專利名稱：：來自曲霉的內(nèi)切β－1,4－葡聚糖酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種酶，另外，本發(fā)明涉及編碼這種酶的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及一啟動子，該啟動子被用來控制編碼所述酶的所述核苷酸序列的表達。具體地說，本發(fā)明所述的酶是一種葡聚糖酶-即一種能降解β-1，4-糖苷鍵的酶。已知希望在生物體-如絲狀真菌(如黑色曲霉(AspergillusNiger))或者甚至一種農(nóng)作物的一些組織中指導所感興趣的基因(“GOI”)的表達。產(chǎn)物蛋白質(zhì)或者酶對于生物體本身可以是有用的。例如，可能希望產(chǎn)生有優(yōu)化的氨基酸組成的作物蛋白產(chǎn)物，以提高作用的營養(yǎng)價值。例如，這種作物可以制成更有用的飼料。或者，可能希望分離產(chǎn)物蛋白質(zhì)或酶，然后使用這種蛋白質(zhì)或酶來制備，例如，食品組合物。從這一點來看，該產(chǎn)物蛋白質(zhì)或酶可以食品組合物的一個成分，或者它可以被用來制備食品組合物，包括改變食品組合物的性質(zhì)或外觀。甚至可能希望使用生物體，如一種絲狀真菌或者一種農(nóng)作物，為了相同的目的來表達非植物基因。也可能希望使用一種生物體如一種絲狀真菌或一種農(nóng)作物，來表達哺乳動物基因。后者產(chǎn)物的例子包括干擾素、胰島素、血因子和血纖蛋白溶酶原激活物。也希望使用微生物，如絲狀真菌，通過使用在該微生物中有活性的啟動子，由GOI制備產(chǎn)品。水果和蔬菜細胞壁大多由多糖組成，主要成分是果膠、纖維素和木糖葡聚糖(R.R.Selvendran和J.A.Rogbertson，IFR報告(IFRReport)，1989)。已經(jīng)提出過多種細胞壁模型，努力加入強度和柔性基本性質(zhì)(P.Albersheim，美國科學(Sci.Am.)，232，81-95，1975，P.Albersheim，植物生物化學(PlantBiochem.)第三版(Bonner和Varner)，Ac.Pross，1976；T.Hayashi植物生理及植物分子生物學年度綜述(Ann.Rev.PlantPhysiol&PlantMolBiol，40，139-168，1989)。植物細胞壁的組成復雜而多樣。發(fā)現(xiàn)多糖主要以長鏈纖維素(植物細胞壁的主要結構成分)，半纖維素(含有多種β-木聚糖鏈，例如木葡聚糖(xyloglucans))和果膠物質(zhì)(由半乳糖醛聚糖(galacturonan)和鼠李糖半乳糖醛聚糖(thamnogalacturonan)；阿拉伯聚糖和半乳聚糖及阿拉伯半乳聚糖組成)的形式。具體地說葡聚糖專一性地由葡萄糖亞基組成。葡聚糖典型的例子是淀粉和纖維素。降解葡聚糖的酶總稱為葡聚糖酶。一種典型的葡聚糖是β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶。β-1，4-內(nèi)切葡聚糖已經(jīng)應用于多種工業(yè)。例如釀酒業(yè)，在近些年，作為釀酒過程中的副產(chǎn)物，大麥用于生產(chǎn)啤酒。當啤酒質(zhì)地不好，或者大麥作為副產(chǎn)物被使用時，因為來自大麥的β-葡聚糖而產(chǎn)生麥芽汁中高粘度問題。就這一點來說，大麥含有大量非常高分子量的混合的β-1，3/1，4-葡聚糖。溶解時這些葡聚糖產(chǎn)生高粘度溶液，這在一些應用中帶來麻煩。例如，高粘度降低了麥芽汁的可過濾性，并帶來不可接受的長過濾時間。為避免這些問題，傳統(tǒng)上向麥芽汁中加入β-葡聚糖酶來避免這些問題-即葡聚糖帶來的問題可以通過加入酶，特別是葡聚糖酶(其降解該聚合物)而避免。有關這些問題的其它信息可以參見C.W.Bamforth博士寫的綜述，Grindsted手冊，名為《葡聚糖酶GV》(“GlucanaseGV”)(BrewersDigest，1982年6月，pp.22-28；和Brewers’Guardian，1985年9月，pp.21-26)，和T.Godfrey的文章(《工業(yè)酶學-酶在工業(yè)上的應用》(IndustrialEnzymologyTheApplicationofEnzymes)，第4.5章，pp.221-259)。在食品工業(yè)中，由于大麥價廉而被用來制造雞飼料，但還是β-葡聚糖帶來雞消化不食問題。通過向食物中加入β-葡聚糖酶可以提高食物的可消化性。而且喂食含大麥食品的雞的排泄物有粘性，使其不易去除而使產(chǎn)蛋骯臟。WO93/2019討論了內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(ECno.3.2.1.4)。根據(jù)WO93/2019，這些萄聚糖酶是一組水解酶，其催化纖維素，地衣淀粉，谷物β-D-葡聚糖和其它含纖維素部分的植物材料中1，4-β-D-糖苷鍵的內(nèi)切水解。內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖基水解酶有時稱作內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶。WO93/2019中的內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶具有最適pH為2.0至4.0，等電點是2.0至3.5，分子量在30,000和50,000之間，最適溫度在30和70℃之間。有關葡聚糖，特別是木糖基葡聚糖(xyloglucan)的進一步教誨可以參見WO93/17101。根據(jù)WO93/17101，木糖基葡聚糖是被α-1，6-木糖基側鏈廣泛取代的，其中一些是1，2-β-半乳糖基化的。其大量發(fā)現(xiàn)于雙子葉的初生細胞壁中，但在一些種子中也有發(fā)現(xiàn)，它們在其中起各種各樣的作用。初生細胞壁木糖基葡聚糖是巖藻糖基化物的。木糖基葡聚糖緊密地氫鍵鍵合于纖維素微纖維，需要濃堿或強的溶脹劑才能釋放它。據(jù)認為木糖基葡聚糖在纖維素微纖維之間形成交聯(lián)橋，這種纖維素/木糖基葡聚糖網(wǎng)絡形成該細胞壁主要的負載/彈性網(wǎng)絡。DCB突變懸浮培養(yǎng)細胞(細胞壁缺乏纖維素)將木糖基葡聚糖釋放到它們的培養(yǎng)基中，說明木糖基葡聚糖一般當然與纖維素鍵聯(lián)。在IAA誘導生長中，初生細胞壁的水解已在壓片胚軸無光生長的區(qū)段中得已證實(K.Wakabayashi等，植物生理學(PlantPhysiol.，95，1070-1076，1991)。據(jù)認為壁木糖基葡聚糖內(nèi)切水解與伴隨細胞膨脹的壁松散有關(T.Hyashi，植物生理學和植物分子生物學年度綜述(Ann.Rev.PlantPhysiol&PlantMol.Biol.)，40，139-168，1989)。木糖基葡聚糖的平均分子量也呈示出在蕃茄果實成熟過程中降低，而且這可能與伴隨成熟過程中組織變軟有關(D.J.Huber，J.Amer.Soc.HortSci.，108(3)，405-409，1983)。一些種子，例如Masturtium，含有最多30％重量的木糖基葡聚糖，儲存在加厚的子葉細胞壁中，其作用是儲存多糖，并在發(fā)芽期間快速解聚。提高葡聚糖酶活性，例如優(yōu)選使用重組DNA技術獲得用于食物的有高濃度葡聚糖酶的植物，這一點是有用的。本發(fā)明試圖提供一種具有葡聚糖酶活性的酶；優(yōu)選其中這種酶能例如僅在一種生物體，一般為一絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉的一些或特定細胞或組織中制得，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中制得。本發(fā)明也試圖提供一種編碼這種酶的GOI，這種GOI能優(yōu)選在一種生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉，特定細胞或組織中表達，或者甚至是一種植物的一些或特定細胞或組織中表達。此外，本發(fā)明試圖提供一種能指導GOI表達的啟動子，例如優(yōu)選在某些特定細胞或組織，例如僅在一種生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。優(yōu)選在曲霉屬中使用這種啟動子，其中由GOI編碼的產(chǎn)物從宿主生物體分泌到周圍基質(zhì)中。