尋找當(dāng)完全序列匹配時，雜交和/或洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)度通常會降低。多肽變體還可以通過物理性方法鑒別，例如通過使用針對本發(fā)明多肽的抗體篩 3/^ (Sambrook ^ Α Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987)或通過這樣的抗體的幫助鑒別來自天然來源的多肽?；谟嬎銠C(jī)的方法還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基于計算機(jī)的方法，使用公共結(jié)構(gòu)域序列比 對算法和序列相似性搜索工具搜索序列數(shù)據(jù)庫(公共結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫包括Genbank、EMBL、 SwiSS-Pr0t、Pm和其它數(shù)據(jù)庫)鑒別多核苷酸和多肽變體。在線資源的例子見例如 Nucleic Acids Res. 29 :1_10和11-16，2001。相似性搜索取回并比對用于與待分析序列 (即查詢序列)比較的靶序列。序列比較算法使用得分陣列從而給每個比對分配總分。對鑒別序列數(shù)據(jù)庫中的變體有用的示例性程序家族是BLAST程序組(版本2. 2. 5 [Nov 2002])，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和 tBLASTX，可以從(ftp://ftp, ncbi.nih. Rov/blast/)或從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，國家醫(yī)藥圖書館，Building 38A，Room 8N805, Bethesda, MD 20894USA公開獲得。NCBI服務(wù)器還提供使用程序篩選公 開可獲得的序列數(shù)據(jù)庫成員的工具。BLASTN將核苷酸查詢序列與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較。 BLASTP將氨基酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比較。BLASTX將以所有閱讀框翻譯的核苷 酸查詢序列與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比較。tBLASTN將蛋白質(zhì)查詢序列與以所有閱讀框動態(tài)翻 譯的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較。tBLASTX將6個框翻譯的核苷酸查詢序列與6個框翻譯的核 苷酸序列數(shù)據(jù)庫比較。可以用缺省參數(shù)使用BLAST程序或可以根據(jù)需要改變參數(shù)從而細(xì)化 蹄選。BLAST 家族算法包括 BLASTN、BLASTP 和 BLASTX 的使用在 Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 的發(fā)表物中有描述。用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似的算法產(chǎn)生的用查詢序列進(jìn) 行的對一個或多個數(shù)據(jù)庫序列的“命中”，比對并鑒別序列的相似部分。以相似性的程度和 序列重疊的長度的順序安排命中。對數(shù)據(jù)庫序列的命中通常代表在只有查詢序列的一部分 序列長度上的重疊。BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 和 tBLASTX 算法還產(chǎn)生比對的“預(yù)期”值。所述 預(yù)期值(E)表明當(dāng)搜索含有隨機(jī)連續(xù)序列的相同大小的數(shù)據(jù)庫時，人們可以隨機(jī)“預(yù)期”見 到的命中數(shù)。預(yù)期值用作確定對數(shù)據(jù)庫的命中是否表明真正相似性的顯著性閾值。例如， 指定給多核苷酸命中的0. 1的E值被解釋為在所篩選的數(shù)據(jù)庫大小的數(shù)據(jù)庫中人們可以僅 通過隨機(jī)在具有相似得分的序列比對部分上預(yù)期見到0. 1的匹配。對于在比對和匹配部分 上具有 0. 01 或 0. 01 以下 E 值的序列，使用 BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 或 tBLASTX 算 法在該數(shù)據(jù)庫中通過隨機(jī)找到匹配的概率為或以下。相關(guān)序列群組的多重序列比對可以用使用漸進(jìn)的配對比對的 CLUSTALff (Thompson, J. D.，Higgins, D. G.和 Gibson, Τ. J. (1994)CLUSTALff improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22 :4673-4680, http://www-igbmc. u~strasbg. fr/BioInfo/Clustalff/ Top, html)或T-C0FFEE(Cedric Notredame,Desmond G. Higgins,Jaap Heringa,T-Coffee A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302 :205-217))或 PILEUP 進(jìn)行(Feng 和 Doolittle，1987，J. Mol. Evo 1. 25，351)?？梢垣@得用于找到基序或特征序列的式樣識別軟件的應(yīng)用軟件。例如MEME (探出 基序的多重Em)找到一套序列中的基序和特征序列，MAST(基序比對和搜索工具)使用這 些基序鑒定查詢序列中的相似或相同的基序。MAST結(jié)果作為帶有適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)和找到 基序的視覺概觀的一系列比對提供。MEME和MAST是圣地亞哥的加利福尼亞大學(xué)研發(fā)的。PR0SITE (Bairoch 禾口 Bucher，1994，Nucleic Acids Res. 22，3583 ；Hofmann 等人， 1999, Nucleic Acids Res. 27,215)是鑒別從基因組或cDNA序列翻譯的未知功能蛋白質(zhì)的 功能的方法。PR0SITE數(shù)據(jù)庫(www, expasy. orR/prosite)含有生物學(xué)上重要的式樣和圖譜 且被設(shè)計為可以與合適的計算工具一起使用從而給已知的蛋白質(zhì)家族分配新的序列或確 定哪個已知結(jié)構(gòu)域存在于所述序列中(Falquet等人，2002，Nucleic Acids Res. 30,235) Prosearch是可以用給定的序列式樣或特征搜索SWISS-PR0T和EMBL數(shù)據(jù)庫的工具。分離多肽的方法本發(fā)明的多肽包括變體多肽可以使用本領(lǐng)域熟知的肽合成方法如使用固相技術(shù) 的直接肽合成(例如 Mewart 等人，1969，in Solid-Phase Peptide Synthesis, WHFreeman Co, San Francisco California，或自動化合成例如使用 Applied Biosystems431A 肽合成 儀(Foster City,California)而制備。多肽的突變形式也可以在這樣的合成過程中制備。本發(fā)明的多肽和變體多肽還可以使用各種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從天然來源純 化(例如 Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification)?；蛘弑景l(fā)明的多肽和變體多肽可以在合適的宿主細(xì)胞中重組表達(dá)并從下面討論 的細(xì)胞中分離。制備構(gòu)建體和載體的方法本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體含有一個或多個本發(fā)明的多核苷酸序列和/或編碼本發(fā)明 多肽的多核苷酸，且可以用于轉(zhuǎn)化例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物。本發(fā)明的遺 傳構(gòu)建體預(yù)期包括本文定義的表達(dá)構(gòu)建體。