一種稻粒黑粉病抗性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，本發(fā)明選育稻粒黑粉病抗性品種雜交種F1，并對雜交種F1通過分子標(biāo)記得到抗稻粒黑粉病的基因位點(diǎn)，并確定稻粒黑粉病在第1號染色體上的位置。本發(fā)明涉及的稻粒黑粉病抗性檢測方法，通過檢測水稻品種第1號染色體上引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，評估其對稻粒黑粉病的抗性，大大提高抗稻粒黑粉病水稻的選擇效率。
【專利說明】
一種稻粒黑粉病抗性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，具體涉及在稻粒黑粉病抗性品種的1 號染色體上分子標(biāo)記出稻粒黑粉病抗性基因的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻稻粒黑粉病又稱黑穗病、稻墨黑穗病、烏米谷等。分布在我國長江流域及以南 地區(qū)，主要發(fā)生在水稻揚(yáng)花至乳熟期，只為害谷粒，每穗受害1?；驍?shù)粒乃至數(shù)十粒，一般在 水稻近成熟時(shí)顯癥。水稻稻粒黑粉病是一種最典型的母本特殊病害，大田普通水稻及少感 病，但在雜交水稻制種田中，發(fā)病普遍而嚴(yán)重，一般損失10~20 %，甚至有些高達(dá)50%以上。 因此，對稻粒黑粉病的研究與防治成為雜交水稻制種領(lǐng)域的重要課題。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)防治稻粒黑粉病主要方法是利用化學(xué)藥劑，化學(xué)藥劑的使用不可避免地 對環(huán)境造成污染和破壞?，F(xiàn)有技術(shù)還有的通過在生產(chǎn)過程中改進(jìn)栽培技術(shù)條件對稻粒黑粉 病進(jìn)行防治的措施，但收效甚微。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)在水稻生產(chǎn)上對稻粒黑粉病的防治對策在一定程度上增加了水稻生產(chǎn) 的成本，并且加重了環(huán)境壓力。
[0005] 利用水稻品種抗性被認(rèn)為是目前防治稻粒黑粉病最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。將栽培水 稻或野生稻中的稻粒黑粉病抗性基因轉(zhuǎn)育到主栽稻品種中，是獲得安全的稻粒黑粉病抗性 品種的最有效方法，但現(xiàn)有技術(shù)育種的進(jìn)程緩慢且未有專門針對稻粒黑粉病抗體的育種方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，選育 稻粒黑粉病抗性品種雜交種F1，并運(yùn)用SSR分子標(biāo)記從稻粒黑粉病抗性品種中在1號染色體 上標(biāo)記出稻粒黑粉病抗性基因。
[0007] 具體步驟如下：
[0008] (1)雜交種F1的獲得：以稻粒黑粉病抗源中優(yōu)781為母本，稻粒黑粉病高感品種揚(yáng) 稻6號為父本，二者正季播種，于實(shí)驗(yàn)秧田，單株移栽，株行距為30 X 30cm; -般大田肥水和 病蟲草害管理，至植株正常生長到揚(yáng)花期，將中優(yōu)781植株的稻穗浸入39~46°C的溫水中， 浸泡6~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將中優(yōu)781 植株的稻穗套好并作標(biāo)記，待用。當(dāng)揚(yáng)稻6號植株進(jìn)入開花期時(shí)，將揚(yáng)稻6號植株上稻穗的花 藥均勻落到紙袋中中優(yōu)781植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交 稻穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1。
[0009] (2)雜交種F1的花藥愈傷誘導(dǎo)：雜交種F1正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/ 2為標(biāo)準(zhǔn)取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個(gè)稻穗，保持稻穗濕潤 放入冰箱中，在4°C下低溫預(yù)處理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒 處理2~10分鐘，晾干后用剪開花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在22~ 28°C下暗培養(yǎng)2~3天后，轉(zhuǎn)移至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗 下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，50天后將獲得的雜交種F1的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移 植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通過篩選即獲得稻粒黑粉病抗性品種。
[0010] 所述第一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，煙酸0.5mg/ L，瓊脂7.5g/L;激動素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/L，秋水仙堿 0 · 3mg/L; pH 值為6 · 0。
[0011]所述第二培養(yǎng)基的成分為:MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/ L，維生素 B1 0.4mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素 O.lmg/ L，甲基亞硝基脲0.8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1. Og/L;以及濃度20 %的稻粒黑粉病 菌粗毒素提取液，pH值為6.0。
[0012] 所述稻粒黑粉病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染稻粒黑粉病水稻的穗頸部 剪下，清潔表面后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產(chǎn)生后加入營養(yǎng)瓊脂繼 續(xù)培養(yǎng)，得到菌株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分 鐘、過濾、以500~1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細(xì)菌性基腐病菌粗 毒素。