而且，本發(fā)明試圖提供包含GOI和/或啟動子的構建，載體，質(zhì)粒，細胞，組織，器官和生物體，以及優(yōu)選在特定細胞或組織中的表達方法，例如僅在一種生物體，一般是絲狀真菌，優(yōu)選在曲霉屬，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中表達。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種從曲霉屬得到的酶，其中該酶具有如下特征MW是24235D±50D；pI值大約為4；葡聚糖酶活性；其中該葡聚糖酶活性是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶活性。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供具有如SEQIDNO1所示序列的酶，或者其變體，同系物或片段。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供由SEQIDNO2所示核苷酸序列或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列編碼的酶。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供編碼本發(fā)明所述酶的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供具有SEQIDNO2所示的序列的核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供具有SEQIDNO3所示序列的啟動子，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供具有SEQIDNO13所示核苷酸序列的終止子，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供具有SEQIDNO14所示核苷酸序列的信號序列，或其變體，同系物或片段，或與其互補的序列。根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供通過使用一種啟動子表達GOI的方法，其中所述啟動子是本發(fā)明啟動子。根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供本發(fā)明酶降解葡聚糖的應用。根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供用于表達能降解阿拉伯糖基木聚糖的酶，或者用于控制其表達，或用于控制另一GOI表達的質(zhì)粒NCIMB40703，或從中獲得的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供具有SEQIDNO15所示序列的信號序列，或其變體，同系物或片段。根據(jù)本發(fā)明的第十三方面，是提供具有降解β-1，4-葡糖苷鍵能力的葡聚糖酶，其具有與抗具有SEQIDNO1所示序列的純化的葡聚糖酶的抗體的免疫反應性。根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供一種可由葡萄糖誘導的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的第十五方面，是提供葡萄糖誘導啟動子的應用。本發(fā)明的其它方面包括由本發(fā)明前述方面構成的構建物，載體，質(zhì)粒，細胞，組織，器官和轉(zhuǎn)基因生物體。本發(fā)明的其它方面包括表達或使表達或轉(zhuǎn)化任一核苷酸序列，構建物，質(zhì)粒，載體，細胞，組織，器官或生物體，以及其產(chǎn)物的方法。本發(fā)明的另外方面包括使用所述啟動子在培養(yǎng)基如肉湯或者在轉(zhuǎn)基因生物體中表達GOI。本發(fā)明的再一方面包括用所述酶制備或處理食物，包括動物飼料。在下文中，本發(fā)明酶有時稱作Egla酶，其編碼序列有時稱作Egla基因。另外，本發(fā)明啟動子有時稱作Egla啟動子。優(yōu)選所述酶由SEQIDNO2所示核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或者與其互補的序列編碼。優(yōu)選所述核苷酸序列具有SEQIDNO2所示序列，或是其變體，同系物或其片段。優(yōu)選所述核苷酸序列與啟動子操作連接。優(yōu)選所述啟動子是具有SEQIDNO3所示序列，或是其變體，同系物或片段，或者是與其互補的序列的啟動子。優(yōu)選本發(fā)明啟動子與GOI操作連接。優(yōu)選所述GOI包含本發(fā)明核苷酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體是一種真菌，例如所述生物體可以是一種酵母，其可能用于例如造酒工業(yè)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因生物體是絲狀真菌，更優(yōu)選曲霉屬。在另一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體是一種植物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體是一種酵母，從這點上來說，酵母已經(jīng)被廣泛用作異源基因表達的載體。啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)有很長歷史的工業(yè)應用，包括用于異源基因表達。啤酒糖酵母中異源基因的表達參見Goodey等(1987，酵母生物技術(YeastBiotechnology)，DRBerry等編著，pp.401-429，Allen和Unwin，倫敦)和King等(1989，酵母的分子和細胞生物學(MolecularandCellBiologyofYeasts)，EFWalton和GTYarronton編著，pp.107-133，Blackic，Glasgow)。啤酒糖酵母很適合異源基因表達有幾個原因。首先，其對人是非病原性的，不能產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，其有安全使用的長久歷史，幾個世紀以來用于多種目的的商業(yè)應用。這使得廣泛被公眾接受。第三，大量商業(yè)應用和研究使已有很多有關基因和生理學以及啤酒糖酵母大量發(fā)酵性質(zhì)的認識。另一個優(yōu)點是酵母能翻譯后修飾蛋白質(zhì)，從而具有將異源基因產(chǎn)物糖基化和/或分泌到生長基質(zhì)中的能力。異源基因在啤酒糖酵母中表達和基因產(chǎn)物分泌的原理的綜合性文章參見E.Hinchcliffe.EKenny(1993，“酵母作為異源基因表達的載體”(Yeastasavehiclefortheexpressionofheterologousgenes)，《酵母》(Yeasts)，Vol.5，AnthonyH.Rose和JStuartHarrison，編著，第二版，科學出版社)。已經(jīng)在酵母中表達的酶的糖基化作用提高酶的熱穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明葡聚糖酶的提高的熱穩(wěn)定性使這種酶適于用于釀酒工業(yè)和用于動物食品如雞飼料的制造中。已經(jīng)酵母分泌很少幾種蛋白質(zhì)在培養(yǎng)基中，這使酵母成為異源基因表達的富有吸引力的宿主，因為分泌的基因產(chǎn)物可容易地回收和純化?？梢缘玫綆追N類型酵母載體，包括整合型載體，其需要與宿主基因組重組以維持，和自主復制質(zhì)粒載體。為了制備轉(zhuǎn)基因糖酵母，通過將一種GOI(例如淀粉酶或SEQIDNO2)插入到為在酵母中表達而設計的構建物中而制備表達構建物，已經(jīng)研究出用于異源表達的幾種類型構建物。這些構建物包含與GOI融合的在酵母中有活性的啟動子，通常使用酵母源啟動子，如GAL1啟動子。GOI可以與一個信號序列融合，該信號序列指導GOI編碼的蛋白質(zhì)的分泌。通常使用酵母源的信號序列，例如編碼SUC2信號肽的序列。在酵母中有活性的終止子終止表達體系。已經(jīng)報道過幾種異源基因在酵母中表達。這些基因產(chǎn)物可以被糖基化，這對于要用于期望熱耐受性的具體應用中的一些酶是有好處的。如果GOI沒有與信號序列融合，則蛋白質(zhì)可以胞內(nèi)儲存，或者如果GOI與信號序列融合，則蛋白質(zhì)可以胞外分泌。