專利名稱：一種提高植物耐旱性的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于提高植物抗性領域，具體涉及一種提高植物耐旱性的方法。
背景技術：
生物體內大多數(shù)蛋白質都以糖蛋白形式存在，它們包括酶、免疫球蛋白、載體蛋白、激素、毒素、凝集素和結構蛋白，功能涉及細胞識別、信息傳遞、激素調節(jié)、受精、發(fā)生、發(fā)育、分化、神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)恒態(tài)維持等各個方面。而且，病菌、病毒的侵染，癌細胞的增殖及轉移，自身免疫疾病等都與細胞表面的糖密切相關。糖基轉移酶(Glycosyltransferases，GTs)是催化糖基與特異受體分子結合，形成糖苷鍵的酶。GTs廣泛存在于生物體中，在植物中扮演重要角色，負責將活性供體的單糖部分轉移至糖、蛋白質、脂類、核酸以及另外一些小分子，完成糖基化反應，以調控植物中從組織結構分子、儲藏分子到特異信號分子的作用功能。尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶(UGTs)是一類C末端有42個一致氨基酸序列的糖基轉移酶。而在植物中，Joe Ross等運用I~0pPred2，SignalP和Psort等預測軟件對擬南芥 UGTs的分析表明，擬南芥UGTs沒有前導系列和停靠序列，這一現(xiàn)象支持植物UGTs是細胞質定位的觀點，這也是普遍接受的觀點。水資源短缺是目前制約農業(yè)發(fā)展的一個全球性問題。據(jù)統(tǒng)計，全球約43%的耕地受到干旱、半干旱的威脅。干旱脅迫不僅嚴重影響作物生長發(fā)育、降低作物的產量，同時還限制優(yōu)良作物品種的推廣。因此，提高作物的抗旱能力是現(xiàn)代農業(yè)研究工作中的熱點問題之一。植物抗旱方面的研究涉及植物的形態(tài)、生理生化及分子生物學等諸多領域。植物在干旱條件下根系及葉片結構的變化，脫落酸(ABA)和氣孔關閉的關系，滲透調節(jié)物質甘露醇、脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、果聚糖、肌醇、多胺等小分子化合物與植物抗旱的關系，水孔蛋白、活性氧清除及胚胎發(fā)育晚期豐度蛋白對植物抗旱性的影響等抗旱方面的研究一直受到人們的關注。隨著分子生物學研究的發(fā)展，人們相繼發(fā)現(xiàn)并克隆出了一些重要的耐旱基因，獲得了煙草、水稻等抗旱轉基因植株。并已在水稻上成功的進行了轉抗旱基因水稻品系的培育，這為其他植物的轉抗旱基因的研究帶來了廣闊的應用前景。目前，抗旱基因工程中也存在著一些問題。抗旱性是數(shù)量性狀，由多基因控制，單基因轉化能夠提高植物的抗旱性，但具體到哪種植物適合哪種基因還有待于進一步研究。目前利用基因工程技術培育抗旱品種主要有兩種策略增加植物滲透性代謝產物的合成能力，使植物在水分脅迫下能合成更多的滲透調節(jié)物質(如甘露醇、甜菜堿、海藻糖等)，以提高植物的滲透調節(jié)能力，從而增強植物的抗旱性；增強植物對活性氧自由基的清除能力，使植物在水分脅迫下過度表達一些酶(如S0D，P0D，CAT等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，從而提高細胞耐脫水的能力。由于滲透調節(jié)是植物主要的耐旱機制，近年來人們已利用植物基因工程手段來增加目標植物中脯氨酸和甜菜堿的合成，在以滲透調節(jié)為主的耐旱性轉基因植物培育方面取得了可喜的進展。隨著分子生物技術的迅速發(fā)展和基因克隆技術的不斷完善，植物基因工程研究正向縱深發(fā)展，抗性基因研究已由抗生物逆性(如抗病、抗蟲)向抗非生物逆性(如抗寒、抗旱、抗鹽等)轉移。使用基因工程技術以期提高植物的抗旱性，培育出抗旱品系也是一個可行之道。但是目提高植物抗旱性的備選基因還較少，且都著重于通過提高表達能夠增加抗旱性的基因，本領域需要有提高植物抗旱性的新方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種能提高植物抗旱性的新的有效方法。解決該技術問題的技術方案是提供一種提高植物抗旱性的方法，該方法為通過抑制尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶(UGT)基因在植物體內的表達，從而提高其耐旱性。其中，上述方法中的抑制UGT基因在植物體內的表達，是用基因反向插入、基因敲除、RNA干擾中的任一種手段進行。