制備和使用遺傳構(gòu)建體和載體的方法在本領(lǐng)域是熟知的且在Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987 ； Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing, 1987 中有 綜合描述。制備含有構(gòu)建體和載體的宿主細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了含有本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以源自例 如細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動物或植物生物。含有本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體如表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞可以用于本領(lǐng)域熟知的方法 (例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ；Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing，1987)，所述方法是為了重組制備本發(fā)明的多肽。這樣的方法可以包括在適于 或有助于表達(dá)本發(fā)明多肽的條件下在合適的介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。然后表達(dá)的重組多肽 (可以可選地分泌至培養(yǎng)物中)可以通過本領(lǐng)域熟知的方法從介質(zhì)、宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中 得至Ij分離(例如Deutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology,Vol 182,Guide to Protein Purification)。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以用于制備通過表達(dá)本發(fā)明多肽產(chǎn)生的酶產(chǎn)物的方法。這 樣的方法可以包括在適于表達(dá)本發(fā)明重組多肽的介質(zhì)中，可選地在存在用于本發(fā)明表達(dá)的 多肽的另外酶底物時，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。然后制備的酶產(chǎn)物可以通過各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 方法從宿主細(xì)胞或介質(zhì)中得到分離。制備植物細(xì)胞和含有構(gòu)建體和載體的植物的方法本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的植物細(xì)胞和經(jīng)修飾而改變本發(fā)明多 核苷酸或多肽表達(dá)的植物細(xì)胞。含有這樣細(xì)胞的植物也形成本發(fā)明的一個方面。改變了生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng)激耐受性的植物的制備可以通過本發(fā)明的方法實 現(xiàn)。這樣的方法可以包括用被設(shè)計為改變多核苷酸或多肽表達(dá)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物，所述多核苷酸或多肽能夠調(diào)節(jié)這樣的植物細(xì)胞和植物中的生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng)激的 耐受性。這樣的方法還包括用被設(shè)計為改變一個或多個多肽或多肽表達(dá)的構(gòu)建體的組合轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞和植物，所述多肽能夠調(diào)節(jié)這樣的植物細(xì)胞和植物中的生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng) 激的耐受性。用多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、植物和其部分的方法在Draper等人，1988，Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual. Blackwell Sci.Pub.Oxford, p. 365 ；Potrykus 禾口 Spangenburg，1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.；禾口 Gelvin 等人，1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht中有描述。對轉(zhuǎn)基因植物的綜述，包括轉(zhuǎn)化技術(shù)，在feilun和Breiman， 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London 中提 1"共。遺傳操作植物的方法可以獲得許多遺傳操作植物的對策(例如Birch，1997，Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol，48J97)。例如可以將對策被設(shè)計為增加在植物細(xì)胞、器官和/或其中多 核苷酸/多肽為正常表達(dá)的特定發(fā)育階段中多核苷酸/多肽的表達(dá)，或在細(xì)胞、組織、器官 和/或其中其不是正常表達(dá)的特定發(fā)育階段中異位表達(dá)多核苷酸/多肽。表達(dá)的多核苷酸 /多肽可以源自待轉(zhuǎn)化的植物物種或可以源自不同的植物物種。轉(zhuǎn)化對策可以被設(shè)計為降低植物細(xì)胞、組織、器官或其中多核苷酸/多肽為正常 表達(dá)的特定發(fā)育階段中的多核苷酸/多肽的表達(dá)。這樣的對策稱為基因沉默對策。表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物中基因的遺傳構(gòu)建體通常包括驅(qū)動一個或多個克隆的多核苷酸 表達(dá)的啟動子、終止子和檢測轉(zhuǎn)化的植物中遺傳構(gòu)建體存在的選擇性標(biāo)記序列。適用于本發(fā)明的構(gòu)建體中的啟動子在單子葉植物或雙子葉植物的細(xì)胞、組織或器 官中是有功能的且包括細(xì)胞、組織和器官特異性啟動子、細(xì)胞周期特異性啟動子、瞬時啟動 子、誘導(dǎo)型啟動子、在大多數(shù)植物組織中有活性的組成型啟動子和重組型啟動子。啟動子的 選擇將取決于克隆的所需多核苷酸的時間和空間的表達(dá)。啟動子可以是那些與目的轉(zhuǎn)基因 正常相連的啟動子，或源自其它植物、病毒和植物病原性細(xì)菌和真菌的基因的啟動子。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將無需過多的實驗而能夠選擇適用于使用含有本發(fā)明的多核苷酸序列的遺傳 構(gòu)建體修飾和調(diào)節(jié)植物性狀的啟動子。組成型植物啟動子的例子包括CaMV 35S啟動子、胭 脂堿合成酶啟動子和章魚堿合成酶啟動子和來自玉米的W^il啟動子。在特定組織中有活 性的對內(nèi)部發(fā)育信號或外部無生命或有生命的應(yīng)激應(yīng)答的植物啟動子在科學(xué)文獻(xiàn)中有描 述。示例性啟動子在例如WO 02/00894中有描述，通過引用并入本文。在植物轉(zhuǎn)化遺傳構(gòu)建體中常用的示例性終止子包括例如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S終止子、根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶或章魚堿 合成酶終止子、玉米(Zea mays)玉米蛋白基因終止子、水稻(Oryza sativa) ADP-葡萄糖焦 磷酸酶終止子和馬鈴薯(Solanum tuberosum)PI-II終止子。