已經(jīng)研究出轉(zhuǎn)化酵母的幾種轉(zhuǎn)化方案。例如，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因糖酵母可以根據(jù)Hinnen等(1978，美國國家科學院科研論文集，75，1929)，Beggs，JD(1978，《自然》，倫敦，275，104)；和Ito，H等(1983，《細菌學》(J.Bacteriology)153，163-168)的教導而制備。轉(zhuǎn)化的酵母細胞用各種選擇標記物來選擇。用于轉(zhuǎn)化作用的標記物是一些營養(yǎng)缺陷型標記，例如LEU2，HIS4和TRP1，和顯性抗生素抗性標記，如氨基糖苷抗生素標記，例如G418。本發(fā)明各方面高度優(yōu)選的實施方案不包括任何一種天然環(huán)境中的天然酶，天然啟動子，或天然核苷酸序列。優(yōu)選的是任何一種質(zhì)粒，載體，如表達載體或轉(zhuǎn)化載體，細胞，組織，器官，生物體或轉(zhuǎn)基因生物體中，啟動子與至少一種GOI結合存在。優(yōu)選所述啟動子和GOI被穩(wěn)定地插入到轉(zhuǎn)基因生物體的基因組中。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因生物體是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選是黑色曲霉?；蛘咿D(zhuǎn)基因生物可以是酵母。轉(zhuǎn)基因生物體甚至可以是一種植物，如單子葉或雙子葉植物。最為優(yōu)選的實施方案是一種自曲霉得到的酶，其中該酶具有下述特征，MW為24235D±50D；pI值大約為4；葡聚糖酶活性，其中葡聚糖酶活性是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶活性；其中所述酶具有SEQIDNO1所示序列，或是其變體，同系物或片段。另一最為優(yōu)選的實施方案是自曲霉得到的一種酶，其中該酶具有如下特征Mw為24235D±50D；pI值大約為4；葡聚糖酶活性；其中葡聚糖酶活性是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶活性；其中所述酶由SEQIDNO2所示核苷酸序列或其變體，同系物或片段編碼，或由與其互補的序列編碼。本發(fā)明的優(yōu)點在于，它提供了一種制備葡聚糖酶的方法，以及編碼這種酶的核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了能控制那個或另外的核苷酸序列表達的啟動子。本發(fā)明的其它優(yōu)點是這種酶能用來制備含谷物，如大麥、玉米、稻的有用的飼料。因此，本發(fā)明提供一種具有葡聚糖酶活性的酶，其中該酶可以在一些或特定細胞或組織中制得，例如只在生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，例如黑色曲霉的特定細胞或組織中制備，該酶甚至可以在一種植物中制備。本發(fā)明也提供編碼所述酶的GOI，該GOI可以優(yōu)選在特定細胞或組織中表達，如在生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選為曲霉屬，如黑色曲霉的某些或特定細胞或組織中表達。該GOI甚至可以在一種植物中表達。另外，本發(fā)明提供一種能指導GOI表達的啟動子，如編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，優(yōu)選在某些特定細胞或組織中表達，例如只在生物體，一般為絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，例如黑色曲霉，或者甚至是一種植物的特定細胞或組織中表達，優(yōu)選在曲霉中使用所述啟動子，其中GOI編碼的產(chǎn)物從宿主生物體分泌到周圍基質(zhì)中。甚至可以裁制啟動子(如果需要的話)以在植物中表達GOI。本發(fā)明也提供了包含所述GOI和/或啟動子的構建物，載體，質(zhì)粒，細胞，組織，器官和生物體，表達GOI的方法，優(yōu)選在特定細胞或組織中表達，例如，只在生物體一般為絲狀真菌，優(yōu)選在曲霉屬中，或者甚至是植物的特定細胞或組織中表達。與酶有關系的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或條件是所得氨基酸序列具有葡聚糖降解活性，優(yōu)選至少具有序列表(SEQ.I.D.No.1或12)所示酶的相同活性，具體地說，術語“同系物”包括有關結構和/或功能的同源性，條件是所得酶具有葡聚糖降解活性。關于序列同源性，優(yōu)選與序列表所示SEQ.I.D.No.1至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更為優(yōu)選的是與序列表中所示SEQI.D.No.1至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。與編碼所述酶的核苷酸序列有關系的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)核酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列編碼具有葡聚糖降解活性的酶，優(yōu)選至少具有序列表(SEQ.I.D.No.2或12)所示酶的相同活性，具體地講，術語“同系物”包括關于結構和/或功能的同源性，條件是所得核苷酸序列編碼具有葡聚糖降解活性的酶。有關序列的同源性，優(yōu)選與序列表中所示的SEQ.I.D.No.2至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更為優(yōu)選的是與序列表中所示SEQ.I.D.No.2至少95％更優(yōu)選至少98％同源性。與啟動子相關的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)核酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列在表達系統(tǒng)-例如根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細胞或者轉(zhuǎn)基因生物體中具有作為啟動子而起作用的能力。具體地講，術語“同系物”包括與結構和/或功能有關的同源性，條件是所得核苷酸序列具有作為啟動子而起作用的能力。關于序列同源性，優(yōu)選與序列表所示SEQ.I.D.No.3至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更為優(yōu)選的是與序列表所示SEQ.I.D.No.3至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。與終止子或信號核苷酸序列有關的術語“變體”，“同系物”或“片段”包括一個(或幾個)核酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得核苷酸序列在表達系統(tǒng)-例如根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細胞或轉(zhuǎn)基因生物體中分別具有作為終止子而起作用或者編碼具有作為信號序列而起作用的能力的氨基酸序列的能力。具體地說，術語“同系物”包括有關結構和/或功能的同源性，條件是所得核苷酸序列具有各作為或編碼終止子或信號序列的能力。關于序列同源性，優(yōu)選與序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分別地)至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選的是與序列表中所示SEQ.I.D.No.13和14(分別地)至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。與信號氨基酸序列有關的術語“變體”，“同系物”，或“片段”包括一個(或多個)氨基酸對于序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加，條件是所得序列在表達系統(tǒng)-例如根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞或者轉(zhuǎn)基因生物體中具有作為信號序列而起作用的能力。