專利名稱：不含選擇性標記的轉質體植物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及不含選擇性標記的轉質體(transplstomic)植物、特別是豆科植物， 涉及獲得此類植物的方法和所用的載體和構建體。
背景技術：
植物轉基因包括向植物中導入來自不同生物體(細菌、病毒、昆蟲、植物)的一種或多種基因，目的在于給植物提供新的特性，改善某些農學或食品品質?；虻臉O度多樣性和傳統(tǒng)遺傳轉化技術的發(fā)展已導致產生新的植物品種。在某些情況下，由于引入賦予了對除草劑、病原體或不同應激的耐性，有利于作物生產并提高產量。在其它情況下，可改善植物的營養(yǎng)價值和某些基礎化合物的含量。大量作物品種屬于豆科植物家族，特別是產蛋白植物如豌豆、蠶豆、黃豆、鷹嘴豆、 小扁豆，產油植物如大豆和花生，牧草如苜?；蛉~草。賦予豆科植物農學價值的的基本性質是其高蛋白含量。這一性質使這些植物成為人們過量表達感興趣的蛋白質的上選。獲得穩(wěn)定的轉基因植物有很多技術，包括將外源基因導入植物的核基因組。另一種獲得轉基因植物的方式是質體(Plastid)的直接轉化。具體而言，質體轉化與核轉化相比有許多優(yōu)勢，可提及的有-質體轉化是通過雙重同源重組將基因插入每個細胞內的一個或多個拷貝的環(huán)狀質體基因組(或質體組plastome)中，優(yōu)點為精確靶向質體組內需要整合感興趣的基因的區(qū)域，避免核轉基因中常見的“位置”效應；-每個細胞可獲得極大量拷貝的轉基因。具體而言，葉細胞可包含多達10000拷貝的質體組。然后，可操作植物細胞使其含有多達20 000拷貝的感興趣基因。該特征導致高水平的表達；轉基因的產物可能占總可溶蛋白質的40%以上(De Cosa等，2001)。-質體轉化的其它優(yōu)勢是極大限制了轉基因環(huán)境散播的風險。由于質體編碼的性狀一般不能通過花粉傳播，限制了轉基因傳播到野生物種的潛在風險。最初在單細胞藻類萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中用生物射彈進行質體轉化(Boynton等，1988)，該方法現(xiàn)已延伸至煙草(Svab等，1990和1993)。目前，高等植物的質體穩(wěn)定轉化已在煙草植物煙草(N.tabacum)中常規(guī)進行 (Svab 和 Maliga，1990 ;Svab 等，199 。近年來對水稻(Khan 和 Maligna，1999)、擬南芥 (Arabidopsis thaliana) (Sikdar 等，1998)、馬鈴薯(Sidorov 等，1999)、油菜(Chaudhuri 等，1999)和番茄(Ruf等，2001)質體的轉化取得了一些進展。多年來未能成功產生可繁殖的轉質體大豆植物，直到公開了高頻轉化大豆質體產生可繁殖植株的新方法和新手段(W0 04/053133)。McBride 等 1994 年的文章、美國專利第 5，451，513 ；5，545，817 ；5，545，818 和 5，576，198號，還有國際專利申請WO 95/16783和WO 97/3四77中更詳細描述了質體轉化技術。質體轉化已用于獲得良好水平的除草劑耐性或抗蟲性、或者用于大量生產蛋白質。因此，煙草質體組的除草劑如草甘膦(Daniell，1998 ;W099/10513 ;Ye等，2000 ;W0 01/04331，WO 01/04327)或草胺膦(Basta) (Lutz等，2001)的耐受基因過度表達產生了對這些除草劑出色的耐受性。其它應用導致產生對昆蟲耐受或過量產生治療性蛋白的轉質體植物(McBride 等，1995 ；美國專利 5，451，513 ；Staub 等(2000) ；WO 99/10513)。然而，如常規(guī)進行的高等植物質體的直接轉化的一個主要缺點是采用抗生素抗性基因作為選擇性標記。通常用于選擇轉質體品系的選擇性標記是細菌基因aadA，它在質體調控元件的控制下表達(Svab等，1993 ；Staub等，1993)。編碼氨基糖苷3，-腺苷轉移酶的aadA基因的表達產生兩種抗生素抗性，即壯觀霉素和鏈霉素抗性。aadA基因產物防止壯觀霉素(或鏈霉素)結合于質體核糖體30S亞基的部件16S RNA (參與識別翻譯起始密碼子)，從而防止了抑制質體內的翻譯。僅有含有表達aadA基因產物的質體的細胞能夠繼續(xù)在體外最優(yōu)地生長并保持綠色。另一種選擇性標記是具有點突變的16S RNA序列，該點突變使其對壯觀霉素不敏感。不幸的是，這種抗生素也控制人和動物中的細菌感染。因此，更希望最終產物中不含有該抗生素。因此，人們主要關心可以清除選擇性標記基因，特別是抗生素標記基因，同時將感興趣的基因保持在轉基因植物中的方法。在這種情況下，并考慮到質體轉化的上述優(yōu)點，關鍵是需要開發(fā)一種簡單可靠的技術以獲得沒有選擇性標記的轉質體植物，特別是豆科植物，更具體說是大豆。已經(jīng)描述了一定數(shù)量的用于清除整合入染色體的選擇性標記基因的技術，但它們常設計為核轉化和/或常常較復雜且可靠性或高或低。這些技術中，采用轉座因子(PCT/US91/04679 ；Yoder等199 或位點特異性重組系統(tǒng)如Pl噬菌體的cre/lox系統(tǒng)或酵母FLP/FRT系統(tǒng)(FliI^ase重組酶；Lyzrik等，1997) 除去核轉化整合入染色體的標記基因。通過其轉運肽將編碼靶向葉綠體的CRE蛋白的第二種轉基因引入該植物的核基因組中(EP1218488)，位點特異性重組也已應用于清除轉質體標記基因。在萊茵衣藻中，基于光合突變體的選擇方法使得不用抗生素選擇性標記基因如 aadA將感興趣的外來基因引入質體基因組成為可能。然而，這些方法不能用于高等植物，因為它們以光合突變體的存在為基礎。在擬南芥中已采用基于同源重組現(xiàn)象的系統(tǒng)以清除通過核轉化所整合的標記基因(W0 01/96583)。此法中，采用包含環(huán)繞有陽性選擇性標記基因和陰性選擇性標記基因的兩拷貝相同取向的感興趣基因的載體轉化植物。所述陽性選擇性標記基因使該方法能選出基因組中整合了轉基因的植株。兩拷貝感興趣基因使該法能通過同源重組而去除兩種(陽性和陰性)選擇性標記基因與感興趣基因兩拷貝中的一個拷貝。經(jīng)歷此同源重組后缺乏陰性選擇性標記基因的植物時能被選出。這種陰性選擇性標記基因的一個例子是CodA基因 (大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)，該酶可使5-氟胞嘧啶(無毒性)脫氨成為毒性的5-氟尿嘧啶。WO 06/07260中，作者開發(fā)了一種新的可靠方法以產生無標記的除草劑耐受植物。 將包含插入在HPPD編碼區(qū)分別對應于該蛋白質NH2-末端與COOH-末端的兩片段(這兩個序列有403個核苷酸的Pl片段重疊)之間的aadA選擇盒的遺傳構建體引入煙草植株的質體組中。利用質體基因組內的同源重組，將兩拷貝的Pl (片段)重組在質體基因組中。這導致去除該aadA盒而恢復功能性全長HPPD編碼區(qū)，從而賦予重組質體轉基因植物DKN耐受性。由于能夠對DKN進行選擇，從而加速和促進了含HPPD基因但缺乏aadA基因的同質植物的產生。本申請公開了去除這種選擇性標記的新方法和手段，使其對于任何感興趣基因更容易甚至更可靠，即使是恢復時不會賦予所述植物新的選擇性特性的基因。