植物轉(zhuǎn)化中常用的選擇性標(biāo)記包括給予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II基因(NPT II)、給予壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因、用于Ignite(AgrEvo)和 Basta(Hoechst)抗性的草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶(bar基因)和用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶基因(hpt)。還考慮到使用含有可以用于植物和植物組織中啟動子表達(dá)分析的報告基因(表達(dá)對于宿主來說是外來的活性，通常是酶活性和/或可見信號(例如熒光素酶、GUS、GFP)的 編碼序列)的遺傳構(gòu)建體。報告基因的文獻(xiàn)在Herrera-Estrella等人，1993，Nature 303， 209，禾口 Schrott，1995，In :Gene Transfer to Plants (Potrykus, Τ. , Spangenbert. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336 中有綜述?；虺聊瑢Σ呖梢约杏诨虮旧砘蛴绊懢幋a的多肽表達(dá)的調(diào)控元件?！罢{(diào)控元 件”以最廣泛的可能意義用于本文并包括與目的基因相互作用的其它基因。被設(shè)計為降低或沉默本發(fā)明多核苷酸/多肽表達(dá)的遺傳構(gòu)建體可以包括本發(fā)明 多核苷酸的反義拷貝。在這樣的構(gòu)建體中，將多核苷酸置于相對于啟動子和終止子的反義 方向中。“反義”多核苷酸通過反轉(zhuǎn)多核苷酸或多核苷酸的區(qū)段獲得以便產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本與 基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本互補，例如5，GATCTA 3，(編碼鏈) 3，CTAGAT 5，(反義鏈)3，CUAGAU 5，mRNA5，GAUCUCG 3，反義 RNA為基因沉默設(shè)計的遺傳構(gòu)建體還可以包括反向重復(fù)序列?！胺聪蛑貜?fù)序列”是重復(fù) 的序列，其中重復(fù)的第二半在在互補鏈中，例如5，GATCTA.........TAGATC-3，3，CTAGAT.........ATCTAG-5，形成的轉(zhuǎn)錄本可以進(jìn)行互補性堿基配對從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。通常需要重復(fù)區(qū)之間 至少3^bp的間隔子以便允許發(fā)夾形成。另一個沉默方法包括使用與miRNA等同的靶向轉(zhuǎn)錄本的小反義RNA(Llave等人， 2002，Science 297,2053).明確地考慮到使用對應(yīng)于本發(fā)明的多核苷酸的這樣的小反義 RNA。本文使用的術(shù)語遺傳構(gòu)建體還包括小反義RNA和對引起基因沉默有用的其它這 樣的多核苷酸。用本文定義的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化還可以通過稱為正義抑制的過程引起基因沉默 (例如Napoli 等人，1990，Plant Cell 2,279 ；de Carvalho Niebel 等人，1995，Plant Cell, 7,347)。在一些情況下，正義抑制可以包括整個或部分編碼序列的過表達(dá)，但還可以包括基 因的非編碼區(qū)如內(nèi)含子或5’或3’非翻譯區(qū)(UTR)的表達(dá)。嵌合的部分正義構(gòu)建體可以 用于協(xié)調(diào)沉默多個基因(Abbott 等人，2002，Plant Physiol. 128(3) :844-53 Jones 等人， 1998,Planta 204 :499-505)。還考慮到使用這樣的正義抑制對策沉默本發(fā)明多核苷酸的表 達(dá)。為基因沉默設(shè)計的遺傳構(gòu)建體中的多核苷酸插入物可以對應(yīng)于編碼序列和/或 非編碼序列，如啟動子和/或內(nèi)含子和/或5’或3’ UTR序列，或相應(yīng)的基因。其它的基因沉默對策包括顯性負(fù)性方法和使用核酶構(gòu)建體(McIntyre，1996， Transgenic Res,5,257)。轉(zhuǎn)錄前沉默可以通過基因本身或其調(diào)控元件的突變引起。這樣的突變可以包括點 突變、移碼、插入、刪除和置換。下列是公開可以用于遺傳轉(zhuǎn)化下列植物物種的遺傳轉(zhuǎn)化規(guī)程的代表性發(fā)表物 稻(Alam 等人，1999，Plant Cell Rep. 18,572)；玉米(美國專利系列號5，177，010 和5, 981, 840)；小麥(Ortiz 等人，1996，Plant Cell Rep. 15, 1996, 877)；番茄(美國專利 系列號 5，159，135)；馬鈴薯(Kumar 等人，1996Plant J. 9，:821)；木薯(Li 等人，1996 Nat. Biotechnology 14，736)；萵苣(Michelmore 等人，1987，Plant Cell Rep. 6,439)； 煙草(Horsch等人，1985，Science 227，1229)；棉花(美國專利系列號5，846，797和 5，004，863)；草(美圍專利號 5，187，073 和 6. 020，539)；歐薄荷(Niu 等人，1998，Plant Cell Rep. 17，165)；柑橘植物(Pena 等人，1995，Plant Sci. 104,183)；葛縷子(Krens 等 人，1997，Plant Cell Rep, 17, 39)；香蕉(美國專利系列號5，792，935)；大豆(美國專利 號 5，416，011 ；5，569，834 ；5，824，877 ；5，563，04455 和 5，968，830)；菠蘿(美國專利系列號 5, 952, 543)；白楊(美國專利號4，795，855)；一般的單子葉植物(美國專利號5，591，616 和6，037，522)；蕓苔(美國專利號5，188，958 ；5, 463，174和5，750，871)；谷類(美國專利 號 6，074，877)；和黑麥草(Bajaj 等人，2006，Plant Cell Reports, 25 :651-659) 考慮到 其它的物種并且合適的方法和規(guī)程可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的科學(xué)文獻(xiàn)中獲得?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的幾個另外的方法改變本發(fā)明的核苷酸和/或多肽的表 達(dá)。這樣的方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003，Methods Mol Biol，2%，205)，所 謂的“Deletagene”技術(shù)(Li等人，2001，Plant Journal 27(3),235)和使用人工轉(zhuǎn)錄因子 如合成鋅指轉(zhuǎn)錄因子。(例如Jouvenot等人，2003，Gene Therapy 10，513)。靶向特定多 肽的另外抗體或其片段還可以在植物中表達(dá)從而調(diào)節(jié)該多肽的活性(Jobling等人，2003， Nat. Biotechnol. ,21(1),35).還可以應(yīng)用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽方法。與本發(fā)明的多肽相互作用的 另外的肽可以通過技術(shù)如相顯示(Dyax Corporation)得到鑒別。這樣的相互作用的肽可 以表達(dá)在植物中或應(yīng)用于植物從而影響本發(fā)明多肽的活性。特別考慮到將每個上面的方法 用于改變本發(fā)明的核苷酸和/或多肽的表達(dá)。選擇植物的方法還提供了選擇具有改變的生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng)激耐受性的植物的方法。這樣的 方法包括測試用于改變本發(fā)明多核苷酸或多肽表達(dá)的植物。當(dāng)改變的生物量和/或?qū)Νh(huán)境 應(yīng)激的耐受性可以不必是明顯時，這樣的方法可以應(yīng)用于年幼或早期發(fā)育的階段從而加快 針對改善生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng)激耐受性的培育程序。多核苷酸如信使RNA的表達(dá)通常用于相應(yīng)多肽表達(dá)的指示劑。