具體地說，術語“同系物”包括有關結構和/或功能的同源性，條件是所得核苷酸序列分別具有作為或編碼一個信號的能力。關于序列同源性，優(yōu)選于序列表所示SEQ.I.D.No.15至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選的是與序列表所示SEQ.I.D.No.15至少95％，更優(yōu)選至少98％同源性。上述術語是序列等位變異的同義詞。術語“互補”指本發(fā)明也包括能分別與編碼序列或啟動子序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。與本發(fā)明有關的術語“核苷酸”包括基因組DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。優(yōu)選其指DNA，更優(yōu)選指用于本發(fā)明編碼序列的cDNA，因為基因組編碼序列具有兩個內(nèi)含子，去除之，將使其在細菌中表達成為可能。術語“構建物”-其與術語如“綴合物”，“彈夾”和“雜種”是同義詞-包括與啟動子直接或間接相連的GOI。一個間接連接的例子是有一合適的間隔基團，例如一內(nèi)含子序列，例如ShI內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子，在啟動子和GOI之間起中介作用。對于包括直接或間接連接的與本發(fā)明有關的術語“融合”也是一樣。在每種情況下最為優(yōu)選的是這些術語不包括編碼酶的基因正常地與野生型基因啟動子相聯(lián)的，且兩者都在其自然環(huán)境下的情況的天然組合。最為優(yōu)選的實施方案是與一種或所述啟動子操作連接所述或一種GOI。所述構建物甚至可以包含或表達一標記物，該標記物使選擇已被轉(zhuǎn)移到例如絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，例如黑色曲霉，或者植物，優(yōu)選谷類，例如玉米，稻，大麥等中選擇所要的基因構建物成為可能。存在可以使用的多種標記物，例如那些編碼甘露糖-6-磷酸異構酶的標記物(尤其是用于植物)或者提供抗生素抗性的那些標記物-例如G418抗性，潮霉素，博來霉素，卡那霉素和慶大霉素抗性。術語“載體”包括表達載體和轉(zhuǎn)化載體。術語“表達載體”指能體內(nèi)或體外表達的構建物。術語“轉(zhuǎn)化載體”指能從一個物種轉(zhuǎn)移到另一個物種的構建物-例如從大腸桿菌(E.coli)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬。其也可以是能從E.coli質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到土壤桿菌轉(zhuǎn)移到一種植物的構建物。術語“組織”包括組織本身和器官。與本發(fā)明有關的術語“生物體”包括可能包含本發(fā)明啟動子和/或編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或從其中得到的產(chǎn)物的任何生物體，其中所述啟動子能使表達GOI和/或其中本發(fā)明核苷酸序列當在生物體中存在時能被表達。優(yōu)選生物體是絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選黑色曲霉。與本發(fā)明有關的術語“轉(zhuǎn)基因生物體”包括包含本發(fā)明啟動子和/或編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或從其中得到的產(chǎn)物的任何生物體，其中在生物體內(nèi)所述啟動子能使GOI表達和/或其中本發(fā)明核苷酸序列在能被表達。優(yōu)選啟動子和/或核苷酸序列被插入到生物體的基因組中。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因生物是絲狀真菌，更優(yōu)選曲霉屬，更優(yōu)選黑色曲霉。因此，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物體包括包含有任一本發(fā)明啟動子，編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，本發(fā)明構建物，本發(fā)明載體，本發(fā)明質(zhì)粒，本發(fā)明細胞，本發(fā)明組織或其產(chǎn)物，或者包含它們的組合的一種生物體。例如，轉(zhuǎn)基因生物體可以包含本發(fā)明啟動子控制下的GOI，優(yōu)選外源核苷酸序列。轉(zhuǎn)基因生物體也可以包含啟動子控制下的編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列，所述啟動子可以是本發(fā)明啟動子。在高度優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體不包含本發(fā)明啟動子和編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的組合，其中所述啟動子和核苷酸序列兩者對于該生物體是天然的，且處于它們的天然環(huán)境。因此在高度優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明不包括處于其也處于其天然環(huán)境下的天然啟動子的控制之下時處于其天然環(huán)境的根據(jù)本發(fā)明的天然的核苷酸編碼序列。另外，在高度優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明不包括處于其天然環(huán)境和由也處于自然環(huán)境的、其處于也處于其天然環(huán)境下的天然啟動子的控制下的天然核苷酸編碼序列表達的據(jù)本發(fā)明的天然的酶。術語“啟動子”是本領域通常的意義，例如-Jacob-Mond基因表達理論中的RNA聚合酶結合位點。一方面，本發(fā)明啟動子能表達GOI，其可以是編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列處于使核苷酸序列表達的啟動子控制之下。從這一點上來說，啟動子不一定要是與本發(fā)明啟動子相同的啟動子。從這方面來說，啟動子可以是一種細胞或組織特異性啟動子。例如，如果生物體是一種植物，則啟動子可以是在莖，苗，根和葉組織的一種或幾種中影響核苷酸序列表達的啟動子。例如，本發(fā)明核苷酸序列的啟動子可以是α-Amy1啟動子(另外也稱作Amy1啟動子，Amy637啟動子或α-Amy637啟動子)，參見1994年10月21日申請的共同未決的UK專利申請No.9421292.5。所述啟動子包含圖1所示的序列。或者本發(fā)明核苷酸序列的啟動子可以是α-Amy3啟動子(另外也稱為Amy3啟動子，Amy351啟動子或α-Amy351啟動子)，參見1994子包含圖2所示序列。年10月21日申請的審而未決的UK專利申請No9421286.7。所述啟動子包含圖2所示序列。優(yōu)選啟動子是本發(fā)明啟動子。除上述核苷酸序列外，啟動子，特別是本發(fā)明啟動子可以另外包括確保或增加在合適宿主中表達的性質(zhì)。例如所述性質(zhì)可以是保守區(qū)，如PribnowBox或TATA匣。所述啟動子也可以包含影響(例如保持，增強，提高)GOI表達水平的其它序列。例如合適的其它序列包括Sh1-內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。其它序列包括可誘導元件-例如溫度，化合物，光或應激反應可誘導元件。也可以存在增強轉(zhuǎn)錄或翻譯的合適的元件。后者元件的一個例子是TMV5′信號序列，參見Sleat基因217，217-225；和Dawson植物分子生物學(DawsonPlantMol，Biol)2397)。另外，本發(fā)明也涉及啟動子和/或編碼蛋白質(zhì)或酶的核苷酸序列和/或元件的組合。例如，本發(fā)明涉及與可能是根據(jù)本發(fā)明的一個核苷酸序列的GOI操作連接的根據(jù)本發(fā)明的啟動子的組合，和另外一個啟動子，如與相同或不同GOI操作連接的一種組織特異性啟動子的組合。本發(fā)明也涉及用啟動子來表達編碼根據(jù)本發(fā)明酶的核苷酸序列用途，其中啟動子的一部分是失活的，但其中該啟動子仍能起啟動子的作用。啟動子的部分失活在某些情況下是有好處的。