[0013] (3)預(yù)處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細(xì)粉，加入體積百分比2%的β-巰基 乙醇，震蕩，加入50mM的三(羥甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質(zhì)量體 積百分比為2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質(zhì)量體積百分比為5%的十六烷基三甲基溴化銨 CTAB，混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將 混合物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄 上清液得到DNA沉淀物。
[0014] 所述水稻葉片與β-巰基乙醇、1^8-!1(：1、？￥?、0^的質(zhì)量體積比11^/^/^/^/^ 為1:1 ~5:1 ~5:3~8:8~12,優(yōu)選為1:3:3:5:10。
[0015] 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm，優(yōu)選為900rpm。
[0016] (4)SSR引物：用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物， 所述296對SSR引物含54對自行合成引物。
[0017] (5) PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系為：總體積為1 OyL，0.5yL 15mM的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補(bǔ)水至 10yL; PCR擴(kuò) 增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后 得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 °C保存lh。
[0018] (6)染色：向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入10%的聚丙烯酰胺 PAGE的點(diǎn)樣孔，恒壓180V電泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作 用下染色。
[0019] (7)檢測：根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參 數(shù)，進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析；檢測稻粒黑粉病的抗性數(shù)量性狀基因座 QTL，L0D值的閾值定為2.5~3.0，按P = 0.005的概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上 的位置。
[0020]本發(fā)明涉及的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，以稻粒黑粉病抗源中優(yōu)781為母本， 稻粒黑粉病高感品種揚(yáng)稻6號為父本，選育稻粒黑粉病抗性品種雜交種F1。通過對雜交種F1 通過花藥愈傷誘導(dǎo)培育的新品種進(jìn)行分子標(biāo)記得到抗稻粒黑粉病基因位點(diǎn)qRBSDV16,位于 第1號染色體分子標(biāo)記RM6092與RM5501之間。本發(fā)明涉及的稻粒黑粉病抗性染色體的分子 標(biāo)記方法，可以通過檢測某一品種第1號染色體上下游兩個(gè)引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，評估其對 稻粒黑粉病的抗性，大大提高抗稻粒黑粉病水稻的選擇效率。
[0021]本發(fā)明通過分子標(biāo)記的方法對稻粒黑粉病的抗性進(jìn)行評估，避免使用化學(xué)藥劑增 加水稻生產(chǎn)的成本且避免對環(huán)境造成污染和破壞，無需多世代重復(fù)雜交回交，縮短了育種 周期。
【附圖說明】
[0022]圖1為1號染色體上抗稻粒黑粉病基因位點(diǎn)qRBSDV16在染色體上的位置。
[0023] 圖2為1號染色體上抗稻粒黑粉病基因位點(diǎn)評估水稻品種對稻粒黑粉病的抗性的 電泳圖譜。M: Mark; 1:中優(yōu)781; 2:揚(yáng)稻6號;3: F1; 4-11 :抗病單株;12-20:感病單株。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行具體說明。應(yīng)該理解，下面 的實(shí)施例只是作為具體說明，而不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明 所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] (1)雜交種F1的獲得:正季收集來源于12個(gè)省份共189份水稻品種進(jìn)行抗稻粒黑粉 病田間誘發(fā)鑒定，結(jié)果表明，不同省區(qū)水稻品種對稻粒黑粉病的抗性存在明顯差異，品種中 優(yōu)781稻粒黑粉病抗性較好，大田發(fā)病率僅有5 %，屬于高抗水平。以稻粒黑粉病抗源中優(yōu) 781為母本，稻粒黑粉病高感品種揚(yáng)稻6號為父本，二者正季播種，于實(shí)驗(yàn)秧田，單株移栽，株 行距為30 X 30cm; -般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚(yáng)花期，將中優(yōu)781植 株的稻穗浸入39~46°C的溫水中，浸泡6~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及 未開穎的小花，用紙袋將中優(yōu)781植株的稻穗套好并作標(biāo)記，待用。當(dāng)揚(yáng)稻6號植株進(jìn)入開花 期時(shí)，將揚(yáng)稻6號植株上稻穗的花藥均勻落到紙袋中中優(yōu)781植株稻穗的柱頭上，人工授粉 完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交稻穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1。
[0027] (2)雜交種F1的花藥愈傷誘導(dǎo)：
[0028]雜交種F1正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/2為標(biāo)準(zhǔn)取穗，取穗后用70%乙 醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個(gè)稻穗，保持稻穗濕潤放入冰箱中，在4°C下低溫預(yù)處 理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒處理2~10分鐘，晾干后用剪開 花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在22~28°C下暗培養(yǎng)2~3天后，轉(zhuǎn)移 至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下進(jìn)行繼代培養(yǎng)，50天后將獲 得的雜交種F1的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟， 通過篩選即獲得稻粒黑粉病抗性品種。