測定多核苷酸 表達(dá)的示例性方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和點印跡分析(Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Fd. Cold Spring Harbor Press,1987)。 因此本發(fā)明的多核苷酸或多核苷酸的部分可以在鑒別具有對環(huán)境應(yīng)激改變的耐受性的植 物的方法中用作本文定義的探針或引物。本發(fā)明的多肽可以用作雜交實驗中的探針或用作 被設(shè)計為鑒別這樣植物的基于PCR實驗中的引物。或者可以針對本發(fā)明的多肽產(chǎn)生抗體。產(chǎn)生和使用抗體的方法在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn) 的(見例如Antibodies,A Laboratory ManualiHarlow A Lane，Eds，Cold Spring Harbour Laboratory, 1998)。這樣的抗體可以用于檢測調(diào)節(jié)植物中對環(huán)境應(yīng)激耐受性的多肽改變表 達(dá)的方法中。這樣的方法可以包括 ELISA(Kemeny，1991，A Practical Guide to ELISAiNY Pergamon Press)禾口 Western 分析(Towbin & Gordon，1994，J Immunol Methods，72，313)。分析多核苷酸或多肽表達(dá)和選擇具有改變表達(dá)的植物的這些方法可以用于被設(shè) 計為產(chǎn)生具有改變的生物量和/或?qū)Νh(huán)境應(yīng)激耐受性的品種的常規(guī)培育程序中。
植物本發(fā)明的植物可以生長且自交或與不同植物品系雜交，具有所需表型特征的獲得 的雜交體可以得到鑒別?？梢陨L兩代或兩代以上以保證所述表型特征得到穩(wěn)定的保持和 遺傳。從這樣的標(biāo)準(zhǔn)培育方法獲得的植物還形成本發(fā)明的一個方面。還廣泛地說本發(fā)明由單獨或共同地在本申請的說明書中提及或表明的部分、元素 和特征和任意兩個或兩個以上所述部分、元素或特征或其所有組合組成，在特定整體在本 文(具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的已知等同物)被提及的地方，這樣的已知等同物被認(rèn)為并入 本文，就如同單獨列出一樣。實施例參考下列非限制性實施例現(xiàn)在將說明本發(fā)明。實施例1 調(diào)節(jié)生物量產(chǎn)生和對環(huán)境應(yīng)激耐受性的多核苷酸的鑒別介紹多年生黑麥草(Lolium perenne L.)是來自禾本科家族和!^estucaceae族的冷溫 帶牧草。為了產(chǎn)生黑麥草中基因相對表達(dá)式樣的圖譜，從獲自秋季、夏季、春季和冬季中環(huán) 境溫度生長、寒冷生長、水化的、脫水的和再水化的或脫水的預(yù)放牧和后放牧植物中獲得的 樣品中提取RNA并用于構(gòu)建SAGE(基因表達(dá)的系列分析)(Velculescu等人1995，Science 270 :484-487)文庫。材料和方法在本研究中貫穿使用多年生黑麥草(Lolium perenne L.)的培育變體(cv.) Bronsyn0田地生長的樣品在每個季節(jié)的高峰過程中從新西蘭漢米爾頓Dexcel的活躍小牧 場收集。草樣品從預(yù)放牧的(放牧后15天)和后放牧的(放牧后1天)的黑麥草草地中 收集。草叢樣品從3-6個隨機(jī)選擇的地點收獲并用液氮速凍后儲存在干冰中。在春季，還 收獲未成熟的穗和花原基(floral initials) 0為了應(yīng)激處理，對實驗室生長的黑麥草使 用了下列條件在85% RH, 200C /18°C和16h/^h白天/黑夜方案下生長在生長室中15個 月的實驗室生長的成熟多年生黑麥草；85% RH, 200C /18°C和16h/^h白天/黑夜方案下生 長55天的加水對照；70% RH, 220C /16°C和16h/ i白天/黑夜方案下生長6天，在秧苗的 整個生命中對其保持加水；脫水樣品在85% RH, 200C /18°C和16h/^h白天/黑夜方案下只 加水55天；70% RH, 280C /20°C和16h/8h白天/黑夜方案下為3天；50% RH, 28°C /20°C和 16h/8h白天/黑夜方案下為3天；再水化的樣品來自加水M小時并在70% RH, 220C /16°C 和16h/ i白天/黑夜方案下生長的脫水植物；寒冷應(yīng)激的植物在85% RH, 200C /18°C和 16h/8h白天/黑夜方案下生長55天；在70% RH, 220C /16°C和16h/ i白天/黑夜方案下 為7天；在70% RH, 60C /TC和16h/ i白天/黑夜方案下為7天，在秧苗的整個生命中對 其保持加水。SAGE文庫的構(gòu)建使用TRIZOI 試劑(Invitrogen，CA, USA)并通過制造商描述的規(guī)程從液氮中 磨碎的組織中提取RNA。對于每個SAGE文庫，使用IOOyg總RNA，并使用I-SAGE 或 I-SAGE Long試劑盒(Invitrogen，CA, USA)根據(jù)制造商的規(guī)程創(chuàng)建文庫。從每個文庫 中，對 960-1，920 個克隆進(jìn)行測序(Australian Genome Research Facility, Brisbane, Australia)且使用SAGE2000軟件提取標(biāo)簽。
SAGE生物信息學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫被設(shè)計為保留SAGE實驗的標(biāo)簽、文庫和表達(dá)計數(shù)。將每個標(biāo)簽序 列(包括酶的序列)對整個黑麥草無重疊基因剝離庫(Gene thresher)和EST集合進(jìn)行搜 索。以兩個方向進(jìn)行搜索并只使用完全匹配。使用General Feature format (GFF)方法 (http //www3. ebi. ac. uk/Services/ffebFeat)將結(jié)果加載至相關(guān)的數(shù)據(jù)庫中。使用對一些或所有下列公共和適當(dāng)數(shù)據(jù)庫的同源性搜索，注釋所有的黑麥草基因 剝離庫和EST序列。AGI TIGR 基因目錄，擬南芥(Arabidopsis)，版本 11，2004 年 1 月OGI TIGR基因目錄，稻，版本14-1，2004年1月GENESEQN德溫特專利DNA序列2002年12月7日GENESEQP德溫特專利氨基酸序列2002年12月7日Os_unigene /Jcfg (Oryza sativa) Unigene Ι—·歹Ij 2004 ip 3 ^ 18 Hest_others其它EST序列(哺乳動物、真菌、原核生物)2003年3月11日est_plant GenBank+EMBL+DDBJ EST 分區(qū)的非冗余數(shù)據(jù)庫的 Viridiplantae 亞群 2004年3月15日nr 所有非冗余 GenBank CDS 翻譯物 +PDB+SwissProt+PIR 2003 年 3 月 11 日nr_plant 所有非冗余 GenBank CDS 翻譯物 +PDB+SwissProt+PIR 的 BT 亞群的 HS 亞群的植物亞群2003年8月8日nt 所有非冗余 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 序列(但沒有 ESY，STS, GSS 或 HTGS 序 列)2003年3月11日nt_monocots所有非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列的單子葉植物亞群(但沒 有 EST，STS, GSS 或 HTGS 序列)2003 年 3 月 11 日swissprot SWISS-PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的最后主要版本(無更新)2003年3月 28日使用E-05以下的E值界限值，將每個數(shù)據(jù)庫最多10個靶向儲存在相關(guān)的數(shù)據(jù)庫 中。標(biāo)簽注釋通過創(chuàng)建對涉及序列的所有注釋的總結(jié)而注釋具有命中黑麥草集合的標(biāo)簽。使用 計算每個單詞在注釋中出現(xiàn)頻率的算法產(chǎn)生總結(jié)并基于出現(xiàn)的數(shù)目以降序?qū)⑵渑帕?。將?