圖1 含串聯(lián)雙順反子的構建體，包含在玉米(Zea mays)Prrn啟動子控制下的 aadA基因和gfp基因，此二基因分別插入在煙草ftrri啟動子控制下bar基因的5’ -末端序列(BAR N-末端)與3’-末端(BAR C-末端)之間，這二個序列有H片段重疊，其長度足以允許同源重組，從而去除含aadA基因和gfp基因的串聯(lián)雙順反子及兩個H片段之一，并暴露功能性bar基因(BAR)。圖 2 質粒 pCLT339 3 轉質體大豆品系的分子分析。圖3a)采用引物0SSG511和0SSG311,對野生型品系和從綠色-GFP陽性區(qū)(TO GFP+)再生的兩種轉質體植株進行PCR分析；圖3b)采用引物ftrn-Zm-lF和aadA_780R， 對從GFP陽性區(qū)(TO GFP陽性品系)再生的兩種轉質體植株和對UV下的紅色-GFP陰性區(qū) (Tl GFP陰性品系)再生的六種植株進行PCR分析；圖3c)采用商品化Liberty Link試劑盒，對野生植株和對UV下的紅色-GFP陰性區(qū)(轉質體Tl品系)再生的植株進行BAR蛋白檢測試驗。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個主題是遺傳結構或構建體，其在轉錄方向上含有至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記嵌合基因，和(ii)編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因或嵌合色素基因，或編碼陰性標記的嵌合基因；二者分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與 3’ -末端序列之間，這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段，當嵌合基因(ii)編碼陰性標記時感興趣基因不是全長基因。本發(fā)明的表述“嵌合基因”或“表達盒”是指一種核苷酸序列，其包含在質體中具有功能的調節(jié)性啟動子序列、編碼蛋白質的序列、和任選在植物細胞的質體中具有功能的終止子，它們在轉錄方向上彼此功能性連接。術語“嵌合基因”或“表達盒”一般指一種基因，其所含的某些元件不存在于天然基因中，但取代天然基因中存在的元件或加入天然基因中。本發(fā)明所用術語“嵌合基因”或“表達盒”也可對應于所有基因元件在天然基因中都存在的情況，或者，術語“基因”可對應于嵌合基因。措詞“嵌合基因”或“表達盒”也可對應于不直接連接啟動子但(例如)其多順反子結構含有在同一啟動子調控下的幾個編碼序列的蛋白質編碼序列。在此情況下，每個啟動子調控下的編碼序列設計“嵌合基因”或“表達盒”。本發(fā)明中所述序列(i)編碼選擇性標記和(ii)編碼發(fā)光蛋白、或嵌合色素基因的嵌合基因，或者編碼陰性標記的嵌合基因，可以是在一個啟動子調控下的多順反子結構的一部分。
它們也可以各自受其自身啟動子調控。本發(fā)明中術語“彼此功能性連接”指所述嵌合基因元件彼此相連的方式使它們的功能協(xié)調且能表達編碼序列。例如，當能確保所述編碼序列表達時，啟動子就是與編碼序列功能性連接?？捎帽绢I域技術人員熟知的技術，具體如Sambrook等Q001，《分子克隆實驗手冊》第3版，Nolan C.編，紐約冷泉港實驗室出版社)所述技術構建本發(fā)明的嵌合基因和裝配其各種元件。組成此嵌合基因的調控元件的選擇基本上它們必須在其中起作用的植物和質體的類型，本領域技術人員有能力選擇在給定植物中具有功能的調控元件。在可用于實施本發(fā)明的在植物細胞的質體中具有功能的啟動子中，可提及的，例如有編碼PSII的Dl蛋白質的psbA基因的啟動子(Staub等，1993，EMB0 Journal 12(2) 601-606)或核糖體RNA操縱子ftrri的組成型啟動子(Maub等，1992)或與煙草rbcL基因 5'非翻譯區(qū)的5'部分結合的煙草ftrn啟動子(Svab等，199；3)。通常，衍生自植物質體組基因或細菌基因的任何啟動子都合適，本領域技術人員能夠在可獲得的各種啟動子中作出合適的選擇，以獲得所需表達方法(組成型或誘導型)。本發(fā)明優(yōu)選的啟動子包括與煙草 rbcL基因5'非翻譯區(qū)的5'部分結合的煙草ftrn啟動子(Svab和Maliga，1993)。本發(fā)明中，也可與啟動子聯(lián)用位于啟動子與編碼序列之間的其它調控序列，如轉錄激活子(“增強子”)，例如專利申請WO 87/07644所述的煙草花葉病毒(TMV)的翻譯激活因子、或1990年Carrington和Freed描述的煙草腐蝕病毒(TEV)的翻譯激活子，或者翻譯激活子/核糖體結合位點glOl (Ye等，2001)。在植物細胞的質體中有功能的終止子中，可提及的，例如有psbA基因的終止子、 編碼核酮糖-1，5-二磷酸羥化/加氧酶(Rubisco)大亞基的rbcL基因或編碼煙草核糖體蛋白的 rpsl6 基因(Shinozaki 等，1986 ；Staub 等，1993)。編碼選擇性標記以賦予對選擇試劑抗性的序列，使得能夠選出被有效轉化的質體和細胞，即其質體組中已整合了所述嵌合基因的質體和細胞?？捎煤撨x擇試劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)轉化的細胞或組織完成轉化子的選擇。常用的選擇性標記基因包括編碼可產生對抗生素、除草劑、或其它化合物抗性的基因，這些物質對不表達該抗性基因或等位基因的細胞、細胞器或組織可以是致命的。那么，選擇試劑是相應的抗生素、除草劑或選擇性化合物。如果所述物質對細胞是致命的，那么在這種培養(yǎng)基上只有轉化細胞能存活并發(fā)育，而非轉化細胞會死亡。如果選擇劑對細胞不致命，就根據(jù)可能顯示出的不同行為區(qū)分轉化細胞和非轉化細胞。選擇性標記可能在細胞水平不致命，但在細胞器水平致命。例如，抗生素壯觀霉素在質體中，而非胞質中抑制mRNA翻譯成蛋白質。含有非抗性質體的組織會發(fā)白，而含有抗性質體的組織為綠色。在含有轉化質體和非轉化質體的分裂細胞中，對轉化質體有利的是， 在選擇壓力下非轉化質體會消失，可獲得僅含轉化質體的細胞群體。術語“選擇性標記基因”指編碼選擇性標記的基因，或編碼選擇性標記的嵌合基因。在可采用的編碼選擇性標記的基因中，可提及抗生素壯觀霉素-鏈霉素和卡那霉素的抗性基因，例如，編碼氨基糖苷3’ -腺苷轉移酶的嵌合基因aadA(Svab等，199 和編碼新霉素磷酸轉移酶的neo (Carrer等，1993)，還有甜菜堿醛耐受基因，如編碼甜菜堿醛脫氫酶的基因(Daniell等，2001)，還有除草劑耐受基因，如雙丙氨膦耐受基因bar基因(White 等，1990，Nucleic Acids Res. 18(4) :1062)或草甘膦耐受基因 EPSPS 基因(美國 5，188，642)。優(yōu)選地，編碼選擇性標記的基因是抗生素抗性基因。編碼選擇性標記的優(yōu)選基因是編碼對鏈霉素和壯觀霉素產生抗性的氨基糖苷3’ -腺苷轉移酶的aadA基因(Svab等， 1993)。在本文中，嵌合發(fā)光基因或發(fā)光基因指編碼發(fā)光蛋白或發(fā)光肽的基因。因此，在一具體實施方式
中，本發(fā)明的遺傳結構或構建體在轉錄方向上至少包含 (i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記嵌合基因，和(ii)編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因；二者分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段。發(fā)光是指非發(fā)熱、白熾物體的光源發(fā)射的光。物體的原子受溫度升高以外的方法激發(fā)產生發(fā)光。有許多類型的發(fā)光，包括低溫時某些化學反應，主要是氧化反應產生的化學發(fā)光，撫摩絲綢或皮毛或分離粘結表面時放電產生的電光，和摩搓或壓碎晶體產生的摩擦光。生物發(fā)光是活生物體產生的發(fā)光，被視作是一種化學發(fā)光。如果因吸收某些形式的輻射能，如紫外輻射或X射線能(或某些其它形式的能，如機械壓力)時可導致這種發(fā)光，當引起發(fā)光的輻射結束時立即(或非常短暫之后)終止稱為熒光。如果引起發(fā)光的輻射結束后發(fā)光繼續(xù)存在，則稱為磷光。本發(fā)明中術語發(fā)光視為通用術語，包括各種類型的發(fā)光，如熒光、生物發(fā)光、化學發(fā)光、磷光。在本文中，利用編碼發(fā)光蛋白的序列有可能鑒定到已被轉化而保有包含選擇性標記編碼序列和發(fā)光蛋白編碼序列的表達盒的質體和細胞。更令人感興趣的是，先前選出的已轉化細胞發(fā)光的消失(即不發(fā)光)使得能鑒定到通過同源重組除去了含有選擇性標記編碼序列和發(fā)光蛋白編碼序列的表達盒的質體和細胞。本發(fā)明的術語“發(fā)光蛋白”指當其原子受溫度升高以外方式的激發(fā)能產生光的蛋白質。已知有多種發(fā)光蛋白質，知道編碼它們的基因并已用作報告基因。