進一步的，上述方法包括以下步驟其特征在于包括以下步驟a、構建UGT基因反向插入的表達質粒；b、將構建的UGT基因反向插入的表達質粒轉入植物中獲得轉基因基因陽性植株，其UGT基因的表達被抑制，抗旱性得到提高。其中，上述方法中所述的UGT基因為，其序列為SEQ ID NO. 1所示。其中，上述方法中所述的表達質粒為pCAMBIA2301。本發(fā)明方法具體可通過以下方式實現(xiàn)a、獲得SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。b、利用pMDIS-T載體克隆UGT71C5基因片段，得到含有反向插入片段的載體。再構建UGT反向插入以抑制其表達的載體pCAMBIA2301-UGT。C、將抑制表達載體pCAMBIA2301-UGT轉化農桿菌，將轉化成功的農桿菌轉入植物得到轉基因陽性種子或植株，所得的轉基因陽性種子或植株建立的株系具有較高的抗旱性。其中上述方法中所述的植物為十字花科植物。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明方法通過建立了抑制尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶表達的植物株系，所得株系的耐旱性比野生型有明顯提高，能夠有效提高植物的抗旱性能， 為本領域提高植物抗旱性能提供了新的思路，是一種能提高植物抗旱性的新的有效方法， 具有很好的應用前景。


圖1擬南芥UGT71C5基因PCR擴增電泳圖。圖2正向插入和反向插入的載體的構建示意圖。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
對本發(fā)明進行具體說明?？寺≥d體pMDIS-T —種能高效克隆由具有3’端加腺嘌呤核苷酸A的Taq聚合酶擴增的PCR產物(TACloning)的專用載體，從Takara公司購買。其他所用的載體、生化試劑，酶制劑，試劑盒均購于Takara公司。實施例一、UGT71C5基因全長的克隆和載體構建1、引物設計利用NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到UGT71C5基因全長，設計引物，并在上游引物中加入BmaH I酶切位點，下游引物中加入Sma I酶切位點。上游引物(SEQID NO. 3)5' -CGCGGATCCTAGATGAAGACAGCAGAGCTCATATTCG-3'；下游引物(SEQID NO. 4)5' -TCCCCCGGGATTATCTTGCTCTGAAAGTGAAATGGTC-3'。2、從擬南芥cDNA中擴增SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列PCR 反應體系(50 μ 1)Template (cDNA)5. 0 μ 125mM MgC124. 0 μ 1IOXTaq Buffer5. 0 μ 12. 5mM dNTP5. 0 μ 120mM 上游引物(SEQID NO. 3)5. 0 μ 120mM 下游引物(SEQID NO. 4)5. 0 μ 1ddH2026. 5 μ 1Taq 酶(5υ/μ1)0. 50 μ 1PCR 反應參數(shù):95. 0°C預變性 3min ；95. 0°C 30s ；52. 0°C 30s ；72. 0°C 40s ；重復 30 個循環(huán)；72°C延伸5min。電泳檢測如圖1，由電泳圖可看出，加入cDNA模板時，在分子量1400bp左右有明顯的DNA擴增條帶，條帶大小與預期大小相符，初步確定擴增條帶為目的基因片段擬南芥 UGT71C5 基因。對PCR產物純化(見Qiagen公司公開的PCR產物純化資料)，經測序驗證，得到 SEQ IDN0. 1所示核苷酸序列，與預期一致。3、利用pMD18-T載體克隆UGT71C5基因片段連接體系(10 μ 1)，按照Takara pMD18_T載體試劑盒說明書建立，16°C連接過夜。反應成分反應體積回收 PCR 片段5. 8μ 1pMD18-T 載體0. 2 μ 1Soulution I (溶液 I)4 μ 1將10 μ 1連接產物轉入200 μ 1大腸桿菌(DH5 α )感受態(tài)細胞中，后將轉化后的菌液涂布于LB+Amp平板，37°C過夜培養(yǎng)。從平板上挑取白色菌落，接種到200 μ 1 LB+Amp液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)。用菌落 PCR法檢測轉化子(菌落PCR所使用的上游引物為pMDlS-T上游測序引物，配套的下游引物分別是UGT基因的上游引物)，這樣可通過菌落PCR結果判斷該片段插入的方向。