結(jié)限制為10個單詞，使用無單詞(void word)列表過濾掉不重要信息。獲得的總結(jié)線用 作哪個標(biāo)簽有可能是的指示。顯示了實際的數(shù)目；給出可以用于評估每個單詞在總結(jié)中的 重要性的附加信息。使用關(guān)鍵詞計數(shù)的該自動注釋方法與注釋自動產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域 家族的 ProDom 數(shù)據(jù)庫(在世界范圍的網(wǎng)站 http://protein. toulouse. inra. fr/prodom/ current/html/home, php 可以獲得)使用的自動評注(Automatic comment)相似。當(dāng)觀看標(biāo)簽數(shù)據(jù)時，顯示了基于涉及序列的最高命中的詳細(xì)注釋。特別感興趣的多核苷酸序列通過對推定的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多核苷酸序列(其具有 脫水多年生黑麥草SAGE文庫專屬的SAGE標(biāo)簽)的BLASTX分析而鑒別。分析引起鋅指樣 蛋白質(zhì)基因0RF136的鑒別。0RF136的cDNA顯示在SEQ ID NO :7中。0RF136編碼序列從 核苷酸位置88延伸至核苷酸位置576。我們SAGE文庫中的轉(zhuǎn)錄圖譜是
SAGE 標(biāo)簽 CCTGCGGCAG (SEQ ID NO 13)的數(shù)據(jù)
SAGE—標(biāo)簽CCTGCGGCAGtpm *冬季預(yù)放牧00冬季后放牧00冬季的根00春季預(yù)放牧00春季后放牧00開花00夏季后放牧00秋季預(yù)放牧00秋季后放牧00成熟00寒冷應(yīng)激00水化的00脫水的159再水化的00*tpm =每一百萬標(biāo)簽的標(biāo)簽計數(shù)下列引物用于擴(kuò)增0RF136(基于 CLP0023004352-cF3_20040205) 827_ 0RF136_f AAGCCAGCCAGACTCTCTCTCGTACC (SEQ ID NO 14) 828_0RF136_r GCACCTTCAGTTTCCTCCGTTCATTC(SEQ ID NO 15)實施例2 =ORFl36變體的鑒別將0RF136多核苷酸序列作為種子序列對DGenBank核苷酸采集NR/NT數(shù)據(jù)庫 (v2. 2. 17發(fā)行日期2007年8月26日)和ii)專利序列數(shù)據(jù)庫(v2. 2. 17發(fā)行日期2007年 8月26日)進(jìn)行不連續(xù)大比對(megablast)BLASTN搜索。用0RF136編碼的多肽序列用作種子序列對GenBank NR數(shù)據(jù)庫(v2. 2. 17發(fā)行 日期2007年8月洸日)進(jìn)行位置特異性重復(fù)BLASTP搜索。還對EBI上的UniReflOO 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(v2.2. 15發(fā)行日期2006年10月15日)進(jìn)行了 USPTO搜索。該基因似乎 編碼以低同源性與稻應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)基因相似的蛋白質(zhì)，如(Mukhopadhyay等人，2004，PNAS(USA) 101 (16) :6309-6314)所述。使用EMBOSS 工具 EMMA (Thompson，J. D.，Higgins, D. G. and Gibson, Τ. J. 1994， CAB I OS, 10，19-29.)比對變體序列，EMMA是流行的多重比對程序ClustalW的界面。比對的 序列使用另一個稱為prettyplot的EMBOSS工具(在分開的行中用標(biāo)記的著色和共有序列 顯示比對的序列)觀看。比對顯示在圖5中。圖5中比對的0RF136和變體蛋白質(zhì)似乎是鋅指轉(zhuǎn)錄因子，且通過蛋白質(zhì)N末端 一半中的 A20 型鋅指(pfam017M = X3-C-X(2-4)-C-Xll-C-X2-C_X2，其中 X 可以是任意氨 基酸；Marchler-Bauer A，等人，2007，Nucleic Acids Res. 35 :D237-40)基序和蛋白質(zhì) C 末端一半中的 ANl 型鋅指基序(cl01438 = C-X2-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C 其中 X 可以是任意氨基酸；Marchler-Bauer A，等人，2007，Nucleic Acids Res. 35 D237-40)的存在得到鑒別。0RF136蛋白質(zhì)中A20型基序的范圍突出顯示在圖5中。來自0RF136的A20基序 的序列顯示在SEQ ID N0:16中。該基序在所有的變體中很保守，25個殘基中的20個完全 保守。申請人還鑒別了所有比對序列中完全保守的A20型內(nèi)的基序。該完全保守的基序的 位置顯示在圖5中，序列顯示在SEQ ID NO 17中。ORF136蛋白質(zhì)中ANl型基序的范圍突出顯示在圖5中。來自0RF136的ANl型基 序的序列顯示在SEQ ID N0:18中。該基序在所有的變體中很保守，33個殘基中的23個完 全保守。申請人還鑒別了所有比對序列中完全保守的Am型內(nèi)的基序。該完全保守基序的 位置顯示在圖5中，序列顯示在SEQ ID NO 19中。圖5中比對的蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)生圖顯示在圖6中。通過使用歐洲生物信息學(xué)研究所網(wǎng)址上ClustalW序列分析工具中的缺省參數(shù)組 (http//www, ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/)比對 SEQ ID NOs 1-6 產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生圖。實施例3 用于植物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化植物的含有本發(fā)明多核苷酸的載體的制備含有ORF136 (C0RF136 和 DORF136)的載體用于過表達(dá)0RF136的載體通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)制備。其中0RF136用雙 35S啟動子驅(qū)動的載體被指定為C0RF136。其中黑麥草脫水素樣啟動子驅(qū)動0RF136的載體 被指定為DORF136。(C0RF136)的圖顯示在圖1中。CORF136的序列顯示在圖3中和SEQ ID NO :20中。DORF136的圖顯示在圖2中。D0RF136的序列顯示在圖4和SEQ ID NO 21中。用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物多年生黑麥草(Lolium perenne L.培養(yǎng)的變種Impact)基本上如Bajaj等人 (Plant Cell R印orts，2006，25 :651-659)所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。源自所選黑麥草系分蘗的分生 區(qū)的胚胎發(fā)生愈傷組織和攜帶修飾的二元載體(C0RF136，圖1或D0RF136，圖2)的根瘤土 壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101用于轉(zhuǎn)化實驗。連續(xù)搖動下用生長過 夜的土壤桿菌培養(yǎng)物浸泡胚胎發(fā)生的愈傷組織30分鐘。在共同培養(yǎng)的培養(yǎng)基中將愈傷組 織傳代培養(yǎng)4周后選擇對潮霉素有抗性的愈傷組織。選擇后，每2周將抗性愈傷組織在再 生培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)直到再生出植物。在兩輪或三輪選擇后持續(xù)生長的再生物被證明是穩(wěn) 定的轉(zhuǎn)化體。然后每個再生的植物在維持培養(yǎng)基上繁殖從而產(chǎn)生克隆的小植物并隨后無需 激素在MS培養(yǎng)基上生根。來自每個克隆的生根植物被轉(zhuǎn)移進(jìn)入受控制的溫室條件，而將克隆的對應(yīng)物保留在組織培養(yǎng)中作為備份。17個獨立的轉(zhuǎn)基因系(7ael至7ael7，還分別被 描述為D0RF136-1至D0RF136-17)已經(jīng)在控制氣候的環(huán)境實驗室中得到分析，其中在完全 加水的條件下評估其生物量。