優(yōu)選地，發(fā)光蛋白是綠熒光蛋白(GFP) (Sidorov等，1999)。綠熒光蛋白是一種蛋白，最初分離自維多利亞水母(Aequorea victoria)，當其暴露于蘭光時可發(fā)出綠熒光 (Tsien R，1998)。維多利亞水母GFP有在波長395nm的主激發(fā)峰和在波長475nm的次激發(fā)峰。它的發(fā)射峰在509nm，位于可見光譜近綠部分。海洋三色紫羅蘭(sea pansy)Renilla reniformis的GFP在498nm有單個主激發(fā)峰。在細胞和分子生物學中，常利用GFP基因作為報告基因(Phillips 6(2001)) ο發(fā)光蛋白的其它例子包括螢光素酶。螢光素酶是自然界常用的生物發(fā)光性酶。最有名的一種來自是螟娥螢火蟲(Photinuspyralis)的螢光素酶(EC1. 13. 12. 7)，雖然在橙黃磷光陡頭菇(Omphalotus olearius)和許多海洋生物等不同生物中也存在該酶。螢光素酶反應中，螢光素酶作用于相應的螢光素底物而發(fā)射562nm波長的光。該反應的能效非常好輸入反應的幾乎所有能量都轉化成光?？刹捎霉饷魞x器，如光度計、改良的光學顯微鏡或靈敏的CCD (電荷耦合器件)相機檢測光子發(fā)射。本發(fā)明還涉及獲得無選擇性標記，特別是無抗生素選擇標記的轉質體植物細胞和植株的方法，該方法至少包括以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個植物細胞，該載體包含至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和(ii)編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因；兩者分別插入在感興趣嵌合基因的5’-末端序列與3’-末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有該選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的細胞；c)在不含有該選擇試劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；d)選擇不發(fā)光的細胞或植株。本發(fā)明中術語“適合轉化質體的載體”可以指，例如，在本發(fā)明遺傳結構或構建體邊緣包含用以進行植物質體組同源重組的二個區(qū)域的轉化載體。這二個區(qū)域位于基礎嵌合基因的上游(LHRR)與下游(RHRR)，允許與含鄰近LHRR 和RHRR區(qū)的質體組的基因間區(qū)進行雙重同源重組。本發(fā)明中，和待轉化質體組某區(qū)域同源的序列，與該待轉化質體組中的對應序列 80 %相同，優(yōu)選90 %相同，優(yōu)選95 %相同，優(yōu)選99 %相同。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，和待轉化質體組某區(qū)域同源的序列，與該待轉化質體組中的對應序列100 %相同。優(yōu)選地，本發(fā)明的兩個同源重組區(qū)域對應于鄰近序列使得所述嵌合基因整合入質體組的基因間區(qū)。在一具體實施方式
中，該區(qū)域對應于質體組核糖體RNA操縱子區(qū)。在另一具體實施方式
中，所述基因間區(qū)包含編碼核酮糖-1，5- 二磷酸羥化/加氧酶大亞基的rbcL基因的3’ -末端，另一同源序列包含編碼乙酰輔酶A-羧化酶亞基的accD基因的 5’ -末端；更具體地，所述基因間區(qū)包含對應于哈瓦那雪茄(Petit Havana)煙草質體組的 57755-59297核苷酸的編碼核酮糖-1，5-二磷酸羥化/加氧酶大亞基的rbcL基因的3’-末端，另一同源序列包含對應于哈瓦那雪茄煙草質體組的59298-605 核苷酸的accD基因的 5，-末端。這兩個同源重組區(qū)域的選擇取決于待轉化的植物。根據(jù)待轉化的植物，技術人員熟知優(yōu)選的同源區(qū)。例如，轉化豆科植物質體組的優(yōu)選區(qū)域是質體組的核糖體RNA操縱子區(qū)。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及嵌合色素基因。嵌合色素基因或色素基因指能賦予植物細胞、植物或植物的一部分特定顏色的基因。這種色素基因可以是表達色素的基因，或調節(jié)色素表達的基因。色素的例子有多酚類化合物、鞣紅或通過類黃酮生物合成途徑合成的原花青素(proanthocyanidin) (Himi E.等，2005，Euphytica，143 卷(3)， 239-242頁)。這些色素基因很多是技術人員熟知的。例如，可引用Ph6基因，或影響牽?；ㄖ参镏谢ㄇ嗨匦纬傻南嚓P基因(Chuck G.等，199 、可調控谷物和胚芽鞘色素形成的R 和 Rc 基因(E. Himi, 2005, Genome, 48 (4)卷，747-754 頁；Ε· Himi 等，2005，J Exp Bot 53: 1569-1574)、已知調節(jié)植物花青素生物合成的Myb基因(Takos A.M.等，2006)。本發(fā)明還涉及獲得無選擇性標記，特別是無抗生素選擇標記的轉質體植物細胞和植株的方法，該方法至少包括以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個植物細胞，該載體包含至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和(ii)色素基因；兩者分別插入在感興趣嵌合基因的5’-末端序列與3’-末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有所述選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的細胞；c)在不含有所述選擇試劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；d)選擇不顯色的植物細胞或植株。本發(fā)明的意思是，步驟d)中不顯色(或呈野生型顏色)的細胞或植株，是不具備因步驟a)的色素基因的表達的特定顏色的植物細胞或植株。本發(fā)明還涉及一種遺傳結構，其在轉錄方向上至少包含(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記嵌合基因，和(ii)編碼陰性選擇性標記的嵌合基因；二者分別插入在感興趣嵌合基因的5’_末端序列與3’_末端序列之間，這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段，其中感興趣嵌合基因不是全長基因。本發(fā)明中編碼陰性選擇性標記的嵌合基因(或稱陰性標記基因)是編碼能防止攜帶所述陰性標記基因的植物或植物細胞在選擇培養(yǎng)基中生長的肽或蛋白質的嵌合基因，而不攜帶所述陰性標記基因的植物或植物細胞則能生長。所述陰性選擇性標記基因的一個例子是CodA基因(大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶)，該酶可使5-氟胞嘧啶(無毒性)脫氨成為毒性的5-氟尿嘧啶(Austin Ε. Α.等，1993)。在此情況中，本發(fā)明上述方法中步驟c)所用的培養(yǎng)基是含5-氟胞嘧啶的培養(yǎng)基。未經(jīng)歷同源重組仍攜帶CodA基因的植物或植物細胞對5-氟胞嘧啶敏感不能生長。通過同源重組去除CodA基因的植物或植物細胞對5-氟胞嘧啶不敏感而能生長。陰性標記的另一個例子是自養(yǎng)黃單胞菌(Xanthobacter)編碼鹵代烷脫鹵素酶的 GJlO基因，該酶能水解二鹵代烷成為鹵化醇和無機鹵化物(Naested等，1999)。