[0029] 所述第一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，煙酸0.5mg/ L，瓊脂7.5g/L;激動素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/L，秋水仙堿 0 · 3mg/L; pH 值為6 · 0。
[0030]所述第二培養(yǎng)基的成分為:MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/ L，維生素 B1 0.4mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素 O.lmg/ L，甲基亞硝基脲0.8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1. Og/L;以及濃度20 %的稻粒黑粉病 菌粗毒素提取液，pH值為6.0。
[0031]所述稻粒黑粉病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染稻粒黑粉病水稻的穗頸部 剪下，清潔表面后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產(chǎn)生后加入營養(yǎng)瓊脂繼 續(xù)培養(yǎng)，得到菌株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分 鐘、過濾、以500~1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細(xì)菌性基腐病菌粗 毒素。
[0032] (3)預(yù)處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細(xì)粉，加入體積百分比2%的β-巰基 乙醇，震蕩，加入50mM的三(羥甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質(zhì)量體 積百分比為2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質(zhì)量體積百分比為5%的十六烷基三甲基溴化銨 CTAB，混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將 混合物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄 上清液得到DNA沉淀物。
[0033] 所述水稻葉片與β-巰基乙醇、 為1:3:3:5:10。
[0034] 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm。
[0035] (4)SSR引物：用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物， 所述296對SSR引物含54對自行合成引物。
[0036] (5)PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系為：總體積為10yL，0.5yL15mM的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補(bǔ)水至 10yL; PCR擴(kuò) 增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后 得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 °C保存lh。
[0037] (6)檢測:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺PAGE經(jīng)硝酸銀染色后，再用NaOH顯色。
[0038]向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入PAGE的點(diǎn)樣孔，恒壓180V電 泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作用下染色。
[0039] (7)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用 Mapmaker/Exp3.0軟件進(jìn)行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將 交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM)。
[0040] (8)采用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測稻粒黑 粉病的抗性QTL，L0D值的閾值定為2.7，按P = 0.005概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色 體上的位置。在1號染色體上檢測到1個(gè)稻粒黑粉病抗性QTL，L0D值為3.88,貢獻(xiàn)率為 17.9%，命名為qRBSDV16，位于第l號染色體分子標(biāo)記RM6092:SEQIDN0.1/SEQIDN0.2與 分子標(biāo)記RM5501:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4之間（如圖1)。
[0041 ] (9)用第1號染色體分子標(biāo)記RM6092引物：SEQ ID N0.1/SEQ ID勵(lì).2，或者用第1 號染色體分子標(biāo)記RM3133:SEQIDN0.3/SEQIDN0.4擴(kuò)增稻粒黑粉病鑒定材料。如果用分 子標(biāo)記RM6092引物：SEQ ID N0.1/SEQ ID勵(lì).2能夠擴(kuò)增出14仙？的擴(kuò)增片段，或用分子標(biāo) 記RM5501:SEQ ID N0.3/SEQ ID勵(lì).4能夠擴(kuò)增出135匕？