具體地說，對于早些時候提到的Amy351啟動子，能夠失活啟動子的一部分，從而部分失活的啟動子以更專一的方式如只在一種特定組織類型或器官中表達GOI。術語“失活的”指部分失活，意義在于啟動子的表達模式被修飾，但其中部分失活的啟動子仍起啟動子作用。但是，如上所述，修飾過的啟動子能在至少一種(但不是全部)原啟動子的特定組織中表達GOI。一種這樣的啟動子是如上所述的Amy351啟動子。部分失活的例子包括改變啟動子序列的折疊模式，或者改變其與核苷酸序列部分組合，這樣，核苷酸序列的一部分不被例如RNA聚合酶識別。另一優(yōu)選的部分失活啟動子的方法是將其截短成其片段。另一種方法是使該序列的至少一部分突變，從而RNA聚合酶不能組合這一部分或另一部分。另一種修飾作用是突變調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結合位點，例如已知來自絲狀真菌的施加碳分解產(chǎn)物的阻遏作用CreA蛋白質(zhì)，從而解除天然啟動子的分解代謝產(chǎn)物的阻遏作用。術語“GOI”參照本發(fā)明是指所感興趣的任何基因。GOI可以是對于所研究生物體(例如絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬，或一種植物)是外來的或本身的任何核苷酸。GOI典型的例子包括修飾代謝和分解代謝過程中的蛋白質(zhì)和酶的編碼基因。GOI可以編碼引入或提高病原抗性的一種試劑。GOI還可以是修飾相關組織中存在的天然轉(zhuǎn)錄本的表達的反義構建物。GOI還可以編碼絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬的非天然蛋白質(zhì)，或者編碼對動物或人有好處的一種化合物。例如，GOI可以編碼藥學活性蛋白質(zhì)或酶，例如，治療化合物胰島素，干擾素，人血清白蛋白，人生長因子和凝血因子之任何一種。從這點上來說，轉(zhuǎn)化的細胞或生物體可以制備可接受量的所期化合物，而這種化合物容易自該細胞或生物體得到。GOI也可以是給予一種食品或作物營養(yǎng)價值的一種蛋白質(zhì)。典型的例子包括能抑制抗營養(yǎng)因子生成的植物蛋白和具有更加期望的氨基酸組成(例如比非轉(zhuǎn)基因植物有更高的賴氨酸含量)的植物蛋白。GOI還可以編碼可以用于食品加工的酶，例如凝乳酶，奇異果甜蛋白和α-半乳糖苷酶。GOI可以是任何一種有害毒素的編碼基因，可以是一反義轉(zhuǎn)錄本，如對于馬鈴薯蛋白(patatin)或α-淀粉酶，ADP-葡糖焦磷酸酶(例如參見EP-A-0455316)的反義轉(zhuǎn)錄本，一種蛋白水解酶反義或葡聚糖酶的反義轉(zhuǎn)錄本。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，這是我們于1994年7月4日申請的共同未決UK專利申請9413439.2的主題，序列在圖3中給出。GOI可以是編碼α-淀粉酶的核苷酸序列，這是我們于1994年10月21日申請的共同未決UK專利申請9421290.9的主題，序列在圖4中給出。GOI可以是編碼ADP-葡糖焦磷酸酶的核苷酸序列，這是我們于1994年4月7日申請的審而未決PCT專利申請PCT/EP94/01082的主題，其序列在圖5和圖6中給出。GOI可以是編碼α-葡聚糖水解酶的任何核苷酸序列，這在我們于1994年10月15日申請的審而未決PCT專利申請PCT/EP94/03397中有說明，其序列在圖7-10中給出。在一個優(yōu)選的實施方案中，GOI是編碼根據(jù)本發(fā)明酶的核苷酸序列。如上所述，一種優(yōu)選的宿主生物是曲霉屬，如黑色曲霉。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因曲霉可以根據(jù)下列文獻的說明而制得Rambosek，J，和Leach，J1987(絲狀真菌中的重組DNA改進和探索，CRC生物技術評論綜述(RecombinantDNAinfilamentousFungiProgressandBospectsCRCCrit.RevBiotechnol.)6357-393)，DavisR.W.1994(MartinelliS.D.，KinghornJ.R.(編著)《曲霉50年工業(yè)微生物進展》(Aspergillus50yearsonProgressinindustrialmicrobiology)，vol29，ElsevierAmsterdam1994，第525-560，“曲霉中異源基因表達和蛋白質(zhì)分泌(HeterologousgeneexpressionandproteinsecretioninAspergillus))，Ballance，D.J.1991(Leong，S.A.BerkaR，M.(編著)《分子工業(yè)真菌學，絲狀真菌的系統(tǒng)和應用》(MolecularIndustrialMycology，SystemsandApplicationforFilamentousFungi.)MarcelDekkerIncNewYork1991.pp1-29，“絲狀真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和真菌基因結構的總結”(TransformationsystemsforFilamentousFungiandanOverviewofFungalGeneStructure)，和TurnerG.1994(MartinelliSD.，KinghornJ.R.(編著)《曲霉50年工業(yè)微生物進展》，vol29，ElsevierAmster-dam1994，pp641-666，“基因操作的載體”(Vectorsforgeneticmanipulation))，而且，下面的說明總結了產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉的那些說明。在近乎一個世紀里，工業(yè)上已廣泛使用絲狀真菌來生產(chǎn)有機化合物和酶。傳統(tǒng)的日本Koji和大豆發(fā)酵已使用了曲霉屬幾百年。在本世紀已使用黑色曲霉生產(chǎn)有機酸，特別是檸檬酸，和生產(chǎn)各種用于工業(yè)的酶。絲狀真菌被廣泛用于工業(yè)有兩個主要原因。首先，絲狀真菌可以產(chǎn)生大量胞外產(chǎn)物，例如酶和有機化合物，例如抗生素或有機酸。其次，絲狀真菌可以在便宜的底物上生長，例如谷類，糠，甜菜肉質(zhì)部分等。相同原因使絲狀真菌成為根據(jù)本發(fā)明的異源表達的令人感興趣的生物體。為了制得轉(zhuǎn)基因曲霉，通過將GOI(例如一種淀粉酶或SEQ.I.D.No.2)插入到為在絲狀真菌中表達而設計的構建物而制備表達構建物。已經(jīng)研究出幾種類型用于異源表達的構建物。這些構建物包含根據(jù)本發(fā)明的在真菌中有活性的啟動子(或者如果GOI編碼根據(jù)本發(fā)明的酶而需要的另一啟動子)。除本發(fā)明外的啟動子的例子包括用于高度表達胞外酶的真菌啟動子，例如，葡糖淀粉酶啟動子或α-淀粉酶啟動子。該GOI可以與指導該GOI編碼的蛋白質(zhì)分泌的信號序列(例如本發(fā)明信號序列或另一個合適的序列)融合。通常使用真菌源信號序列，例如本發(fā)明的信號序列。在真菌中有活性的終止子終止表達體系，例如本發(fā)明的終止子。已經(jīng)研究出另外一種類型的真菌中的表達系統(tǒng)，其中GOI與編碼穩(wěn)定蛋白質(zhì)的真菌基因的較小或較大部分融合。這可以穩(wěn)定GOI編碼的蛋白。在這樣的體系中，被特異蛋白水解酶識別的一個切割位點可以被插入到真菌蛋白和GOI編碼的蛋白之間，這樣，產(chǎn)生的融合蛋白可以在該位點被特異蛋白水解酶切割，從而釋放GOI編碼的蛋白質(zhì)(“POI”)。作為例子，可以插入至少在一些曲霉中發(fā)現(xiàn)的象肽酶一樣的KEX-2識別的位點。這樣的融合導致體內(nèi)切割，從而保護POI并產(chǎn)生POI，而不產(chǎn)生較大融合蛋白。已經(jīng)報道過在曲霉中異源表達編碼細菌，真菌，脊椎動物和植物蛋白質(zhì)的幾種基因。如果GOI不與信號序列融合，則蛋白質(zhì)可以胞內(nèi)沉積。蛋白質(zhì)將在細胞質(zhì)中蓄集，而且通常不被糖基化，這對于一些細菌蛋白是有益的。如果GOI裝配有一信號序列，則蛋白質(zhì)將在胞外蓄集。就產(chǎn)生穩(wěn)定性和宿主菌株修飾作用而言，當一些異源蛋白分泌到真菌培養(yǎng)液中時，它們不是非常穩(wěn)定的，大多數(shù)真菌產(chǎn)生降解異源蛋白的幾種胞外蛋白水解酶。