專利名稱：一種西瓜苗期疫病抗性的鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于西瓜育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及種一種西瓜疫病苗期抗性的鑒定方法。
背景技術(shù)：
西瓜疫病也叫疫霉病，俗稱瓜瘟，是西瓜上發(fā)生的一種毀滅性病害。疫病發(fā)病周期 短，流行速度快，一旦染病，很難治愈，給西瓜生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在生產(chǎn)上主要 依靠化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但由于化學(xué)藥劑的防治受多種環(huán)境因素的影響，防治受到限制，防 效不顯著，同時(shí)會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的污染。目前對(duì)西瓜疫病的抗性篩選未形成一套具體的研 究方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種西瓜苗期疫 病抗性的鑒定方法，該方法本發(fā)明的目的在于提供一套準(zhǔn)確實(shí)用的西瓜疫病苗期人工接種 抗性鑒定方法。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)解決方案是，一種西瓜疫病苗期灌根接種抗性鑒定方法，具 體包括下列步驟1. 一種西瓜疫病苗期抗性的鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟1)在二葉期距無(wú)菌苗根部約1 2cm處，扎一 3cm深的孔，將3ml濃度為1 X 106 個(gè)孢子/ml游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，于25 28°C，相對(duì)濕度95 100%的黑暗條件下保 濕24h，以后給予12h/d光照，記錄接種后第12 15d內(nèi)的發(fā)病率和病情指數(shù)；2)根據(jù)記錄數(shù)據(jù)將西瓜幼苗對(duì)疫病的抗性分為0、1、2、3、4、5共六級(jí)；0級(jí)無(wú)任 何癥狀；1級(jí)幼苗莖基部出現(xiàn)縊縮，植株倒伏，但不萎蔫；2級(jí)幼苗莖基部出現(xiàn)縊縮，但縊 縮面不超過(guò)株高的1/3，莖部褐色水漬狀病斑，子葉萎蔫，植株倒伏；3級(jí)幼苗莖部縊縮面 超過(guò)整株的1/3，但不超過(guò)株高的2/3，縊縮部褐色，子葉干枯；4級(jí)幼苗莖部縊縮面超過(guò)株 高的2/3或蔓延至全莖，縊縮部黑褐色，子葉干枯，真葉萎蔫；5級(jí)植株枯死；所述有病情指數(shù)的(DI)計(jì)算公式如下病情指數(shù)(DI) = [ E (病級(jí)數(shù)值X該病級(jí)病株數(shù))X 100]/(病級(jí)最高值X調(diào) 查株數(shù))抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)免疫(I)病情指數(shù)為0 ；高抗(HR)病情指數(shù)為0 < DI彡10 ；抗病(R)病情指數(shù)10 < DI ^ 30 ；中抗(MR)病情指數(shù)30 < DI ^ 50 ；感病(S)病情指數(shù)50 < DI ^ 70 ；高感(HS)病情指數(shù)70 < DI ^ 100。本發(fā)明人采用游動(dòng)孢子液灌根接種法從接種濃度、接種時(shí)期、接種后最佳病情調(diào) 查時(shí)期等方面進(jìn)行研究，提出一套準(zhǔn)確而實(shí)用的西瓜苗期疫病人工接種抗性鑒定、篩選的
3方法和程序，為開(kāi)展西瓜抗病育種工作提供技術(shù)依據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1.與其它接種方法(噴霧法、針刺法、浸根法)相比，更接近大田環(huán)境，對(duì)品種的抗 性鑒定更準(zhǔn)確。2.與其它接種濃度、接種苗齡、接種后病情調(diào)查期相比，在兩片真葉期接種1X106 個(gè)孢子/ml濃度的孢子懸浮液，抗病品種、感病品種的病情指數(shù)差異明顯，容易區(qū)分抗感品 種；接種后在12 15d范圍內(nèi)，病情指數(shù)比較穩(wěn)定，適合病害程度調(diào)查。3.病情分級(jí)完全體現(xiàn)了西瓜幼苗疫病發(fā)病的全過(guò)程，各等級(jí)病害特征明顯。