本發(fā)明還涉及獲得無選擇性標記，特別是無抗生素選擇標記的轉質體植物細胞和植株的方法，該方法至少包括以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個植物細胞，該載體包含至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和(ii)編碼陰性選擇性標記的嵌合基因；兩者分別插入在感興趣嵌合基因的5’-末端序列與3’-末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有所述選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的細胞；c)在不含有所述選擇試劑并防止表達陰性標記細胞生長的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；d)選擇在此第二培養(yǎng)基中生長的植物細胞本發(fā)明的意思是，(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和 (ii)編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因、或嵌合的色素基因、或編碼陰性標記的嵌合基因；此二基因分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段。因此片段H構成圍繞含有嵌合基因(i)和(ii)的長度適合重組的正向重復序列。當這兩個正向重復序列之間發(fā)生重組時，消除嵌合基因(i)和(ii) 與H重復序列中的一個，導致恢復感興趣的全長嵌合基因。本發(fā)明的一種具體實施方式
中，本發(fā)明構建體中感興趣的基因在重組前不是全長基因。因此，在本發(fā)明構建體、方法、轉質體植物細胞、植物或種子的一種具體實施方式
中， 感興趣的基因不以全長形式存在。
本發(fā)明的另一種具體實施方式
中，本發(fā)明構建體中感興趣的基因在重組前是全長基因，該情況的條件是，嵌合基因(ii)不編碼陰性標記。在此種實施方式中，本發(fā)明的構建體在轉錄方向上包含至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和 (ii)嵌合性色素基因或編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因，此二基因插入在感興趣嵌合基因的兩個正向重復序列之間。在本發(fā)明這兩種具體實施方式
中，選擇標記的去除對于細胞是顯而易見的，意味重組后該細胞不含用于該目的的序列。圖1提供了本發(fā)明這種構建體的一個例子。同源重組是天然發(fā)生的機制，在質體基因組中發(fā)生的頻率較高。當基因組中存在合適大小的重復序列時可能發(fā)生此種機制。在一種優(yōu)選的實施方式中，該重復序列的長度超過或等于90個核苷酸。也可采用少于90個核苷酸的重復序列，但其重組率明顯降低 (Eibl C，1999)。正向重復序列是重復的核酸序列，該重復序列的取向與原始序列相同而不是相反。優(yōu)選地，所述重復序列是至少50個核苷酸的序列，更優(yōu)選至少90個核苷酸的序列?？捎帽绢I域技術人員熟知的技術，具體如Sambrook等(1989，《分子克隆實驗手冊》，Nolan C.編，紐約冷泉港實驗室出版社)所述技術進行本發(fā)明的構建。構建體也可完全或部分采用常規(guī)化學合成技術合成和生產。本發(fā)明中術語“轉質體植物細胞或植物”是指質體組中穩(wěn)定整合有在質體中，特別是在葉綠體中具有功能的嵌合基因的植物細胞或植物。質體組包括除細胞核之外的細胞器的基因組，特別是葉綠體基因組。為實施本發(fā)明的方法，可對來自未成熟植物胚胎的胚胎組織進行所述轉化步驟。優(yōu)選地，所述胚胎組織是愈傷組織或含有保留了全能狀態(tài)細胞的任何其它組織?？刹捎棉D化植物細胞的任何方法進行細胞轉化。可用于獲得本發(fā)明轉化細胞的轉化方法中，其中一種包括使待轉化的植物細胞或組織與聚乙二醇(PEG)和轉化載體接觸(Chang 和 Cohen，1979，Mol. Gen. Genet. 168(1)，111-115 ；Mercenier 和 Chassy， 1988, Biochimie 70 )，503-517)。另一種方法是電穿孔，包括將待轉化細胞或組織與所述載體置于電場中(Andreason 和 Evans，1988，Biotechniques 6 (7)，650-660 ； Shigekawa 和 Dower，1989，Aust, J. Biotechnol. 3 (1)，56-62)。另一方法包括將所述載體通過顯微注射直接注入細胞或組織(Gordon和Ruddle，198 。還可利用農桿菌類細菌轉化植物細胞或組織，優(yōu)選采用已經(jīng)過遺傳修飾而能將T-DNA特異性靶向質體的腫脹農桿菌(A. tumefaciens) (Knopf, 1979，Subcell. Biochem. 6，143-173 ；Shaw 等，1983， Gene 23(3) :315-330 ；Ishida 等(1996，Nat. Biotechnol. 14 (6)，745-750)或生根農桿菌 (A. Rhizogenes) (Bevan 和 Chilton，1982 ；Tepfer 和 Casse-Delbart，1987)感染所述植物的細胞或組織。按照本發(fā)明方法的一中優(yōu)選實施方式，采用稱為顆粒轟擊或生物射彈的方法。其包括用表面吸附有本發(fā)明載體的顆粒轟擊所述組織(Bruce等，1989，Klein等，1992 ； 美國專利第4，945，050號)。轉化后，用含有對應于所用選擇性標記基因的選擇試劑的第一培養(yǎng)基進行選擇步驟，從而得以選出所述外源DNA已整合入質體基因組中的轉化細胞。例如，如果用aadA基因作為選擇性標記基因，所用的選擇培養(yǎng)基將含狀觀霉素和/或鏈霉素。能在此培養(yǎng)基中生長的細胞將增殖和/或再生，同時維持其壯觀霉素和/或鏈霉素選擇性，從而獲得所有質體基因組中含所述外源DNA的組織或植物。在接下來的步驟中，取第一培養(yǎng)基選出的細胞或組織接種稱為非選擇性培養(yǎng)基的第二培養(yǎng)基，通過所述重復序列之間的重組，得以去除編碼該選擇性標記的基因并獲得有完整的、功能性的感興趣基因。術語“非選擇性培養(yǎng)基”是指不含存在于第一培養(yǎng)基中的選擇試劑的培養(yǎng)基。因此，在本發(fā)明的一種具體實施方式
中，根據(jù)發(fā)光的性質，采用技術人員熟知的合適手段觀察細胞的發(fā)光，選擇不發(fā)光的細胞或組織。這些不發(fā)光細胞是二個正向重復序列間發(fā)生重組，導致去除了(i)編碼賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因、(ii)編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因的細胞和這二個重復序列之一，從而恢復了感興趣的功能性全長嵌合基因。在本發(fā)明另一種具體實施方式
中，選擇沒有因色素基因表達發(fā)出特定顏色的植物細胞。盡管因色素基因表達產生的特定顏色只可見于或后來見于從所述培養(yǎng)基(不含第一培養(yǎng)基的選擇試劑)獲得的植物細胞所再生的植物或再生植物的一部分，當上述定義的無色特征可檢測時，可在此水平上選擇無選擇性標記的植物。在本發(fā)明另一種具體實施方式
中，在能防止表達陰性選擇性標記細胞生長的培養(yǎng)基中選擇能生長的細胞。對此最后一步的補充，可以通過檢測所述細胞對選擇試劑的敏感度、和/或檢測感興趣基因的表達、和/或用分子生物學技術如Southern印跡雜交和PCR技術，驗證可選擇性標記的去除。技術人員公知所有這些技術都比觀察不發(fā)光、無顏色或特定培養(yǎng)基中的生長更為復雜。所用的培養(yǎng)基是本領域技術人員熟知的。它們在Gamborg等(1968)和Murashige 等(196 的文中有具體描述。細胞一經(jīng)旦選出就可用于再生能表達感興趣基因的無選擇性標記轉質體植物。或者，在再生后根據(jù)植物不發(fā)光、或無顏色進行選擇。“感興趣的功能性全長嵌合基因”指能表達和編碼肽或功能蛋白的感興趣基因。此外，根據(jù)本發(fā)明，它是通過同源重組切除了編碼(i)選擇性標記基因和(ii)編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因、或嵌合性色素基因、或編碼陰性標記的嵌合基因和所述二個重復序列之一后