為了避免這一問題，已經(jīng)使用了具有降低的蛋白水解酶產(chǎn)量的一些特殊的真菌菌株作為異源生產(chǎn)的宿主。為轉(zhuǎn)化絲狀真菌，對于很多絲狀真菌已經(jīng)研究出一些轉(zhuǎn)化方案(Ballance1991，上文)。其中很多方案的基礎是制備原生質(zhì)體并用PEG和Ca2+離子將DNA插入到原生質(zhì)體內(nèi)。然后轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生，并用各種選擇性標記物選擇轉(zhuǎn)化的真菌。用于轉(zhuǎn)化作用的標記物是一些營養(yǎng)缺陷型標記物，例如argB，trpC，niaD，和pyrG，抗生素抗性標記物，如benomyl抗性，潮霉素抗性和腐草霉素抗性。一種很常用的轉(zhuǎn)化標記物是構巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因，高拷貝數(shù)的該基因用丙烯酰胺作為唯一氮源使真菌生長。盡管EP-B-0470145和CA-A-2006454中沒有公開本發(fā)明所述的酶，編碼該酶的核苷酸序列和本發(fā)明的啟動子，但這兩篇文獻對這些類型的技術提供了一些有用的背景注釋，可以應用到制備本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物。一些這樣的背景說明包括在下面的注釋中?；蚬こ谈淖兊闹参锏臉嫿ǖ幕驹硎窃谥参锘蚪M中插入遺傳信息，從而獲得插入物質(zhì)的穩(wěn)定保持。插入遺傳信息有幾種技術，兩個主要的原理是直接引入遺傳信息和使用載體系統(tǒng)引入遺傳信息。一般性技術的綜述可以參見Potrykus(植物生理和植物分子生物學年度綜述(AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol)42205-225)和Christou(農(nóng)業(yè)-食品-工業(yè)(Agro-Food-Industry)Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)的文章。因此，一方面，本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，其攜有本發(fā)明啟動子或核苷酸序列或構建物，而且能將該啟動子或核苷酸序列或構建物插入到一生物體，例如一種植物，的基因組中。所述載體系統(tǒng)可以包含一個載體，但也可以包含兩個載體。在有兩個載體的情況下，通常認為該載體系統(tǒng)是二元載體系統(tǒng)(binaryvectorsystem)。二元載體系統(tǒng)進一步詳細描述于GynheungAn等(1980)，二元載體，植物分子生物學手冊A3，1-19(BinaryVectors，PlantMolecularBiologyManualA3，1-19)。用一種給定的啟動子或核苷酸序列或構建物轉(zhuǎn)化植物細胞的一種被廣泛應用的系統(tǒng)的基礎是使用來自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti質(zhì)?；騺碜园l(fā)根病土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri質(zhì)粒，An等，(1986)，植物生理(PlantPhysiol)81，301-305，和ButcherD.N.等，(1980)，植物病理學家的組織培養(yǎng)方法(Tissue.CultureMethodsforPlantPathologists，編著D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。已經(jīng)構建出適用于構建上述植物或植物細胞構建物的幾種不同的Ti和Ri質(zhì)粒。一個非限制性的這樣的Ti質(zhì)粒的例子是pGV3850。本發(fā)明的啟動子，或核苷酸序列或構建物應該優(yōu)選插入到T-DNA或相鄰T-DNA序列的末端序列之間的Ti質(zhì)粒中，從而避免這些皮緊鄰T-DNA邊界的序列破碎，因為這些區(qū)中的至少一個顯示出對于將修飾的T-DNA插入植物基因組是必需的。從上面的解釋應該理解，如果所述生物體是一種植物，則本發(fā)明載體系統(tǒng)優(yōu)選是包含感染植物所必需的序列(例如Vir區(qū))和T-DNA序列的邊界部分之至少一個的載體系統(tǒng)，其中所述邊界部分位于與遺傳構建物同的載體上。而且，所述載體系統(tǒng)優(yōu)選是根癌土壤桿菌Ti-質(zhì)?；虬l(fā)根病土壤桿菌Ri-質(zhì)粒或者其衍生物，因為這些質(zhì)粒是公知的，而且廣泛應用于轉(zhuǎn)基因植物構建。存在很多載體系統(tǒng)，它們以這些質(zhì)粒或其衍生物為基礎。在轉(zhuǎn)基因植物構建中，本發(fā)明啟動子或核苷酸序列或構建物可以首先構建在一種微生物中，在該微生物中載體可以復制，而且其容易操作，一種有用的微生物的例子是E.coli，但也可以使用具有上述性質(zhì)的其它微生物。當在E.coli中構建了如上定義的載體系統(tǒng)中的載體后，如果需要，將其轉(zhuǎn)移到合適的土壤桿菌菌株中，例如轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌中。因此，優(yōu)選將載有本發(fā)明啟動子或核苷酸序列或構建的Ti-質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到合適的土壤桿菌菌株，如A.tumefaciens(根癌土壤桿菌)中，從而得到載有本發(fā)明啟動子，核苷酸序列或構建的土壤桿菌細胞，其中DNA接著被轉(zhuǎn)移到要修飾的植物細胞中。在CA-A-2006454中報道了可以獲得包含E.coli復制系統(tǒng)和使選擇轉(zhuǎn)化細胞成為可能的標記物的大量克隆載體。這些載體包含例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。用這種方法，本發(fā)明核苷酸或構建或啟動子可以被插入到載體中合適的限制性位點。包含的質(zhì)粒用于在E.coli中轉(zhuǎn)化。E.coli細胞在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后收獲，并裂解。然后回收質(zhì)粒。通常使用的分析方法是序列測定分析，限制性酶切分析，電泳，還有生物化學和分子生物學方法。每步操作后，使用的DNA序列可以限制性酶切并與下一個DNA序列連接。每一序列可以在相同或不同質(zhì)粒中克隆。在植物中本發(fā)明所期望啟動子或構建物或核苷酸序列的每一插入方法之后，可能需要存在和/或插入另一些DNA序列。如果例如為了轉(zhuǎn)化而使用了植物細胞中的Ti-或Ri-質(zhì)粒，則該Ti-和Ri-質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界，而常常是右邊界和左邊界(作為插入基因的側翼區(qū))可以被連接。為轉(zhuǎn)化植物細胞而使用T-DNA已經(jīng)被深入研究，而且在EP-A-120516中有描述；Hoekema，于TheBinaryPlantVectorSystemoffsetdrukkerijKantersB.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等，植物科學評論(CritRev，PlantSci.)，41-46；和An等，EMBOJ(1985)4277284。用土壤桿菌直接感染植物組織是一項簡單的技術，已經(jīng)被廣泛應用，且在ButcherD.N.等(1980)的《植物病理學家的組織培養(yǎng)方法》，編著D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中有描述。該技術的進一步說明參見Potrykus(植物生理植物分子生物學年度綜述)(AnnuRevPlantMolBiol)42205-225)和Chnstou(農(nóng)業(yè)-食品-工業(yè)，Hi-Tech，三月/四月，1994，17-27)。用這項技術，可以在植物的某些部分或組織，即在植物的葉，根，莖，或其它部位的一部分上感染植物。一般對于用攜有所述啟動子和/或所述GOI的土壤桿菌直接感染植物組織，要將要被感染的植物切出刀口，例如用剃刀切割植物，或者用針將植物刺孔，或者用砂紙磨擦植物。