專利名稱：鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修復(fù)植物伴礦景天的莖段、莖尖或葉片離體培養(yǎng)高頻率植株再生技 術(shù)，屬于植物組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)代化，土壤_植物_環(huán)境系統(tǒng)中重金屬污染問題 日趨嚴(yán)重。重金屬污染不僅降低農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致土壤功能和質(zhì)量的退化，影響農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)的健康持續(xù)發(fā)展，而且通過徑流和淋洗作用污染地表水和地下水，惡化水文環(huán)境，并可 能通過直接接觸、食物鏈等途徑危及人類的生命和健康。目前我國的農(nóng)田土壤受重金屬污 染的治理應(yīng)該受到重視。采用的物理化學(xué)修復(fù)技術(shù)(包括隔離包埋技術(shù)，固化穩(wěn)定技術(shù)，化學(xué)穩(wěn)定技術(shù)和 電動修復(fù)技術(shù)等)治理重金屬土壤污染，從根本上來說并沒有達到清除污染的目的，只是 將重金屬轉(zhuǎn)移或固定在土壤中，減少重金屬進入植物生態(tài)系統(tǒng)的量。而且，應(yīng)用這些物理化 學(xué)方法的往往耗資巨大，而且所用到的化學(xué)藥劑還可能造成土壤的二次污染。而植物修復(fù) 是利用重金屬超積累或耐性植物治理土壤污染的一種新的環(huán)境生物技術(shù)，它是一種費用低 廉、無繼發(fā)污染，節(jié)約土地資源、環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展的綠色途徑。植物修復(fù)的關(guān)鍵在于 尋找或培育出能夠忍耐和超積累一種或多種重金屬、生物量較大、適應(yīng)性較廣而且繁殖快 速的特異種質(zhì)資源。修復(fù)植物伴礦景天(Sedum plumbizincicola X. H. Guo et S. B. Zhou sp. nov.)，是我國剛發(fā)現(xiàn)的一種重金屬耐性和超富集植物，喜生于富含Pb、Zn礦地區(qū)，多年 生肉質(zhì)草本。其生長習(xí)性與其它景天的生長習(xí)性基本相似，自然分布于浙江等地，在我國大 部分地區(qū)均可正常生長，適應(yīng)性廣，生物量大，生長速度快。適用于污染環(huán)境植物修復(fù)技術(shù)， 但是其重金屬耐性和超富集的分子生物機理尚未研究，分子生物學(xué)技術(shù)的日趨成熟為研究 其重金屬耐性和超富集的分子機理開辟新的途徑，本方法用于其微繁殖和體細胞突變體篩 選及分子生物學(xué)研究。至今，組織培養(yǎng)技術(shù)在伴礦景天上尚未見報道，因此發(fā)明該修復(fù)植物 伴礦景天的組織培養(yǎng)方法，對研究伴礦景天重金屬耐性和超富集的分子機理具有重要的意 義，同時對促進污染環(huán)境植物修復(fù)技術(shù)推廣應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種修復(fù)植物伴礦景天組織培養(yǎng)的高頻率植株再 生技術(shù)，為闡述伴礦景天重金屬耐性和超富集的分子生物機理開辟新的途徑。本發(fā)明的修 復(fù)植物伴礦景天組織培養(yǎng)技術(shù)，有莖尖組織培養(yǎng)、葉片愈傷組織誘導(dǎo)、莖段愈傷組織誘導(dǎo)等 三種方案。技術(shù)方案本發(fā)明技術(shù)方案為鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法， 采用莖尖組織誘導(dǎo)分化法，將伴礦景天消毒后取帶有腋芽的0. 3 0. 5cm莖段或莖尖，接種 到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每天保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 40天 后，取出長有簇生芽的莖尖，選取大芽，轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上，每天保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 8周，得到含有許多2 3cm長幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，澆灌蒸餾水放置2 3天后，用水洗去培養(yǎng)基，移栽至pH 6. O 8.0的全營養(yǎng)素有機質(zhì)基質(zhì)中，2 4周得到組培苗。上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有(0. 05 0. 15) mg/L 6-BA和(1. 5 2. 5)mg/L NAA的MS培養(yǎng)基。上述壯苗培養(yǎng)基是V2MS培養(yǎng)基，其中 含有濃度為(0. 1 0. 5)mg/L6-BA、(1. 5 2. 0)mg/L NAA、5ymol/L Cd (NO3)2 禾口(0. 1 1.5) mg/L IBA。鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，采用莖段愈傷組織誘導(dǎo)法，將伴 礦景天莖消毒，切去葉和側(cè)芽與頂芽，切成0. 3 0. 