重建的基因。所述感興趣的基因可以是被引入植物細胞或植物中以賦予其特定優(yōu)點的任何基因。在本發(fā)明的一種具體實施方式
中，所述感興趣的嵌合基因是賦予對除草劑抗性的基因。在本發(fā)明的一種更具體的實施方式中，所述賦予特定優(yōu)點的感興趣嵌合基因是賦予對雙丙氨磷耐受的bar基因(C. J. Thompson等)、或合成的編碼PAT酶的bar基因，它的氨基酸序列不同于天然基因編碼的氨基酸序列(White等，1990 ；EP257542)。根據(jù)本發(fā)明的另一種更具體實施方式
，所述感興趣的嵌合基因編碼羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)。羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)是催化對-羥苯丙酮酸(HPP)轉化成尿黑酸鹽的反應的酶(Crouch N. P.等，^Tetrahedron，53，20，6993-7010，1997)。發(fā)現(xiàn)某些抑制羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的分子可用作除草劑(Pallett K. E.等，1997，Pestic. Sci. 50 83-84)?，F(xiàn)有技術描述的這類以HPPD為靶子的除草劑有特別是異惡唑(isoxazoles) (EP418, 175、EP470, 856、EP487, 352、EP527, 036、EP560, 482、EP682, 659、US5, 424，276)，特別是玉米的選擇性除草劑異惡唑草酮(isoxaflutole，IFT)；硝基二酮(diketonitriles 或DKN) (EP496，630、EP496，631)，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；鵢4_三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-2，3-Cl2-苯基)丙燒-1，3-二酮；三酮類(triketones) (EP625, 505、EP625, 508、US5, 506, 195)，特別是磺草酮 (sulcotrione)或甲基石黃草酮(mesotrione)、或節(jié)草唑(pyrazolinates)。術語“HPPD”是指具有HPPD活性的任何天然、突變或嵌合的HPPD酶。文獻中描述了許多HPPD，特別是來自細菌如假單胞菌(Ruetschi等，Eur. J. Biochem.，205， 459-466，1992、W096/38567)；植物如擬南芥(W096/38567, Genebank AF0478;34)、或胡蘿卜 (W096/38567, Genebank87257)；球胞菌(Coccicoides) (Genebank C0ITRP)或哺乳動物如人、小鼠或豬的HPPD。優(yōu)選經(jīng)突變而獲得耐受HPPD-抑制性除草劑的突變HPPD，例如專利申請 W099/24585中描述的突變。術語“嵌合HPPD”是指包含來自各種HPPD的元件的HPPD，特別是專利申請 W099/24586中描述的嵌合HPPD。本發(fā)明的另一種更具體實施方式
中，所述感興趣的嵌合基因編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。EPSPS是一種參與莽草酸生物合成通路導致合成芳族氨基酸的質體酶。已知 EPSPS是膦酰基甲基甘氨酸膦酸家族除草劑的靶酶。已知編碼EPSPS的序列對膦酰基甲基甘氨酸家族除草劑，特別是對草甘膦具有天然耐受性、或用作該耐受性。例如編碼耐受性EPSPS酶的基因中，可提及的有鼠傷寒沙門菌 (Salmonella typhimurium) AroA 基因的序列(Comai 等，1983，Science 221，370—371)、農桿菌(Agrobacterium sp. )CP4基因的序列(W092/04449)、或編碼牽?；‥PSPS基因的序列(Shah 等，1986，Science 233，478-481)、編碼番茄 EPSPS 基因的序列(Gasser 等，1988， J. Biol. Chem. 263,4280-4289)或編碼龍爪(Eleusine)EPSPS 基因的序列(W001/66704)。也已知曉通過突變成為草甘膦耐受的EPSPS編碼序列。例如，可提及的有細菌來源 Gtalker 等，1985，J.Biol，Chem. 260 (8)，4724-4728)或植物來源(EP0293!358 ;Ruff 等， 1991, Plant Physiol. 96 (S), Abstract 592 ；W091/04323 ；W092/06201 ；EP0837944)的編碼突變EPSPS的基因序列。在本發(fā)明的另一種具體實施方式
中，所述感興趣的嵌合基因編碼殺蟲毒素，例如編碼蘇蕓金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)殺蟲蛋白的基因。這些編碼Bt殺蟲蛋白的基因是技術人員熟知的，并可以在N. Crickmore等，1998 一文中還有通過以下網(wǎng)站方便地找至丨J :http//www, lifesci. susx. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/,禾口 http://www, lifesci. susx. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip. html,其內容通過弓I用納入本文。
所述感興趣的嵌合基因也可以是抗病基因，例如專利申請EPO 531 498或美國專利5，866，778所述草酸鹽氧化酶的編碼基因，或編碼其它抗菌和/或抗真菌肽的基因，例如專利申請 WO 97/30082、W099/24594、W099/02717、W099/53053 和 WO 99/91089 中所述。也可以引入編碼植物農用特征的基因，特別是美國專利5，552，306和5，614，313和專利申請 WO 98/46763和W098/46764所述編碼δ -6去飽和酶的基因，或專利申請WO 00/01833和 W000/36127所述編碼絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)的基因。所述感興趣的嵌合基因也可編碼有藥學或獸醫(yī)學價值的蛋白質。例如，所述蛋白質可以是抗凝劑(血清蛋白酶、水蛭素)、干擾素或人血清白蛋白。本發(fā)明中植物生產的蛋白質也可以是抗體、或用作疫苗基礎的蛋白質。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明的方法和構建體應用于雙子葉植物。在本發(fā)明的一種具體實施方式
中，將本發(fā)明的方法和構建體應用于豆科植物。本發(fā)明的術語“豆科植物”是指豆科家族的植物。本發(fā)明優(yōu)選的豆科植物是有農用價值的豆科植物，如蜿豆(Pisum sativum)、大蠶豆(Vicia faba major)、小蠶豆 (Vicia faba minor)、小扁豆(Lens culinaris)、黃豆(Phaseolus vulgaris)、鷹嘴豆 (Cicer arietinum)、大豆(Glycine max)、落花生(Arachis hypogea)、紫花苜猜(Medicago sativa)或三葉草(Trifolium sp.)。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的方法和構建體應用于富含甘氨酸的大豆。本發(fā)明還涉及適于轉化植物質體的轉化載體，其特征是包含本發(fā)明的構建體。