然后用土壤桿菌接種傷口，之后，接種后的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長，使其生長成成熟植物。當植物細胞被構建后，這些細胞可以根據(jù)公知的組織培養(yǎng)方法生長和保持，例如在補加有必需生長因素例如氨基酸，植物激素，維生素等之合適的培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)細胞。轉(zhuǎn)化的細胞再生成基因工程修飾的植物可以用植物自細胞或組織培養(yǎng)物再生的公知方法進行，例如通過用抗生素選擇轉(zhuǎn)化的枝，和通過在含有合適營養(yǎng)成分，植物激素等的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)枝而進行。對于植物轉(zhuǎn)化的進一步說明參見EP-A-0449375?？傊景l(fā)明提供了一種葡聚糖酶和編碼這種酶的核苷酸序列，另外，提供了能控制那個，或另一個核苷酸序列表達的啟動子。另外其包括對于相同核苷酸序列表達的終止子和信號序列。下面的樣品根據(jù)布達佩斯條約保藏在認可的保藏單位TheNationalCollectionsofIndustrialandMarineBacteriaLimited(NCIMB)，在不列顛和北愛爾蘭聯(lián)合王國，蘇格蘭，AberdeenMacharDrive23號，AB21RY，1995年1月16日包含質(zhì)粒pEGLA-3的E.coli{即E.coliDH5α-pEGLA-3}保藏號是NCIMB40704?，F(xiàn)在通過實施例的方式說明本發(fā)明。下面的實施例參考附圖進行，其中；圖1-10是早期專利申請的啟動子和GOI序列，對于本發(fā)明的各方面是有用的；圖11是質(zhì)粒pEGLA-3的質(zhì)粒圖；圖12是一些啟動子缺失的綱要圖解；圖13是pGPAMY質(zhì)粒14是圖解；圖15是pGP-GssAMY-Hyg質(zhì)粒圖；圖16是圖解；圖17是蛋白質(zhì)印跡。下面的敘述討論特別是重組DNA技術的應用。重組DNA技術的一般性說明可以參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.ManiatisT(編著)《分子克隆，實驗室手冊》(MolecularCloningAlaboratorymanual.)第二版，ColdSpringHarbourLaboratoryPress.NewYork1989。β-葡聚糖酶的純化黑色曲霉3M43在含有麥糠甜菜肉質(zhì)部分的培養(yǎng)基中生長。發(fā)酵肉湯從肉湯經(jīng)過濾的固體部分制備，濃縮的發(fā)酵肉湯裝載到用20mMTris，HClpH7.5平衡過的25×100mmQ-SEPHAROSE(Pharmacia)高效柱上，線性梯度是0-500mMNaCl，收集洗脫液級分。β-葡聚糖酶在大約100mMNaCl處洗脫出來。合并含有葡聚糖酶的級分，用50×200mmG-25SEPHAROSESuperfine(Pharmacia)脫鹽。用蒸餾水洗脫柱子。脫鹽后用High-Trap旋轉(zhuǎn)柱濃縮酶。接著將濃縮的脫鹽的級分在50×600mmSUPERDEX50柱上進行凝膠過濾。裝載樣品，用0.2M磷酸鹽緩沖pH7.0加0.2MNaCl洗脫柱子，收集洗脫液級分。合并含葡聚糖酶的級分并脫鹽，并且如上所述濃縮。合并的級分裝載到用50mM含有1.5M(NH4)2SO3的磷酸鹽緩沖液pH6.0平衡過的16×100mmPhenylsepharose高效柱(Pharmacia)上，使用(NH4)2SO3濃度自1.5-0M變化的梯度，并分部收集洗脫液。合并含有葡聚糖酶的級分。使用Phast系統(tǒng)凝膠(Pharmacia)通過SDS-PAGE評價β-1，4-葡聚糖酶的純度。表征通過使用激光解吸技術的質(zhì)譜測定純化的葡聚糖酶的分子量，發(fā)現(xiàn)葡聚糖酶的Mw是24235D±50D。使用廣譜pI試劑盒(Pharmacia)測定pI值。葡聚糖酶的pI值大約為4。SDS-PAGE分析后，處理PAS試劑顯示出葡聚糖酶是未經(jīng)糖基化的。根據(jù)I.VanSeuningen和M.Davril(1992)《電泳》(Elecrophoresis)13，pp.97-99的方法進行PAS染色。β-葡聚糖酶的氨基酸序列測定用Stone&Williams1993說明的方法的改良方法，用來自BoehringerMannheimLys-C序列測定級內(nèi)切蛋白酶消化所述的酶(Stone，K.L.和Williams，K.R(1993)“蛋白質(zhì)的酶消化和HPLC肽分離”，MatsudairaP.(編著)，《用于微量測序的蛋白質(zhì)和肽純化的實驗指南》，第二版，科學出版社，SanDiego，1993，pp.45-73(EnzymaticdigestionofProteinandHPLCPeptideIsolation、InMatsudairaP.(Editor).A.PracticalGuidetoProteinandPepndePurificationforMicrosequencing)。冷凍干燥的β-葡聚糖酶(0.4mg)溶解于50μl之8M尿素，0.4MNH4HCO3，pH8.4中。上面充滿N2后加入5μl45mMDTT，蛋白質(zhì)在50℃N2下變性并還原15分鐘。冷卻至RT后，加入5μl100mM碘代乙酰胺以使半胱氨酸衍生物化15分鐘，條件是RT，黑暗，N2。接著加入90μl水和5μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C的50μl50mMTricine和10mMEDTA，pH8.0的溶液，消化作用在37℃N2下進行24小時。所得肽在VYDACC18柱(0.46×15cm；10gm；TheSeparationsGroup；California)上用反相HPLC分離，使用溶劑A0.1％TFA水溶液，溶劑B0.1％TFA乙腈溶液。在使用脈沖液體循環(huán)于AppliedBiosystems476A測序儀上測定序列之前，用相同的溶劑體系將選擇的肽再在DevelosilC18柱(0.46×10cm；3gm)上進行色譜。發(fā)現(xiàn)下面的肽序列SEQI.D.No.4SEQI.D.No.5SEQI.D.No.6SEQI.D.No.7SEQI.D.No.8基因片段PCR克隆的分離用AppliedBiosystemDNA合成儀392型合成PCR引物。在這一方面，從發(fā)現(xiàn)的肽序列中的兩個，即來自SeqI.D.No.4的WEVWYGT和來自SeqI.D.No.7的WTWSGG合成PCR引物。自WEVWYGT(反向的)衍生的引物在SeqI.D.No.9中給出，自WTWSGG衍生的引物在SeqI.D.No.10中給出-見下文SEQI.D.No.10TGGACNTGGWSNGGNGG17mer256混合物SEQI.D.No.9CTNCCRTACCANACYTCCCA20mer64混合物PCR擴增是用100pmol每一種引物在100μl反應液中用AmplitaqII試劑盒(PerkinElmor)進行。程序是步驟溫度時間194℃2min294℃1min355℃2min472℃2min572℃5min65℃SOAK步驟2-4重復40個循環(huán)。PCR反應在PERKINELMERDNAThermal循環(huán)儀上進行。根據(jù)廠商說明(Novagen)，將350bp的擴增的片段分離并克隆到pT7-BlueT-載體上。分離片段并測序。發(fā)現(xiàn)的序列顯示其確實是葡聚糖酶基因的一部分。分離黑色曲霉(A.niger)基因組DNAlg的冷凍的A.niger菌絲體有研缽中在液氮中研磨。氮氣蒸發(fā)后，研磨的菌絲體用含有1ml20％十二烷基硫酸鈉的提取緩沖液(100mMTris，HCl，pH8.0，0.50mMEDTA，500mMNaCl，10mMβ-巰基乙醇)15ml提取。在65℃培養(yǎng)10分鐘后加入5ml5MKAc，pH5.0，混合后將混合物接著在冰上培養(yǎng)20分鐘。然后，將混合物離心20分鐘，上清液與0.6體積異丙醇混合以沉淀出提取的DNA。進一步離心15分鐘后，將DNA沉淀溶解于0.7mlTE(10mMTris，HCl，pH8.0，1mMEDTA)，并用75μl3MNaAc，pH8.0和500gl異丙醇沉淀。離心后，沉淀物用70％ETOH沖洗并真空下干燥。DNA溶解于200glTE并在-20℃下貯存。