圖1為本發(fā)明方法中病情等級(jí)從左至右依次為0、1、2、3、4、5級(jí)的幼苗現(xiàn)狀圖。圖2為本發(fā)明方法中不同抗性品種接種后病情發(fā)展趨勢(shì)圖。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)發(fā)明人給出的具體實(shí)施例和試驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的方法的有益 效果。實(shí)施例11. 一個(gè)西瓜品種京父_3苗期抗性的鑒定方法，包括下列步驟1)當(dāng)京父-3長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)，在距其根部約lcm處，扎一 3cm深的孔，將3ml濃度 為1X106個(gè)孢子/ml游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，接種15株，3次重復(fù)，然后在晝溫30°C，夜 溫24°C，相對(duì)濕度95%的黑暗條件下保濕24h，之后給予12h/d光照，記錄接種后第13d的 發(fā)病率和病情指數(shù)。2)京父-3總接種株數(shù)45株，發(fā)病株數(shù)12株，發(fā)病率為26. 7 %。病情指數(shù)(DI) = [ E (病級(jí)數(shù)值X該病級(jí)病株數(shù))X 100]/(病級(jí)最高值X調(diào) 查株數(shù))=[(0 X 33+1 X 0+2 X 0+3 X 3+4 X 6+5 X 3) X 100] / (5 X 45) = 21. 3根據(jù)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)得出京父_3屬于抗病品種。實(shí)施例21. 一個(gè)西瓜品種GS-37苗期抗性的鑒定方法，包括下列步驟1)當(dāng)GS-37長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)，在距其根部約lcm處，扎一 3cm深的孔，將3ml濃度 為1X106個(gè)孢子/ml游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，接種15株，3次重復(fù)，然后在晝溫30°C，夜 溫24°C，相對(duì)濕度95%的黑暗條件下保濕24h，之后給予12h/d光照，記錄接種后第13d的 發(fā)病率和病情指數(shù)。2) GS-37總接種株數(shù)45株，發(fā)病株數(shù)34株，發(fā)病率為75.6%。病情指數(shù)(DI) = [ E (病級(jí)數(shù)值X該病級(jí)病株數(shù))X 100]/(病級(jí)最高值X調(diào) 查株數(shù))=[(0 X 11+1 X 4+2 X 7+3 X 6+4 X 5+5 X 12) X 100] / (5 X 45) = 51. 6根據(jù)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)得出GS_37屬于感病品種。實(shí)施例31. 一個(gè)西瓜品種G-S-12苗期抗性的鑒定方法，包括下列步驟1)當(dāng)G-S-12長(zhǎng)至兩片真葉時(shí)，在距其根部約lcm處，扎一 3cm深的孔，將3ml濃度為1X106個(gè)孢子/ml游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，接種15株，3次重復(fù)，然后在晝溫30°C，夜 溫24°C，相對(duì)濕度95%的黑暗條件下保濕24h，之后給予12h/d光照，記錄接種后第13d的 發(fā)病率和病情指數(shù)。2) G-S-12總接種株數(shù)45株，發(fā)病株數(shù)45株，發(fā)病率為100 %。病情指數(shù)(DI) = [ E (病級(jí)數(shù)值X該病級(jí)病株數(shù))X 100]/(病級(jí)最高值X調(diào) 查株數(shù))=[(2 X 10+3 X 5+4 X 12+5 X 18) X 100] / (5 X 45) = 76. 8根據(jù)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)得出G-S_12屬于高感品種。試驗(yàn)例11材料與方法1. 1 材料1. 1. 1西瓜品種京父-3 (抗病品種)、GS_37 (感病品種)、G_S_12 (高感品種)，由西北農(nóng)林科技大 學(xué)園藝學(xué)院西瓜課題組提供。1. 1. 2西瓜疫霉菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院西瓜課題組提供，該菌種分離自陜西楊 凌新天地農(nóng)業(yè)示范園種植的西瓜品種上。1. 2 方法1. 2. 1病原菌的提取將被感染的西瓜植株取下，用滅菌手術(shù)刀在病健交界處切取小段，用75%的酒精 浸泡2 3s，無(wú)菌水沖洗3次，再用0. 1 %的升汞浸泡2 3min然后用無(wú)菌水沖洗3遍，并 用無(wú)菌吸水紙吸干表面的水分，在無(wú)菌操作下，用刀片、剪刀等器具，削去蔓的皮，然后取中 間維管束組織，用剪刀剪成數(shù)枚小塊，分散移植到PDA培養(yǎng)基上，在28°C按培養(yǎng)3 4天后 進(jìn)一步純化、擴(kuò)繁。