本發(fā)明的另一方面是獲得無選擇性標記，特別是無抗生素選擇標記的轉質體豆科植物細胞和植株的方法，該方法至少包括以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個豆科植物細胞，該載體至少包含一個編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，該嵌合基因分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有該選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的豆科植物細胞；c)在不含有該選擇試劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述豆科植物細胞。本發(fā)明的另一方面是獲得無選擇性標記，特別是無抗生素選擇標記的轉質體大豆植物細胞和植株的方法，該方法至少包括以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個大豆植物細胞，該載體至少包含一個編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，該嵌合基因分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有該選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的大豆植物細胞；c)在不含有該選擇試劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述大豆植物細胞。在本發(fā)明方法的一種具體實施方式
中，所述感興趣基因不是全長基因。本發(fā)明還涉及遺傳結構或構建體，其在轉錄方向上至少包含一個編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，該嵌合基因分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段。
可采用轉化和再生豆科植物細胞的任何方法進行豆科細胞的質體轉化和再生。合適的方法見WO 04/053133中的描述，其內容通過引用納入本文.根據(jù)本發(fā)明，編碼可整合入植物細胞或植物的感興趣蛋白的序列中，可提及的有 編碼對除草劑抗性酶的基因序列，例如，賦予對雙丙氨磷耐受的bar基因(C. J. Thompson 等，1987)，編碼PAT酶的合成bar基因(White等，1990 ；EP257542)，賦予對草甘膦耐受的 EPSPS酶編碼基因(W097/04103)，或賦予對異惡唑耐受的HPPD的編碼基因(W0 96/38567)。 可提及的還有編碼殺蟲毒素，例如蘇蕓金芽胞桿菌(Bt)殺蟲蛋白的基因(N. Crickmore 等，1998 ;http //www. 1 ifesci. susx. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/ :http : //www, lifesci. susx. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/vip. html ；其內容通過引用納入本文)。也可以將抗病基因導入這些植物，例如專利申請EPO 531 498或美國專利 5，866，778所述草酸鹽氧化酶的編碼基因，或編碼其它抗菌和/或抗真菌肽的基因，例如專利申請 WO 97/30082、W099/24594、W099/02717、W099/53053 和 WO 99/91089 中所述。也可以引入編碼植物農用特征的基因，特別是美國專利5，552，306和5，614，313和專利申請WO 98/46763和WO 98/46764所述編碼δ -6去飽和酶的基因，或專利申請WO 00/01833和WO 00/36127所述編碼絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)的基因。根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式
，可用編碼具有藥學或獸醫(yī)學價值的蛋白質的表達盒轉化本發(fā)明的轉質體豆科植物。例如，所述蛋白質可以是抗凝劑(血清蛋白酶、水蛭素)、干擾素或人血清白蛋白。本發(fā)明中植物生產的蛋白質也可以是抗體、或用作疫苗基礎的蛋白質。本發(fā)明一個主題還是含有本發(fā)明構建體的轉質體植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。優(yōu)選含有本發(fā)明的構建體的轉質體豆科植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。更優(yōu)選有農用價值的轉質體豆科植物，如蜿豆、大蠶豆、小蠶豆、小扁豆、黃豆、鷹嘴豆、大豆、落花生、紫花苜?；蛉~草的細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。甚至更優(yōu)選的是轉質體大豆(高甘氨酸)的植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。本發(fā)明一個主題還是用上述方法之一獲得的含有感興趣轉基因而無選擇性標記的轉質體植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。優(yōu)選含有感興趣轉基因而無選擇性標記的轉質體植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。可用上述方法之一獲得這種轉質體豆科植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。更優(yōu)選有農用價值的轉質體豆科植物，如蜿豆、大蠶豆、小蠶豆、小扁豆、黃豆、鷹嘴豆、大豆、落花生、紫花苜蓿或三葉草的細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。甚至更優(yōu)選的是轉質體大豆(高甘氨酸)的植物細胞、植株或該植物的部分、和該植物的后代。術語“該植物的部分”是指該植物的任何器官，不論是氣生或地生部分。氣生器官有莖干、葉和包括雄性和雌性生殖器的花。地生器官主要是根，但也可以是根莖。術語“后代”或“后裔”主要指含這些植物互相交配所產生胚胎的種子。術語“后代”或“后裔”可擴大到至少親本之一是本發(fā)明的轉化植物交配產生的各新一代植物所形成的種子。也可通過所述轉化植物的無性繁殖獲得后代。本發(fā)明的種子可用農化組合物包衣，該農化組合物包含至少一種具有選自殺真菌劑、除草劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、殺菌劑或殺病毒劑的活性的產
15品。本發(fā)明還涉及通過加工本發(fā)明的植物、其部分或種子獲得的任何產品如食物或油。例如，本發(fā)明包括加工本發(fā)明的豆科植物獲得的油，或加工本發(fā)明的種子獲得的谷物， 還包括進一步加工所述種子、谷物或植物獲得的食物，以及從所述食物獲得的食品。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的構建體在獲得無選擇性標記的轉質體植物細胞或植株中的應用。優(yōu)選其在獲得轉質體豆科植物細胞或植株中的應用。更優(yōu)選其在獲得有農用價值的轉質體豆科植物如蜿豆、大蠶豆、小蠶豆、小扁豆、黃豆、鷹嘴豆、大豆(高甘氨酸)、落花生、紫花苜?；蛉~草中的應用。更優(yōu)選其在獲得轉質體大豆(高甘氨酸)植物細胞或植株中的應用。John Wiley&Sons Inc. 1994 $ 出片反，Ausubel ( IS ) ^ Current Protocols in Molecular Biology(《新編分子生物學實驗指南》)和冷泉港實驗室出版社(紐約冷泉港)1989 年出版，Maniatis T.、Fritsch E. F.和 Sambrook J.的 Molecular Cloning :A laboratory Manual (《分子克隆實驗手冊》)描述了可用于實施本發(fā)明的分子生物學技術。 在帕金埃爾默(Perkin Elmer)公司的GeneAmp PCR系統(tǒng)9600裝置中進行PCR反應。各樣品的擴增反應進行30輪，過程包括下列步驟94°C變性1分鐘，根據(jù)所用引物在50-60°C下配對45秒，在72°C下根據(jù)要擴增的PCR產物的大小延伸1-2分鐘。