5cm的小段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，無光 照的培養(yǎng)箱中3 6周誘導(dǎo)愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，每天保持光強 為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 50天，得到3 5cm高并帶有Icm以 上幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，澆灌蒸餾水放置2 3天后，用水洗去 培養(yǎng)基，移栽至PH 6.0 8.0的全營養(yǎng)素有機質(zhì)基質(zhì)，2 4周得到組培苗。上述誘導(dǎo)培養(yǎng) 基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0.5) mg/L 6-BA和(1.5 2.0) mg/L 2，4_D。上述 分化培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0. 5) mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2， 4-D。鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，采用葉片愈傷組織誘導(dǎo)法，將伴 礦景天葉片消毒，切去葉緣、葉脈和葉柄，切成0. 2 0. 3cm2的小片，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 無光照的培養(yǎng)箱中4 8周誘導(dǎo)愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，每天保持 光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 70天，得到3 5cm高并帶有Icm 以上幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，澆灌蒸餾水放置2 3天后，用水洗 去培養(yǎng)基，移栽至PH 6.0 8.0的全營養(yǎng)素有機質(zhì)基質(zhì)，2 4周得到組培苗。上述誘導(dǎo)培 養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(2. 5 3. 5) mg/L NAA和(0. 5 1. 0)mg/L TDZ。上述 分化培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0. 5) mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2， 4-D。上述培養(yǎng)基均為已滅菌的培養(yǎng)基，在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整PH值至 5. 5 5. 8 ；在離體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度為25士 1°C。有益效果本發(fā)明分別取修復(fù)植物伴礦景天的莖段、莖尖、葉片進行組織培養(yǎng)擴 繁，同時分別建立了莖段、莖尖、葉片高頻再生體系。由于繁殖時直接選取伴礦景天的莖段、 莖尖、葉片，取材容易，拓寬了伴礦景天繁殖的取材范圍，繁殖方法快速，高效，為生理生化、 分子生物學(xué)研究提供了條件。本發(fā)明目的是通過分別建立莖尖、莖段或葉片的高頻植株再 生體系的方法，適宜用作體細胞突變體的篩選和微繁殖以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化材 料，為闡述其重金屬耐性和超富集的分子生物機理提供基礎(chǔ)條件。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于對本發(fā)明進行 說明，并不構(gòu)成對權(quán)利要求范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的其他替代手段，均在本 發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。說明書中1/2MS培養(yǎng)基的含義是MS培養(yǎng)基中的所有成分減半。本發(fā)明所說的MS培養(yǎng)基組成見表1
表IMS培養(yǎng)基組成成分 實施例1
將取自鋅鎘礦上修復(fù)植物伴礦景天帶腋芽的莖段或莖尖用自來水沖洗干凈，用 70%vt乙醇浸泡50秒，再用0. 1% (g/mL)升汞浸泡10分鐘，倒掉升汞后用無菌水清洗5次 后，得到無菌苗后在超凈工作臺上取帶有腋芽的0. 3 0. 5cm莖段或莖尖，接種到已高壓滅 菌并冷卻后的200mL玻璃培養(yǎng)瓶裝的50mL pH為5. 8誘導(dǎo)培養(yǎng)基，100瓶的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成 份為MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 05 0. 15)mg/L 6-BA和(1. 5 2. 5)mg/L NM)每瓶接 種3個莖段或莖尖，將培養(yǎng)瓶放至溫度為25 士 1°C，每天保持光強為3000勒克司(Lux)的光 照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天后，取出長有簇生芽的莖尖，選取大芽，轉(zhuǎn)接到已滅菌的玻璃 培養(yǎng)瓶裝的50mL的壯苗培養(yǎng)基上，壯苗培養(yǎng)基是pH為5. 8的1/2MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為 0. 