純化后的菌株保存在PDA斜面上，置4°C冰箱中貯存?zhèn)溆谩?duì)分離保存 的菌株，用柯赫氏法則進(jìn)行回接，觀察癥狀表現(xiàn)與原發(fā)病株癥狀相同，進(jìn)行再分離，在顯微 鏡下觀察分離菌體與原接種菌株相同。1. 2. 2菌種的培養(yǎng)和菌液的制備將供試菌種轉(zhuǎn)移到盛有PAD培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)， 待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，放到40W日光燈下照射7d，誘導(dǎo)孢子囊的產(chǎn)生，備用。向誘好孢子囊的培養(yǎng)皿中加入10ml無(wú)菌水，于4°C放置30min誘導(dǎo)游動(dòng)孢子釋放， 隨后室溫光照2h后用消毒毛筆刷洗培養(yǎng)基表面，雙層紗布過(guò)濾，收集游動(dòng)孢子懸浮液，用 血球計(jì)數(shù)板鏡檢游動(dòng)孢子，并調(diào)整懸浮液中游動(dòng)孢子數(shù)量到所需濃度時(shí)立即使用。1. 2. 3西瓜苗的培養(yǎng)西瓜育苗選用中型塑料育苗缽；育苗基質(zhì)用草炭、珍珠巖按3 1的比例配制；基 質(zhì)的消毒每立方米基質(zhì)加100g多菌靈。用55°C溫水浸泡種子，用水量為種子量的3倍左 右，并不斷攪拌，待水溫降低至30°C時(shí)取出種子，再用2%的漂白粉消毒lOmin (分)，用清水 沖洗干凈，在室溫下浸種，6-8h，然后用清水沖洗2-3遍，搓洗掉種子上的粘液。將種子裝入 小燒杯中，用濕布蓋好，置于30°C下催芽，待種子露白時(shí)直接播于育苗缽中，深度1cm左右。 播種后室內(nèi)正常水肥管理。1.2. 4不同接種濃度試驗(yàn)
5
將游動(dòng)孢子懸浮液設(shè)為1 X 107個(gè)/ml、1 X 106個(gè)/ml、1 X 105個(gè)/ml的3個(gè)懸浮液， 以蒸餾水為對(duì)照，采用灌根法接種于二葉期的無(wú)菌苗上，在距幼苗根部約1 2cm處，扎一 3cm深的孔，將3ml濃度為107 105個(gè)/ml的飽子懸浮液注入孔內(nèi)。于25 28°C，相對(duì)濕 度95 100%的黑暗條件下保濕24h，以后給予正常的光周期，觀察發(fā)病情況。1.2. 5不同幼苗形態(tài)接種試驗(yàn)接種苗齡分3個(gè)時(shí)期子葉期、二葉期、四葉期，孢子懸浮液濃度采用1X106個(gè)/ ml，采用灌根法，其他同“1.2. 3”。1.2. 6接種后不同時(shí)期調(diào)查病情試驗(yàn)于二葉期用灌根法接種，濃度為1X106個(gè)/ml。從接種后的第6d開(kāi)始，每天調(diào)查 發(fā)病率和病情指數(shù)，觀察病情發(fā)展情況，以確定一個(gè)最適調(diào)查時(shí)期。1.2.7病情分級(jí)參考辣椒疫病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將西瓜幼苗對(duì)疫病的抗性分為0、1、2、3、4、5共六級(jí)。0 級(jí)無(wú)任何癥狀；1級(jí)幼苗莖基部出現(xiàn)縊縮，植株倒伏，但不萎蔫；2級(jí)幼苗莖基部出現(xiàn)縊 縮，但縊縮面不超過(guò)株高的1/3，莖部褐色水漬狀病斑，子葉萎蔫，植株倒伏；3級(jí)幼苗莖部 縊縮面超過(guò)整株的1/3，但不超過(guò)株高的2/3，縊縮部褐色，子葉干枯；4級(jí)幼苗莖部縊縮面 超過(guò)株高的2/3或蔓延至全莖，縊縮部黑褐色，子葉干枯，真葉萎蔫；5級(jí)植株枯死。病情 指數(shù)(DI)計(jì)算公式如下病情指數(shù)(DI) = [ E (病級(jí)數(shù)值X該病級(jí)病株數(shù))X 100]/(病級(jí)最高值X調(diào) 查株數(shù))抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)免疫(I)病情指數(shù)為0 ；高抗(HR)病情指數(shù)為0 < DI < 10 ；抗 病(R)病情指數(shù)10 < DI彡30沖抗(MR)病情指數(shù)30 < DI ^ 50 ；感病(S)病情指數(shù) 50 < DI ^ 70 ；高感(HS)病情指數(shù) 70 < DIS 100。2結(jié)果與分析2. 1不同接種濃度對(duì)發(fā)病的影響由表1可知，在1X105個(gè)/ml孢子濃度下，高感品種“G-S-12”表現(xiàn)感??；感病品種 “GS-37”表現(xiàn)中抗；發(fā)病率降低，而且發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，不利于病情調(diào)查；抗病品種“京父-3” 表現(xiàn)高抗，均不能真實(shí)反映三個(gè)品種的抗性水平。在IX 107個(gè)/ml孢子濃度下，由于濃度過(guò) 高，高感品種“G-S-12”的病情指數(shù)接近了 100，發(fā)病過(guò)重；感病品種“GS-37”表現(xiàn)高感；抗 病品種“京父-3”表現(xiàn)感病，也不能真實(shí)的反映三個(gè)品種的抗性水平。在1X106個(gè)/ml孢 子濃度下，抗病品種、感病品種與高感品種的病情指數(shù)差異明顯，容易區(qū)分抗感品種。因此 在苗期人工接種鑒定中，適宜的接種孢子液濃度確定為IX 106個(gè)/ml。表1接種濃度對(duì)發(fā)病的影響