在循環(huán)擴增之前在94°C 變性5分鐘，循環(huán)完成后72°C最終延伸5分鐘。30輪后4°C保持。用瓊脂糖凝膠分離PCR 產物。通過以下實施例更具體地闡述本發(fā)明，應當理解這些實施例不是限制性的。 實施例實施例1 構建用于去除標記基因的質體轉化載體a)構建 pCLT339 (含 aadA+gfp)從pCLT323(Dufourmantel 等，2007-Plant Biotechnol. J. 5(1) :118-133)產生大豆質體轉化載體PCLT339。合成了含有方便克隆入PCLT323的限制性位點OihoI和SwaI)的序列pCLT435。 該序列含有在玉米16S rDNA質體啟動子調控下連接了 aadA選擇標記和gfp基因的雙順反子表達盒。該表達盒斷開了非功能性的質體bar表達盒，后者編碼BAR的N-末端片段上游組分G53bp，Nter)和BAR的C-末端下游元件058bp，C_ter)。這二個不完整的BAR片段含有367個核苷酸的正向重疊。對bar和gfp序列進行密碼子優(yōu)化使其符合煙草質體的密碼子使用。b)構建 pCLTIMO (含 aadA 無 gfp)構建了缺乏gfp報告基因的衍生大豆質體轉化載體。用MlI和SpeI酶切割 PCLT339，形成鈍端和再連接，直接獲得該pCLT340載體。實施例2 產生轉質體大豆植株按照專利W0/2004/053133 和 Dufourmantel 等 G2004)Plant Mol. Biol. 55(4) 479-489)所述方法，采用壯觀霉素作為選擇試劑制備載體PCLT339和pCLT340的轉質體大
豆植株。在UV照射下檢查選出的植株，所有轉化了 pCLT339的受檢器官顯示了均一的報告基因表達，而轉化PCLT340的顯然沒有。分離第一代再生植物(PCLT339)的葉蛋白用考馬斯蘭染色和蛋白印跡(western blot)分析，清楚顯示該品系強烈表達GFP。實施例3 去除選擇性標記基因并評價bar基因的恢復將轉質體植株(TO代)移種溫室，正常結子。按Dufourmantel等Q004)所述對該后代啟動未成熟胚胎的胚胎培養(yǎng)取一些增殖愈傷組織接觸不同濃度的L-草胺膦(kista) 以偏向通過bar-Nter與bar_Cter之間的同源重組去除了 aadA-gfp抗生素標記(將恢復功能性除草劑bar耐受基因)的植物細胞生長。在UV下檢查所產生的愈傷組織有無表達 PCLT339相應物質。胚胎培養(yǎng)物中大多數(shù)顯示了均一的GFP表達，只有小百分比的受檢愈傷組織，不論是否接觸過basta，清晰顯示表明GFP丟失的紅色部分。分離所述紅色部分并在體外進一步增殖，然后再生成植株(Tl代)，移至溫室。實施例4 品系的分子分析。采用不同引物對在DNA水平上對選出的pCLT339轉基因品系進行PCR分析。對選出的兩個TO代pCLT339轉基因植物進行第一次PCR分析，使用的引物對是 0SSG511(5，-CATGGGTTCTGGCAATGCAATGTG-3，)和 0SSG311(5，-CAGGATCGAACTCTCCATGAGATT CC-3’)。該引物結合于質體基因組插入位點的兩側，因而得以精確測定所選材料的同型異源性水平。此分析清楚顯示在這兩個被分析的轉質體品系中沒有對應于野生型質體基因組的信號，表明所選品系是轉基因的同質品系(圖3a)。對兩個TO代植物(GFP陽性)和六個由UV下紅色的GFP陰性部分再生的Tl代植物進行第二次擴增。引物對 ftrn-Zm-lFG，-ACCACGATCGAACGGGAATGG-3，)和 aadA_780R( 5，-CGACTACCTTGGTGATCTCG-3，)使能擴增aadA選擇標記盒。此分析的結果顯示，GFP陰性再生大豆品系不再存在aadA抗生素選擇標記(圖北)。用市售LL試劑盒(Liberty Link公司)進行BAR蛋白檢測試驗。結果顯示轉質體大豆的提取物觀察到特定信號，表明在bar正向重復序列之間精確發(fā)生了 aadA-gfp盒的去除，恢復了功能性除草劑耐受的表達盒(圖3c)。實施例5:田間試驗采用轉質體品系進行田間試驗，并與市售的LL27和LL55品系作比較，市售品系中 bar基因引入植物的核基因組中，編碼細胞質草胺膦乙酰轉移酶(PAT)。在大豆生長的V4期，在上述品種的頂部以農用水平450g a. i. /ha噴霧市售除草劑 Ignite 。在14DAA (應用后天數(shù))時進行植物評估。轉質體品系顯示出比該試驗中其它大豆品種更耐受除草劑草丁膦。LL27和LL55品系呈現(xiàn)典型的黃葉，這在商業(yè)上是可接受的。轉質體植物沒有此種脫色。文獻目錄*Andreason 禾口 Evans，Biotechniques 6 (7) (1988)，650—660*Austin Ε. A 等，1993，Journal of bacteriology, vol. 175，noil, pp. 3685—3686*Bevan 和 Chilton, Annu. Rev. Genet. 16 (1982)，357-384*Boynton J. E. ，Gillham N. W. ，Harris Ε. H. ，Hosier J. P. ，Jones A. R.，Randolph-Anderson B. L. , Robertson D·, Klein Τ. Μ.,禾口 SharkK.B.Science240(1988)，1534-1538*Bruce 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24)，(1989) 9692-9696*Carrer H.等 Mol. Gen. Genet. 241 (1993)，49-56*Chang 和 Cohen, Mol. Gen. Genet. 168 (1) (1979), 111-115*Chaudhuri S. (1999). WO 00/39313*Chuck G.等，(1993)The plant cell, vol 5， N° 4，pp. 371-378*Comai 等，Science 221 (1983)，370-371*Crickmore N.等，1998, Microbiology and molecular biology reviews, P807-813*Crouch Tetrahedron, (1997)，53，20，6993-7010*Daniell H. , Datta R. , Varma S. ,Gray S.，禾口 Lee S. B. Nat. Biotechnol. 16(4) (1998)345-348*Daniell H.等，Curr Genet. 39 (2001) 109-116*De Cosa B. , Moar W. , Lee S. B. , Miller Μ.,禾口 Daniell H. Nat. Biotechnol. 19(1) (2001). 71-74*Eibl C.等 1999，Plant J 19:333-345*Fischer N. , Stampacchia 0. , Redding K.,禾口 Rochaix J. D. Mol. Gen. Genet. 251 (1996). 373-380*Gasser 等，J. Biol. Chem.，263 (1988)，4280-4289tamborg 等，Exptl Cell Res 50，(1968)，151-158*Gordon 和 Ruddle，Gene 33(2), (1985)，121-136*Himi E.等，Euphytica，2005，Vol 143，N° 3，pp. 239-242*Himi E.等，2005，Genome，vol 48, N° 4，pp. 747-754 (8)；*Himi E.等，2005，J Exp Bot 53:1569-1574*Ishida 等，Nat. Biotechnol. 14(6)，(1996)，745-750*Khan M.S.和 Maliga P. Nat. Biotechnol. 17，(1999). 910-915*Klein 等，Biotechnology 10 (3)，(1992)，286-291*Knopf, Subcell. Biochem. 