1 0. 5)mg/L 6-BA、(1. 5 2. 0)mg/L ΝΜ、5 μ mol/L Cd (NO3)2 禾口(0· 1 1. 5)mg/L IBA, 再將培養(yǎng)瓶放入溫度為25士 1°C，每天保持光強為3000勒克司(Lux)的光照16小時的培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)5 8周，得到含有許多2 3cm長幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶 口，加入少許蒸餾水放置2 3天后，用水洗凈根部培養(yǎng)基，分別移栽至全營養(yǎng)素的有機質(zhì)基 質(zhì)(安徽省無為縣花卉肥料廠生產(chǎn))，2 4周后得到粗壯的地上部約5cm組培苗。實施例2:將取自鋅鎘礦上修復(fù)植物伴礦景天莖段用自來水沖洗干凈，用70% Vt乙醇浸泡 50秒，再用0. 1% (g/mL)升汞浸泡10分鐘，倒掉升汞后用無菌水清洗5次后，得到無菌苗 后在超凈工作臺上將莖段切去葉片和側(cè)芽后，切成0. 3 0. 5cm的小段，接種到已高壓滅菌 并冷卻后的200mL玻璃培養(yǎng)瓶裝的50mL pH為5. 5 5. 8誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份 為MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(1.5 2.0)mg/L 2，4_D，將培養(yǎng) 瓶放入溫度為25士 1°C，無光照的培養(yǎng)箱中3 6周后得到愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至已 滅菌的玻璃培養(yǎng)瓶裝的50mLpH為5. 8分化培養(yǎng)基中，其中50瓶分化培養(yǎng)基的成份是MS培 養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0. 5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5)mg/L 2，4_D，再將培養(yǎng)瓶放 入溫度為25士 1°C，每天保持光強為3000勒克司(Lux)的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 天，得到3cm高帶有Icm以上幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，加入少許蒸 餾水放置2天后，用水洗去培養(yǎng)基后分別移栽至全營養(yǎng)素的有機質(zhì)基質(zhì)(安徽省無為縣花 卉肥料廠生產(chǎn))，4周后得到粗壯的地上部約5cm組培苗。實施例3:將取自鋅鎘礦上修復(fù)植物伴礦景天葉片用自來水沖洗干凈，用70 % Vt乙醇浸泡 50秒，再用0.1% (g/mL)升汞浸泡10分鐘，倒掉升汞后用無菌水清洗5次后，得到無菌苗 后在超凈工作臺上將葉片，切去葉緣后，切成0. 3 0. 5cm2的小片，接種到已高壓滅菌并冷 卻后的200mL玻璃培養(yǎng)瓶裝的50mL pH為5. 5 5. 8誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基成份為MS 培養(yǎng)基，其中含有濃度為(2. 5 3. 5)mg/L NAA和(0. 5 1. 0)mg/L TDZ，將培養(yǎng)瓶放入溫 度為25士 1°C，無光照的培養(yǎng)箱中4 8周后得到愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至已滅菌的玻 璃培養(yǎng)瓶裝的50mLpH為5. 8分化培養(yǎng)基中，其中50瓶分化培養(yǎng)基的成份是MS培養(yǎng)基，其 中含有濃度為(0. 1 0. 5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5)mg/L 2，4-D，再將培養(yǎng)瓶放入溫度為 25士 1°C，每天保持光強為3000勒克司(Lux)的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 70天， 得到3cm高帶有Icm以上幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，加入少許蒸餾 水放置2天后，用水洗去培養(yǎng)基后分別移栽至全營養(yǎng)素的有機質(zhì)基質(zhì)(安徽省無為縣花卉 肥料廠生產(chǎn))，4周后得到粗壯的地上部約5cm組培苗。
權(quán)利要求
鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征是采用莖尖組織誘導(dǎo)分化法將伴礦景天消毒后取帶有腋芽的0.3～0.5cm莖段或莖尖，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每天保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～40天后，取出長有簇生芽的莖尖，選取大芽，轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基上，每天保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～8周，得到含有許多2～3cm長幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，澆灌蒸餾水放置2～3天后，用水洗去培養(yǎng)基，移栽至pH 6.0～8.0的全營養(yǎng)素有機質(zhì)基質(zhì)中，2～4周得到組培苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于 所說的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有(0. 05 0. 15)mg/L 6-BA和(1. 5 2. 5)mg/LNAA的MS培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于 所說的壯苗培養(yǎng)基是1/2MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0. 5)mg/L6-BA、(1. 5 2. 0) mg/L NAA、5ymol/L Cd(NO3)2 禾口(0. 1 1. 5)mg/L IBA。