將通過菌落PCR法確認的含有正向插入片段和反向插入片段的兩種大腸桿菌菌落分別接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基中，370C，225rpm振蕩培養(yǎng)過夜。加入甘油保存菌液(85%菌液，15%純甘油)，送^witrogen公司測序。測序后經分析，克隆到的有正向插入和反向插入的UGT基因均正確無誤，進行下一步實驗。4、利用pCAMBIA2301載體克隆UGT片段載體構建策略如圖2，包括UGT正向插入使其過量表達和UGT反向插入以抑制其表達的載體。首先，分別酶切上一步構建的pMD18-T-UGT正向插入質粒、pMD18_T_UGT反向插入質粒和pCAMBIA2301質粒。(1)選擇PMD18-T-UGT正向或反向插入質粒，單酶切，30°C水浴6h，用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應成分IOXTango BufferSmal I
反應體積 10 μ 1 2. 5μ 1T-UGT正向/反向質粒(40ng/ μ1) 50 μ 1
(MH2O37. 5μ 1
(2)pCAMBIA2301 質粒酶切，SmaI30°C酶切過夜，再加入Ecll36II 37°C酶切4h。為防止載體自連，再加入小牛腸堿性磷酩〖酶(CIAP)2y 1對質粒末端去磷酸化，37 °C保溫30mino用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
反應成分反應體積
10 X Tango Buffer10 μ 1
Small2. 5μ 1
Ecll36II2. 5μ 1
PCAMBIA2301 質粒(40ng/ μ 1)50 μ 1
(MH2O35 μ 1
其次，將產物回收，進行連接，16°C連接4個小時以上。連接體系(20μ1)如下
反應成分反應體積
10 X Ligase Buffer2μ 1
T4Ligase1 μ 1
UGT片段10 μ 1
載體片段4μ 1
(MH2O3 μ 1
將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，利用菌落PCR檢測插入方向，菌落
PCR上游引物為pCAMBIA2301質粒的35S上游引物，配套的下游引物分別是克隆UGT片段所使用的上下游引物(UGT下游引物檢測正向過量表達質粒；上游引物檢測反向抑制表達質粒)，這樣可通過菌落PCR結果判斷該片段插入的方向。將上述方法確認含有正向或反向插入片段的大腸桿菌菌落接種于LB+Amp液體培養(yǎng)基中，37°C，225rpm振蕩培養(yǎng)過夜。加入甘油保存菌液(85%菌液，15%純甘油)。實施例二、將UGT71C5基因轉入擬南芥1、農桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)(1)挑取農桿菌EHA105單菌落接種到含有25 μ g/ml鏈霉素(Mr)的LB培養(yǎng)基，在條件下過夜培養(yǎng)搖活； (2)取2ml過夜培養(yǎng)物加入到50ml的LB+Str的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖活培養(yǎng)，直到 0D600 達 0. 5 ；(3)冰上放置培養(yǎng)液lOmin，使培養(yǎng)物冷卻至0°C ；(4) 40C，8OOOrpm,離心 IOmin 收集菌體；(5)用Iml冰冷的IOmM CaCl2溶液懸浮農桿菌。以100 μ 1分裝到1. 5ml的EP管中，液氮速凍后放入-80 V保存。2、轉化農桿菌(1)取出農桿菌感受態(tài)于冰上融化；(2)力Π入2 μ 1重組質粒，液氮凍5min，然后37°C水浴5min ；C3)加入Iml LB培養(yǎng)基培養(yǎng)池，低速離心收集菌體，將其涂在LB+Str (25 μ g/ ml)+Kan(50yg/ml)平板上，28°C過夜培養(yǎng)。3、重組質粒的鑒定隨機挑取重組平板上單菌落接種于LB+Str+Kan液體培養(yǎng)基中，于搖床培養(yǎng)過夜。用菌液作模板進行PCR擴增鑒定重組質粒，引物為35S啟動子上的引物序列，配套克隆UGT片段所使用的上下游引物之一使用(參照實施例一)。4、花序浸染法轉化擬南芥條件下大量培養(yǎng)含重組質粒的農桿菌，4°C下6000rpm離心5min收集菌體，用5%的蔗糖溶液重懸農桿菌使OD = 0. 8，為了保持蔗糖溶液的新鮮，可以現(xiàn)配現(xiàn)用，無需滅菌。