也對這些系的分開的克隆進(jìn)行了干旱應(yīng)激。通過Southern印跡進(jìn)行的雜交基因組DNA從多年生黑麥草的轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化的對照系中分離。從每個系中收獲 大約1. 5g的葉片和假莖材料。用液氮將組織在研缽及研杵中磨碎成粉末并于_80°C儲存 在 50mL 管中直到提取?；旧先?Doyle 和 Doyle，1990 (Doyle J.J.和 Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12 :13-15)所述從制備的組織中分 離DNA。提取的DNA在800 μ 1 TE中重懸，并使用Nanodrop NlOOO估計濃度。用限制性酶EcoRV和SpeI消化大約25 μ g的基因組DNA。用100 μ 1反應(yīng)體積中 40個單位的限制性酶在37°C消化DNA過夜。12小時孵育后加入另外20個單位的酶并消化 另外2小時。然后消化的反應(yīng)物用乙醇沉淀、離心，棄去上清液、空氣干燥并重懸于25 μ 1 dH20中用于電泳。使用IxTAE電泳緩沖液在IOxlkm瓊脂糖凝膠上以45伏分離電泳消化的 DNA樣品大約4小時。電泳后將凝膠變性(1. 5M NaCl，0. 5M NaOH)然后在使用供應(yīng) 商(GE Healthcare, Buckinghamshire, England)所述的堿法毛細(xì)管轉(zhuǎn)移至正電荷的 尼龍膜(Hybond N.)上前中禾口 (1. 5MNaCl，0. 5M Tris-base)。根據(jù)制造商的建議使用 Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, USA)將轉(zhuǎn)移的 DNA 固定至膜上。在 4°C將膜儲 存在塑料袋中的印跡紙之間直到需要。使用摻入了堿不穩(wěn)定的地高辛-ll_dUTP(DIG，Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)的基于PCR的標(biāo)記反應(yīng)合成DNA探針。使用Bajaj等人2006 (Plant Cell Reports)所述的引物 rghlcpf (5' -3，，AATACGAGGTCGCCAACATCT, SEQ ID NO 22)和 rghcpr(5' -3’，AGGAACCCTAATTCCCTTATCTG，SEQ ID NO 23)從潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因中擴(kuò) 增模板DNA。使用DIG Easy Hyb 試劑盒(Roche Diagnostics,Basel, Switzerland)在 42°C預(yù) 雜交尼龍膜1小時。將DIG標(biāo)記的探針變性(95°C，5分鐘)并加入預(yù)雜交溶液，在42°C雜 交膜大約12小時。雜交后，以搖動在室溫低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌緩沖液(hSSC，0. 1 % SDS(w/v))中將膜進(jìn)行 兩次5分鐘的洗滌，然后是高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌緩沖液(0. IxSSC,0. 1% SDS(w/v))中兩次15分 鐘的洗滌。進(jìn)一步的洗滌使用DIG和洗滌與阻斷緩沖組合(Wash and Block Buffer Set, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) iiif。 MMfflLS—DIG—AP 白勺^# (Roche Diagnostics,Basel, Switzerland)在室溫用阻斷溶液孵育膜30分鐘。然后通過應(yīng)用堿性 磷酸酶的CDP-Mar (Roche Diagnostics,Basel, Switzerland)化學(xué)發(fā)光底物檢測雜交的探 針。將膜熱封在塑料袋中，在X射線膠片(Kodak BioMax MS, Rochester,New York)上曝光 范圍為60分鐘至過夜以及在lOOPlus自動顯影儀中曝光。圖11中的結(jié)果顯示每個0RF136轉(zhuǎn)基因事件(標(biāo)記為TAE1-9、TAE12-15和 TAE17 [注意在這里 0RF138 = 0RF136])是 P D0RF136T-DNA 的轉(zhuǎn)基因。實施例4 用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物中對環(huán)境應(yīng)激耐受性的改變生長室中的干旱篩選
植物生長系統(tǒng)由一米長90mm直徑的塑料暴雨水管建成。將管置于移動支架上并 用繩子和金屬框支撐在側(cè)面。用石棉填塞管的底部并用水漸進(jìn)地填充洗滌過的灰漿用沙以 獲得均一的填塞。在每個管開口端的中心，種植多年生黑麥草叢(25個分蘗)。有三個獨 立的轉(zhuǎn)基因事件，將每個事件種植在6個管中。將植物隨機(jī)安排，六個重復(fù)中的每個中有一 個，在70%相對濕度、16/8小時白天/黑夜周期和650μπιΟ1.πΓ2. s—1光強度下生長。在早 晨用50mL Hoagland氏溶液(Hoagland和Arnon，1938)灌溉植物每日一次，用50mL單純的 水在下午再灌溉一次。最初使植物適應(yīng)14天(圖7)，然后將植物修剪回15cm的高度。允 許所有的植物從修剪中恢復(fù)另外7天。在這一恢復(fù)期后，通過不應(yīng)用Hoagland氏溶液和水 只給6個重復(fù)中的3個加上干旱應(yīng)激。在干旱篩選中，對所有的植物進(jìn)行50%相對濕度、 16/8小時白天/黑夜周期和650 μ mol.nT2. s—1光強度。當(dāng)沙質(zhì)土中的容積含水量為以 下(12cm深)時，在第一輪中將干旱應(yīng)激進(jìn)行8天。對照和水化的植物中的容積含水量為 10%以上(12cm深)。停止干旱應(yīng)激并對干旱應(yīng)激的植物重新開始灌溉。所有的植物還回 復(fù)至70%相對濕度、16/8小時白天/黑夜周期和650 μ mol. m_2. s-1光強度。四天后(圖8)， 測定植物的高度，然后修剪至15cm高度。測定經(jīng)修剪的樣品的鮮重，將樣品干燥。在完全 加水的條件下允許植物生長總共14天，再進(jìn)行干旱應(yīng)激14天。將這一周期進(jìn)行3次，在第 三次周期中，干旱的時間為21天。土壤濕度監(jiān)測作為需要使用田地kout TDR 100 土壤濕度計量儀(Spectrum Technologies, Inc.，IL, USA)記錄土壤濕度(VWC，容積含水量)。從12cm深的每個管中取測定物且記錄 三個讀數(shù)的平均值。培植期(establishment period)后，切斷地下灌溉。土壤濕度含量降 低并達(dá)到1.0%以下的容積含水量(VWC)。無灌溉期后是再生長期。地上生物量測定干旱應(yīng)激前(> 10% VffC)和后(< 1. 0% VffC)葉剪取物的干重。以15cm剪 取物重量切割所有的葉子。立即測定葉子的鮮重(FW)，然后將葉子在60°C干燥96小時，并 測定干重(DW)。在干旱應(yīng)激下生長的能力計算為反質(zhì)量損失的百分比，其被計算為相對于 非應(yīng)激條件下的鮮重，非應(yīng)激和干旱應(yīng)激條件中鮮重的差別，即(1_[{非應(yīng)激條件中的鮮 重(或干重)_干旱應(yīng)激條件中的鮮重(或干重)}/非應(yīng)激條件中的鮮重(或干重)])%。轉(zhuǎn)基因植物比對照植物在水化和干旱應(yīng)激條件中生長更旺盛(圖9和10)。它們 還比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ栈謴?fù)得更好。轉(zhuǎn)基因系D0RF136-12(7ael2)和15(7ael5)中植物生物量 的增加在干旱和恢復(fù)中即整個實驗過程中比對照顯著地更高(圖9)。當(dāng)分析這些植物在非 應(yīng)激條件中的生長時，其比對照表現(xiàn)得更好(圖10)。實施例5 用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物生物量的改變還對完全水化條件下的轉(zhuǎn)基因和野生型植物進(jìn)行了實施例4所述的過程。在每 個收獲中幾個轉(zhuǎn)基因系比野生型植物產(chǎn)生更多的生物量(基本上如實施例4中所述)。當(dāng) 在四個收獲期中測定累積生長時，系D0RF136-5、12和15持續(xù)產(chǎn)生比相應(yīng)對照(非轉(zhuǎn)基因 系)系D0RF136-5(7ae5)、7(7ae7)和15(7ael5)更多的生物量，例如顯示超過非轉(zhuǎn)基因系 的250-300%生物量的增加(圖10)。實施例6 用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物種子產(chǎn)量的改變控制條件下轉(zhuǎn)基因種子的制備