6，(1979)，143-173*Lutz K. A.，Knapp J. E.，和Maliga P. Plant Physiol. 125(4) : (2001)，1585-1590*McBride K. E. ， Svab Ζ. ， Schaaf D. J. ，Hogan P. S. ， Stalker D. Μ.，禾口 Maliga P.Biotechnology 13(4) (1995). 362-365*Murashige 等，Physiologia Plantarum 15，(1962)，473—497*Mercenier 和 Chassy，Biochimie 70 (4)，(1988)，503-517*Naested 等，1999 plant J ；18 (5), pp. 571-576*Padgette S. R.等，J. Biol. Chem.，266 (1991)，33*Pallett 等，pestc. Sci. 50 (1997)，83-84*Phillips G(2001)FEMS Microbiol Lett 204(1) :9-18*Ruetschi 等，Eur. J. Biochem. 205，(1992)，459—466*Ruf 等，Plant Physiol. 96 (S) (1991)，Abstract 592
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權利要求
1.一種構建體，其在轉錄方向上含有至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記嵌合基因，和(ii)嵌合色素基因、或編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因、或編碼陰性標記的嵌合基因；二者分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段，其中當嵌合基因(ii)編碼陰性標記時所述感興趣基因不作為全長基因存在。
2.如權利要求1所述的構建體，其特征在于，所述感興趣的基因不作為全長基因存在。
3.如權利要求1或2所述的構建體，其特征在于，所述發(fā)光蛋白是綠色熒光蛋白或螢光素酶。
4.如權利要求1活2所述的構建體，其特征在于，所述編碼陰性標記的嵌合基因是 CodA基因。
5.如權利要求1-4中所述的構建體，其特征在于，所述感興趣的嵌合基因是bar基因、 編碼羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的基因、編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS) 的基因、或編碼蘇蕓金芽胞桿菌(Bt)殺蟲蛋白的基因。
6.一種獲得無選擇性標記的轉質體植物細胞或植株的方法，該方法包括至少以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個植物細胞，該載體包含至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和(ii)嵌合色素基因、或編碼發(fā)光蛋白的嵌合基因；兩者分別插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有該選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的細胞；c)在不含有該選擇試劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；d)采用(ii)編碼發(fā)光蛋白嵌合基因時選擇不發(fā)光植物細胞或植株、或采用(ii)嵌合色素基因時選擇無色植物細胞或植株。
7.一種獲得無選擇性標記的轉質體植物細胞或植株的方法，該方法包括至少以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個植物細胞，該載體包含至少(i)編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，和(ii)編碼陰性選擇性標記的嵌合基因；兩者分別插入在感興趣嵌合基因的5’-末端序列與3’-末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有該選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的細胞；c)在不含有該選擇試劑和防止表達陰性標記的細胞生長的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；d)選擇在此第二培養(yǎng)基中生長的植物細胞。
8.如權利要求6-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述植物和植物細胞是雙子葉植物和植物細胞。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物和植物細胞是豆科植物和植物細胞，優(yōu)選大豆植物和植物細胞。
10.含有權利要求1-5中任一項所述構建體的轉質體植物細胞。
11.如權利要求10所述的植物細胞，是子葉轉質體基因植物細胞。
12.如權利要求11所述的植物細胞，是豆科子葉轉質體基因植物細胞，更優(yōu)選大豆植物細胞。
13.一種獲得無選擇性標記的轉質體豆科植物細胞或植株的方法，該方法包括至少以下步驟a)用適合轉化質體的載體轉化至少一個豆科植物細胞，該載體至少包含一個編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，該嵌合基因分別插入在感興趣嵌合基因的 5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段；b)在含有該選擇試劑的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)含轉化質體的豆科植物細胞；c)在不含有該選擇試劑的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述豆科植物細胞。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述豆科植物細胞和植物是大豆植物細胞和植物。
15.如權利要求6-9或13-14中任一項所述的方法，其特征在于，所述感興趣的嵌合基因是bar基因、編碼羥苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的基因、編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因、或編碼蘇蕓金芽胞桿菌(Bt)殺蟲蛋白的基因。
16.一種含有構建體的轉質體豆科植物細胞，優(yōu)選轉質體大豆植物細胞，所述構建體在轉錄方向上包含至少一個編碼能賦予對選擇試劑抗性的選擇性標記的嵌合基因，該嵌合基因插入在感興趣嵌合基因的5’ -末端序列與3’ -末端序列之間，其中這二個序列含有長度適合它們重組的重疊片段。
17.一種含有感興趣轉基因而無選擇性標記的轉質體豆科植物細胞，優(yōu)選轉質體大豆植物細胞。
18.一種轉質體豆科植物，優(yōu)選大豆植物，其特征在于，其含有權利要求16-17之一所述的轉質體植物細胞。
19.一種轉質體豆科種子植物，優(yōu)選大豆種子植物，其特征在于，其含有權利要求 16-17之一所述的轉質體植物細胞，并且源自權利要求18所述的轉質體植物。
20.加工權利要求18所述的轉質體植物或權利要求19所述的轉質體種子所產生的油禾口食品。
全文摘要
本發(fā)明涉及不含選擇性標記的轉質體植物，特別是轉質體豆科植物，涉及獲得這類植物的方法和所用的載體及構建體。
文檔編號A01H5/00GK102272310SQ200980154340
公開日2011年12月7日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權日2009年1月7日
發(fā)明者A·羅蘭多, B·佩利西耶, C·萊斯特拉德, M·杜巴爾德 申請人:拜爾農科股份公司