(2)在浸染之前加入表面活性劑Silwet-77至濃度0. 05% (500 μ 1/L)，如果產生表面活性劑的毒性現(xiàn)象(浸過部分發(fā)黃或死亡)，將濃度降至0. 02% ；(3)將植株的表面部分浸泡在農桿菌懸浮液中90s，同時輕輕旋轉；(4)套袋16 24h保持高度的濕潤狀態(tài)(注意不可暴露在陽光之中)；(5)隔天澆水，保證水分充足即可；(6)角果自然開裂后可以收種子(Ttl代種子)。5、轉基因種子篩選將得到的擬南芥種子放置4°C過夜后，接種于MS+Kanr (50 μ g/ml)平板上，進行轉基因植株的篩選。Ttl代轉基因植株PCR檢測篩選轉基因植株后，移栽陽性苗于普通MS培養(yǎng)基5天后轉移至土壤栽培，待植株發(fā)育至一定階段后取葉片提取總DNA，用CaMV35S引物以及基因特異性引物搭配檢測轉基因植株。擬南芥總DNA的提取采取常規(guī)CTAB法。6、轉基因擬南芥純合子的鑒定由于農桿菌介導的花序浸染法只能將目標片段整合到一條DNA單鏈上，為了后續(xù)生理性狀實驗及功能研究的需要，將Ttl代轉基因種子培育至T2代，利用抗性篩選得到純合子。根據(jù)雜合子在發(fā)生性狀分離時會產生野生型后代，而野生型種子不能在MS+Kan (50 μ g/ ml)平板上正常生長，進行轉基因植株純合子的篩選。分別得到轉入了 UGT的大于3個獨立株系的轉基因純合種子進行下一步試驗。實施例三、轉基因植株的耐旱試驗選取正向轉入UGT71C5的過量表達株系3個(0E1，0E2, 0E3)，抑制表達株系(反向轉入UGT71C5)3個(Dm，DN2，DN3)。選取上述株系中在培養(yǎng)條件一致的育苗盤培養(yǎng)1月左右的生長狀況較一致的植株，將育苗盤剪開把各株系分成相同的兩部分，一部分不澆水處理，另一部分作為對照，仍正常澆水，另選取野生型的植株作為對照。除了水一個因素，其它培養(yǎng)條件嚴格保證一致。按時觀察苗的生長情況并做記錄。
表1轉入UGT71C5植株的耐旱試驗結果
權利要求
1.一種提高植物耐旱性的方法，其特征在于通過抑制尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因在植物體內的表達，從而提高其耐旱性。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于所述的抑制尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因在植物體內的表達，是用基因反向插入、基因敲除或RNA干擾中的任一種手段進行。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟a、構建尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因反向插入的表達質粒；b、將構建的尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因反向插入的表達質粒轉入植物中獲得轉基因基因陽性植株，其UGT基因的表達被抑制，抗旱性得到提尚。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述的尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶基因序列為SEQ ID NO. 1所示。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述的表達質粒為PCAMBIA2301。
全文摘要
本發(fā)明屬于提高植物抗性領域，具體涉及一種提高植物耐旱性的方法。本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種能提高植物抗旱性的新的有效方法。解決該技術問題的技術方案是提供一種提高植物抗旱性的方法，該方法為通過抑制尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶(UGT)基因在植物體內的表達，從而提高其耐旱性。本發(fā)明方法為本領域提高植物抗旱性能提供了新的思路，是一種能提高植物抗旱性的新的有效方法，具有很好的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK102409059SQ20101028872
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權日2010年9月21日
發(fā)明者楊毅 申請人:四川大學