春化處理前，通過規(guī)律的微組織繁殖法將植物保持在組織培養(yǎng)中。將每個獨立 轉(zhuǎn)化系的單個無性系分株轉(zhuǎn)移至PC2控制溫室。建立的植物曾經(jīng)生長在PB3/4塑膠袋中 的一般目的盆栽培養(yǎng)基中(60 40泥炭沙)。以每周間隔應(yīng)用葉茂盛肥料(Yates New Zealand, Auckland)。以常規(guī)基礎(chǔ)將植物修剪至大約40mm的高度以防止開花。栽培變種 Impact (登錄號 A10745,Margot Forde Germplasm Centre, Palmerston North, New Zealand)的基因型作為制備與原代(Ttl)轉(zhuǎn)基因物受控雜交的雜交伴侶生長。當(dāng) 植物即轉(zhuǎn)基因系和雜交伴侶發(fā)育了最少20個分蘗時，開始春化處理。將植物從溫室中移至 6°C和8小時光周期的冷室中12周時間。用400w SonT農(nóng)業(yè)高壓鈉燈(Philips Lighting, Mairangi Bay, Auckland, New Zealand) 共JM_。春化處理后將花誘導(dǎo)的植物返回溫室Q0-25°C，16小時光周期)以便發(fā)育花蘗。 花序莖在3-4周生長后從分蘗中出現(xiàn)。來自原代轉(zhuǎn)基因物和雜交伴侶的平衡匹配發(fā)育階段 的多達(dá)8個花序莖在花藥或小花柱頭出現(xiàn)前在聚酯雜交袋中結(jié)合。雜交袋保留在植物上大 約三個月直到觀察到花序莖的枯萎。在這一階段，將每個雜交伴侶的花序分別收獲至紙袋 中并在的烘箱中孵育兩周。通過在種子磨粉機(jī)的兩個波狀橡膠表面之間研磨從收獲材料的小花中分離種子。 通過穿過種子篩，從種子中去除大的谷殼。最后種子在南達(dá)科他種子鼓風(fēng)機(jī)(Seedburo Equipment Co. , Chicago, USA)中得到清潔。計數(shù)并稱重從單個雜交中收獲的種子。T1代苗中T-DNA的分離使用為擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的片段而設(shè)計的引物通 過PCR確定。通過苗轉(zhuǎn)基因T1后代和Impact (A10745)基因型的受控雜交使用如上所述規(guī) 程進(jìn)行T2R種子的制備。見從收集的Ttl和T1系，對每個系進(jìn)行稱重和培
表1 來自單拷貝插入轉(zhuǎn)基因系的Ttl植物中的禾
雌性親代I^ollon 供體收集的種子
7AE1A107450
A107457AE12
7AE4A10745119
A107457AE4280
7AE5A1074564
A107457AE5136
7AE5A1074584
A107457AE5146
7AE7A107451
A107457AE70
7AE8A1074513
A107457AE821
7AE13A1074515
A107457AE130
7AE15A1074572
A107457AE15358
7AE17A10745 20A107457AE17451在花藥或小花柱頭出現(xiàn)前，在平衡匹配發(fā)育階段，來自原代轉(zhuǎn)基因系和種子衍生 的非轉(zhuǎn)基因雜交伴侶的花序莖在聚酯雜交袋中結(jié)合。雜交袋保留在植物上直到觀察到花序
莖的枯__。在這一階段，分別收獲每個雜交伴侶的花序，種子在保溫箱中另外干燥后收獲。
表2 來自單拷貝插入轉(zhuǎn)基因系的T1代中的種子產(chǎn)量
T1系種子平均數(shù)/每個植物平均種子產(chǎn)量(g)/植物
7AE43630. 6182
7AE52050. 3496
7AE81370. 233
7AE131440. 2443
7AE152110. 3588
7AE17250. 0425
ORF138平均1810.3077
轉(zhuǎn)基因?qū)φ?610.1036
轉(zhuǎn)基因?qū)φ?1190.2035
轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄?00. 154
在花藥或小花柱頭出現(xiàn)前，在平衡匹配發(fā)育階段，來自每個轉(zhuǎn)基因后代植物的花
序莖在聚酯雜交袋中與不同種子衍生的非轉(zhuǎn)基因雜交伴侶的花序莖結(jié)合。雜交袋保留在植 物上直到觀察到花序莖的枯萎。在這一階段，將兩種雜交伴侶的花序莖收獲在一起，種子在 保溫箱中另外干燥后收獲。除了只產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因后代植物的僅有的轉(zhuǎn)基因事件7AE8，每 個轉(zhuǎn)基因事件的種子產(chǎn)量從來自多于三個轉(zhuǎn)基因后代植物和其各自雜交伴侶的種子產(chǎn)量 的平均計算得到。將種子產(chǎn)量數(shù)據(jù)與來自緣于用不同基因的黑麥草植物轉(zhuǎn)化的兩個不同的 轉(zhuǎn)基因事件后代植物雜交中的平均種子產(chǎn)量相比。用0RF136( = 0RF138)轉(zhuǎn)化的T1植物中的增加種子產(chǎn)量的圖解表示(取自上面 表2中的平均數(shù)據(jù))顯示在圖12中。上面的實施例說明了本發(fā)明的實施。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是不背離本發(fā)明 的精神和范圍可以做出許多變化和修改。序列的總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種編碼具有序列SEQ ID NO :1的多肽或其變體的分離的多核苷酸，其中變體是能 夠調(diào)節(jié)植物中至少一種下列性狀的多肽i)生物量， )種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸編碼具有與序列SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的多核苷酸，其中多肽或變體含有A20型鋅指結(jié)構(gòu) 域和ANl型鋅指結(jié)構(gòu)域。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中A20型結(jié)構(gòu)域在多肽的N末端一半中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中ANl型結(jié)構(gòu)域在多肽的C末端一半中。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中A2 0型結(jié)構(gòu)域具有通式 X3-C-X (2-4) -C-Xl 1-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中ANl型結(jié)構(gòu)域具有通式C-X2-C-X(9-12)-C-X(l-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中 X 可以是任意氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中A20型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQID NO 16至少70%的同一性。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中A20型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQID N0:17。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中A20型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQID NO16。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中Am型結(jié)構(gòu)域具有與序列SEQID NO 18至少70%的同一性。