的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi) 存在抗稻粒黑粉病位點(diǎn)qRBSDV16(如圖2)，通過檢測第1號染色體上該兩個(gè)引物標(biāo)記的帶型 數(shù)據(jù)，評估該植株對稻粒黑粉病的抗性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:其步驟如下： (1) 雜交種Fl的獲得：以稻粒黑粉病抗源中優(yōu)781為母本，稻粒黑粉病高感品種揚(yáng)稻6號 為父本，二者正季播種，于實(shí)驗(yàn)秧田，單株移栽，株行距為30 X 30cm; -般大田肥水和病蟲草 害管理，至植株正常生長到揚(yáng)花期，將中優(yōu)781植株的稻穗浸入39~46°C的溫水中，浸泡6~ 10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將中優(yōu)781植株的稻 穗套好并作標(biāo)記，待用；當(dāng)揚(yáng)稻6號植株進(jìn)入開花期時(shí)，將揚(yáng)稻6號植株上稻穗的花藥均勻落 到紙袋中中優(yōu)781植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交稻穗的籽 粒成熟，即獲得雜交種Fl; (2) 雜交種Fl的花藥愈傷誘導(dǎo)：雜交種Fl正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/2為 標(biāo)準(zhǔn)取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個(gè)稻穗，保持稻穗濕潤放入 冰箱中，在4°C下低溫預(yù)處理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒處理2 ~10分鐘，晾干后用剪開花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在22~28°C 下暗培養(yǎng)2~3天后，轉(zhuǎn)移至第二培養(yǎng)基中，于25~29 °C、光周期16h7500Ix光照8h黑暗下進(jìn) 行繼代培養(yǎng)，50天后將獲得的雜交種Fl的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移植到 大田，等待稻穗籽粒成熟，通過篩選即獲得稻粒黑粉病抗性品種； (3) 預(yù)處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細(xì)粉，加入體積百分比2%的β-巰基乙醇， 震蕩，加入50mM的三(羥甲基)氨基甲烷Tr i s-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質(zhì)量體積百分 比為2 %的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質(zhì)量體積百分比為5 %的十六烷基三甲基溴化銨CTAB， 混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將混合 物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄上清 液得到DNA沉淀物； 所述水稻葉片與巰基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的質(zhì)量體積比mgAiLAiLAiLAiL為1:1 ~5:1~5:3~8:8~12; 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm; (4) SSR引物：用實(shí)驗(yàn)室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物，所述 296對SSR引物含54對自行合成引物； (5) PCR反應(yīng):PCR反應(yīng)體系為：總體積為IOyL，0.5yL15mM的脫氧核糖核苷三磷酸dNTP， 1 · 2yL10 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補(bǔ)水至IOyL; PCR擴(kuò)增程 序?yàn)?94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后得到 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存Ih; (6) 染色：向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入10%的聚丙烯酰胺PAGE 的點(diǎn)樣孔，恒壓180V電泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作用下 染色； (7) 檢測：根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，進(jìn) 行基因和分子標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳連鎖分析;檢測稻粒黑粉病的抗性數(shù)量性狀基因座QTL，LOD 值的閾值定為2.5~3.0，按P = 0.00 5的概率值檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述第 一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2. Omg/L，煙酸0.5mg/L，瓊脂7.5g/L;激 動素 KT2 · Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/ L，秋水仙堿O · 3mg/L; pH值為6 · O。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述第 二培養(yǎng)基的成分為：MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2 . Omg/L，維生素 BlO · 4mg/L，維生素 B60 · 5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAAO · 5mg/L，生物素0 · lmg/L，甲基亞硝基 脲0.8mg/L，調(diào)環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1.0 g/L;以及濃度20 %的稻粒黑粉病菌粗毒素提取 液，pH值為6.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述稻 粒黑粉病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染稻粒黑粉病水稻的穗頸部剪下，清潔表面 后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產(chǎn)生后加入營養(yǎng)瓊脂繼續(xù)培養(yǎng)，得到菌 株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分鐘、過濾、以500~ 1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細(xì)菌性基腐病菌粗毒素。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述水 稻葉片與β-巰基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的質(zhì)量體積比mgAiLAiLAiLAiL為1:3:3:5:10; 所述兩次離心分散的速率為900rpm。
【文檔編號】A01H4/00GK105950763SQ201610495877
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】許建中, 孟劍華, 安劍石
【申請人】無錫南理工科技發(fā)展有限公司