4.鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征是采用莖段愈傷組織誘導(dǎo) 法將伴礦景天莖消毒，切去葉和側(cè)芽與頂芽，切成0. 3 0. 5cm的小段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上，無光照的培養(yǎng)箱中3 6周誘導(dǎo)愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，每天 保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 50天，得到3 5cm高并帶 有Icm以上幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，澆灌蒸餾水放置2 3天后， 用水洗去培養(yǎng)基，移栽至pH 6. 0 8. 0的全營養(yǎng)素有機質(zhì)基質(zhì)，2 4周得到組培苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于 所說的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(1. 5 2. 0) mg/L 2，4-D。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于 所說的分化培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2，4-D。
7.鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征是采用葉片愈傷組織誘導(dǎo) 法將伴礦景天葉片消毒，切去葉緣、葉脈和葉柄，切成0. 2 0. 3cm2的小片，接種到誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上，無光照的培養(yǎng)箱中4 8周誘導(dǎo)愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中， 每天保持光強為3000勒克司的光照16小時的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50 70天，得到3 5cm高并 帶有Icm以上幼根的組培苗，然后將培養(yǎng)瓶移到室外，打開瓶口，澆灌蒸餾水放置2 3天 后，用水洗去培養(yǎng)基，移栽至pH 6. 0 8. 0的全營養(yǎng)素有機質(zhì)基質(zhì)，2 4周得到組培苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于 所說的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(2.5 3. 5) mg/L NAA和(0.5 1.0)mg/ L TDZ。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鋅鎘超積累植物伴礦景天的組織培養(yǎng)育苗方法，其特征在于 所說的分化培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有濃度為(0. 1 0.5)mg/L 6-BA和(0. 1 0. 5) mg/L 2，4-D。
10.上述任一權(quán)利要求中的培養(yǎng)基均為已滅菌的培養(yǎng)基，在高壓滅菌前用氫氧化鈉和 鹽酸調(diào)整PH值至5. 5 5. 8 ；在離體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度為25 士 1°C。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種修復(fù)植物伴礦景天組織培養(yǎng)的高頻率植株再生技術(shù)，分別取修復(fù)植物伴礦景天的莖段、莖尖、葉片進行組織培養(yǎng)擴繁，同時分別建立了莖段、莖尖、葉片高頻再生體系。由于繁殖時直接選取伴礦景天的莖段、莖尖、葉片，取材容易，拓寬了伴礦景天繁殖的取材范圍，繁殖方法快速，高效，為生理生化、分子生物學(xué)研究提供了條件。本發(fā)明目的是通過分別建立莖尖、莖段或葉片的高頻植株再生體系的方法，適宜用作體細胞突變體的篩選和微繁殖以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化材料，為闡述其重金屬耐性和超富集的分子生物機理提供基礎(chǔ)條件。
文檔編號A01H4/00GK101869077SQ201010228740
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者吳龍華, 王松鳳, 譚維娜, 賁愛玲, 駱永明 申請人:中國科學(xué)院南京土壤研究所