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中Am型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQID NO19。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸，其中Am型結(jié)構(gòu)域含有序列SEQID NO18。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸編碼具有SEQID NO :1序列的多肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸含有具有與SEQID NO 7的編碼序列至少70%同一性的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中多核苷酸含有能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與 SEQ ID NO 7的編碼序列雜交的序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸含有SEQID N0:7的 編碼序列。
18.一種含有序列SEQ ID NO :7或其變體的分離的多核苷酸，其中變體編碼能夠調(diào)節(jié) 植物中至少一種下列性狀的多肽i)生物量， )種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸含有與SEQID NO 7的編碼序列至少70%同一性的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多核苷酸，其中多肽如權(quán)利要求3至16中任一項所 述定義。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸含有能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條 件下與SEQ ID NO 7的編碼序列雜交的序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的分離的多核苷酸，其中分離的多核苷酸含有SEQID NO 7 的編碼序列。
23.一種由權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸編碼的多肽。
24.一種由權(quán)利要求1至14任一項定義的任一多核苷酸編碼的多肽。
25.一種分離的多核苷酸，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸的至少 50個核苷酸長度的片段。
26.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸的遺傳構(gòu)建體。
27.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體。
28.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求26或27所 述的構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
29.—種經(jīng)遺傳修飾表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
30.一種含有根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的構(gòu)建體的植物細(xì)胞。
31.一種含有根據(jù)權(quán)利要求30所述的植物細(xì)胞的植物。
32.—種制備具有至少一種下列性狀的植物的方法i)改變的生物量， )改變的種子產(chǎn)量，和iii)改變的對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性，所述方法包括用下列成分轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物a)根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸；b)含有a)中多核苷酸的至少15個核苷酸長度片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸互補物的多核苷酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中生物量和對至少一種所述環(huán)境應(yīng)激的耐受性在 植物中有改變。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的方法，其中改變是增加。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34任一項所述的方法，其中用權(quán)利要求26或27所述的構(gòu)建體 轉(zhuǎn)化植物。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35任一項所述的方法，其中多肽變體含有SEQID NO :2至6中 任一個序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求35至35任一項所述的方法，其中多核苷酸變體含有SEQID N0:8至 12中任一個序列。
38.一種用于選擇具有至少一種以下性狀的植物的方法相對于合適的對照植物，i)改變的生物量， )改變的種子產(chǎn)量，和iii)改變的對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性， 所述方法包括測試植物的根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要 求23或24所述的多肽改變的表達(dá)。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求32至37任一項所述的方法制備的植物細(xì)胞或植物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的植物細(xì)胞或植物，其經(jīng)遺傳修飾而含有根據(jù)權(quán)利要求1-22 任一項所述的多核苷酸。
41.一種用根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法選擇的植物群組或群體。
42.一種根據(jù)權(quán)利要求31或39所述的植物的部分、果實、種子、收獲的材料、繁殖體或 后代。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的植物的部分、果實、種子、收獲的材料、繁殖體或后代，其經(jīng) 遺傳修飾而含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至22任一項所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求26 或27所述的構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼具有序列SEQ ID NO1的多肽或其變體的分離的多核苷酸，其中變體是能夠調(diào)節(jié)植物中至少一種下列性狀的多肽i)生物量，ii)種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性。本發(fā)明還提供了經(jīng)遺傳修飾而含有所述多核苷酸的構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞、植物細(xì)胞和植物。本發(fā)明還提供了用于制備和選擇改變了至少一種下列性狀的植物的方法i)生物量，ii)種子產(chǎn)量，和iii)對至少一種選自干旱、寒冷、冰凍、熱或鹽分的環(huán)境應(yīng)激的耐受性，使用本發(fā)明的多核苷酸的方法。
文檔編號A01H5/10GK102099476SQ200980126566
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日
發(fā)明者C·J·布賴恩特, K·R·坦普爾頓, S·巴賈杰, S·普蒂加埃 申請人:維亞拉克什亞生物科學(xué)(新西蘭)有限公司