6 由表2可知，隨著苗齡的增長(zhǎng)，植株的抗病性增強(qiáng)，發(fā)病率降低。子葉期與二片真 葉期和四片真葉期的病情指數(shù)差異顯著；子葉期的感病品種“GS-37”與高感品種“G-S-12” 的發(fā)病率和病情指數(shù)都很高；二片真葉期的抗病品種“京父_3”、感病品種“GS-37”與高感 品種“G-S-12”的病情指數(shù)差異也達(dá)到顯著水平，發(fā)病率和病情指數(shù)大小適中，適合進(jìn)行抗 病性鑒定。2. 3接種后不同調(diào)查時(shí)期病情發(fā)展情況調(diào)查結(jié)果圖2為不同抗性品種接種后病情發(fā)展趨勢(shì)圖，感病品種“GS-37”與高感品種 “G-S-12”在接種后第6d開(kāi)始出現(xiàn)病株，抗病品種“京父-3”在第7d有少數(shù)病株出現(xiàn)。在 接種后的8 lid里，各品種的發(fā)病指數(shù)均有不同程度上升，說(shuō)明在這段時(shí)間里病情發(fā)展較 快。第lid后，各品種的病情指數(shù)的發(fā)展趨于平緩。接種15d后，高感品種“G-S-12”的病 情發(fā)展得過(guò)于嚴(yán)重，而且感病品種“GS-37”的病情指數(shù)也上升較高。由此認(rèn)為，在接種后第 12d，這三個(gè)不同抗性的品種都表現(xiàn)出其客觀的抗病性，在第12 15d這個(gè)時(shí)期內(nèi)，病情指 數(shù)比較穩(wěn)定，進(jìn)行病害程度調(diào)查是適宜的。
權(quán)利要求
一種西瓜苗期疫病抗性的鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟1)在二葉期距無(wú)菌苗根部約1～2cm處，扎一3cm深的孔，將3ml濃度為1×106個(gè)孢子/ml游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，于25～28℃，相對(duì)濕度95～100％的黑暗條件下保濕24h，以后給予12h/d光照，記錄接種后第12～15d內(nèi)的發(fā)病率和病情指數(shù)；2)根據(jù)記錄數(shù)據(jù)將西瓜幼苗對(duì)疫病的抗性分為0、1、2、3、4、5共六級(jí)；0級(jí)無(wú)任何癥狀；1級(jí)幼苗莖基部出現(xiàn)縊縮，植株倒伏，但不萎蔫；2級(jí)幼苗莖基部出現(xiàn)縊縮，但縊縮面不超過(guò)株高的1/3，莖部褐色水漬狀病斑，子葉萎蔫，植株倒伏；3級(jí)幼苗莖部縊縮面超過(guò)整株的1/3，但不超過(guò)株高的2/3，縊縮部褐色，子葉干枯；4級(jí)幼苗莖部縊縮面超過(guò)株高的2/3或蔓延至全莖，縊縮部黑褐色，子葉干枯，真葉萎蔫；5級(jí)植株枯死；所述有病情指數(shù)的(DI)計(jì)算公式如下病情指數(shù)(DI)＝[∑(病級(jí)數(shù)值×該病級(jí)病株數(shù))×100]/(病級(jí)最高值×調(diào)查株數(shù))抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)免疫(I)病情指數(shù)為0；高抗(HR)病情指數(shù)為0＜DI≤10；抗病(R)病情指數(shù)10＜DI≤30；中抗(MR)病情指數(shù)30＜DI≤50；感病(S)病情指數(shù)50＜DI≤70；高感(HS)病情指數(shù)70＜DI≤100。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種西瓜苗期疫病抗性的鑒定方法，該方法是在二葉期距無(wú)菌苗根部約1～2cm處，扎一3cm深的孔，將3ml濃度為1×106個(gè)孢子/ml游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，于25～28℃，相對(duì)濕度95～100％的黑暗條件下保濕24h，以后給予12h/d光照，記錄接種后第12～15d內(nèi)的發(fā)病率和病情指數(shù)；根據(jù)記錄數(shù)據(jù)將西瓜幼苗對(duì)疫病的抗性分為0、1、2、3、4、5共六級(jí)。該鑒定方法為西瓜抗病育種工作提供技術(shù)依據(jù)。
文檔編號(hào)A01G13/00GK101849469SQ201010173589
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者張顯, 王永琦 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)