庫的構建用Tsp509I部分消化20μg基因組DNA，給出與EcoRI末端相容末端。消化的DNA在1％瓊脂糖凝膠上分離并純化4-10kb片段。使用λZAPIIEcoRI/CIAP試劑盒(購自Stratagene)根據(jù)廠商說明構建庫。根據(jù)廠商說明2μl接頭(總計5μl)與來自Stratagene的GigapackGoldII填充提取物一起包裝。該庫包含650,000個獨立的克隆。庫的篩選在NZY平板(每升5gNaCl，2mgMgSO4·7H2O，5g酵母提取液，10g酪蛋白水解產(chǎn)物，15g瓊脂)上平板接種2×50,000pfu，并在HybondN薄膜(Amersham)上進行噬斑取出。重復進行噬斑取出和雜交。薄膜用購自pharmacia的Ready-to-go標記盒與用32pdCTP(Amersham)標記的PCR克隆雜交。只有當在兩薄膜上都檢測到雜交時看作陽克隆。本發(fā)明核苷酸序列用ALF-激光熒光測序儀(Pharmacia)測序。該序列包括所有發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，證明該分離的基因確實編碼β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶。序列信息SEQI.D.No12代表啟動子序列，酶編碼序列，終止子序列和信號序列，和本發(fā)明酶的氨基酸序列。分析酶活性根據(jù)廠商說明使用Azurine-交聯(lián)的大麥β-葡聚糖壓片(tablet)(商品名Glucazyme壓片，Megazyme，Australia提供)對純化的蛋白質(zhì)測定其內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶活性。該純化的酶對該底物有高度活性。一般情況下該酶比活是每分鐘每毫克蛋白質(zhì)給出2250毫摩爾葡萄糖。誘導EglA基因誘導碳源的鑒定下表給出幾種高和低分子量葡聚糖酶啟動子的誘導物的特性。該分析使用與E.coliβ-葡糖醛酸酶基因融合的本發(fā)明全長葡聚糖酶啟動子。不同碳源的誘導強度通過測定細胞內(nèi)水解對-硝基苯酚葡糖醛的GUS特異活性而定量測定。碳源(1％)GUS活性(單位/mg)-24小時木糖12.91木糖醇10.62阿拉伯糖8.50阿拉伯糖醇14.40葡萄糖20.25纖維素二糖19.44木糖-寡聚物7011.80吡喃葡萄糖苷19.70甲基-吡喃木糖苷12.60木糖基葡聚糖13.90果膠9.7阿拉伯半乳聚糖30.20阿拉伯糖醇+葡萄糖29.50出人意料的是，一般是潛在的分解代謝阻抑物的葡萄糖誘導葡聚糖酶啟動子。因此，本發(fā)明也涉及葡萄糖誘導的啟動子。另外，本發(fā)明涉及使用葡萄糖誘導啟動子。本發(fā)明的這些方面不同于WO94/04673公開的內(nèi)容，WO94/04673公開了葡萄糖存在時有活性的一種真菌啟動子。從這點上來說，本發(fā)明啟動子不只是在葡萄糖存在下有活性，而且也被葡萄糖誘導。葡萄糖可誘導的葡聚糖酶啟動子優(yōu)點之一是該啟動子能用來表達GOI，從而被用來制備包含葡萄糖的環(huán)境中的POI(例如一種異源POI)。這是重要的，因為葡萄糖是生物量蓄集的優(yōu)選的碳源之一。另外，希望含葡萄糖的基質(zhì)產(chǎn)生較低量蛋白水解酶，從而得到更好的POI產(chǎn)率。另外，在脫阻抑的宿主菌株中使用脫阻抑啟動子將會提高反應基質(zhì)例如發(fā)酵反應培養(yǎng)基的速度和效率。另外，在發(fā)酵期間使用混合的碳源將使啟動子有效誘導，例如在低水平葡萄糖和廉價碳源(例如甜菜肉質(zhì)部分)時誘導。啟動子缺失對調(diào)節(jié)葡聚糖酶基因表達的影響。進行一系列缺失研究，見圖12。在這些研究中，圖12所示的不同啟動子缺失構建物與GUS基因融合。定性分析報道基因的活性。結果表明沒有一例缺失破壞葡聚糖酶啟動子的可誘導性。這些結果表明存在轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄起始的多處位點。使用包含葡聚糖酶啟動子(GP)和葡聚糖酶信號序列(Gss)的黑色曲霉的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生異源蛋白。黑色曲霉的轉(zhuǎn)化黑色曲霉(A.niger)的轉(zhuǎn)化方案以下述文獻的公開為基礎Buxton，F(xiàn).P.，GwynneD.I.，Davis，R.W.1985(“用構巢曲霉的argB基因轉(zhuǎn)化黑色曲霉”(TransformationofAspergillusnigerusingtheargBgeneofAspergillusnidulans)，《基因》(Gene)，37207-214)，Daboussi，M.J.，Dieballi，A.，Gerlinger，C.，Blaiseau，P.L，Cassan，M.，Lebrun，M.H.，Parisot，D，Brygoo，Y.1989(“使用構巢曲霉的硝酸鹽還原酶基因轉(zhuǎn)化幾種有絲真菌”(TransformationofsevenspeciesoffilamentousfunginsingthenitrateNeductosegeneofAspergillusnidulans)，Curr.Genet.15453-456)和Punt，P.J.，vandenHondel，C.A.M.J.J.1992(“以潮霉素B和腐草霉素抗性標記物為基礎轉(zhuǎn)化有絲真菌”(TransformationoffilamentousfungibasedonhygromycinBandPhlemycinresistancemarkers)，《酶學方法》(Meth、Enzym.)216447-457)。關于原生質(zhì)體的純化，在5-10ml水中從孢子新形成的N400(CBS120.49，CentraalbureauvoorSchimmelcultures，Baarn)(生長了7天)的-PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PotatoDextroseAgar)-fromDifcoLab.Detroit)板上沖洗下孢子。用該孢子懸浮液接種盛有200mlPDC(馬鈴薯葡萄糖肉湯，Difco0549-17-9，DifcoLab、Detroit)的震蕩瓶，并在30℃下震蕩(250rpm)16-20小時。使用Miracloth紙收獲菌絲體，并將3-4g濕的菌絲體轉(zhuǎn)移到盛有含75Mg裂解酶(SigmaL-2265)和4500個單位溶細胞酶(SigmaL-8012)的10mlSTC(1.2M山梨糖醇，10mMTrisHClpH7.5，50MmCaCl2)的無菌陪替氏皿中。菌60μm目過濾器過濾降解的菌絲體。在一甩平式轉(zhuǎn)頭中以2000rpm的速度離心10分鐘收獲原生質(zhì)體。棄去上清液，并將沉積物溶解于8ml1.5MMgSO4中后，以3000rpm離心10分鐘。用移液管將含有原生質(zhì)體的上層條帶轉(zhuǎn)移到另一試管中，并加入2ml0.6MKCl。在頂部小心加入5ml30％蔗糖，試管以3000rpm離心15分鐘。處于界面帶的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到新的試管中并用1vol.STC稀釋。溶液以3000rpm離心10分鐘。沉積物用STC沖洗兩次，最后溶解于1mlSTC中。計數(shù)原生質(zhì)體，并在轉(zhuǎn)化前還要濃縮。關于轉(zhuǎn)化，將100μl原生質(zhì)體溶液(106-107原生質(zhì)體)與含有5-10μgDNA的10μlDNA溶液混合，并在室溫下溫育25分鐘。然后以200μl，200μl和800μl分批小心加入60％PEG-4000。該混合物在室溫下溫育20分鐘。向混合物中加入3mlSTC，并小心混合。該混合物以3000rpm離心10分鐘。去除上清液，并將原生質(zhì)體增溶于殘留的上清液中，加入3-5ml頂層瓊脂糖，并將原生質(zhì)體快速涂布于選擇板上。葡聚糖酶啟動子和異源基因表達圖13給出在這些研究中使用的表達載體pGPAmy。該表達載體包含與ThermomycesLanuginosusue前體形式的α-淀粉酶基因融合的葡聚糖酶啟動子。使用木聚糖A終止子終止自該啟動子的轉(zhuǎn)錄。該構建物用于共轉(zhuǎn)化實驗，以潮霉素抗性基因為選擇性標記。在甜菜肉質(zhì)部分和小麥糠上生長，用包含表達載體pGPAmy的四種不同的轉(zhuǎn)化物產(chǎn)生α-淀粉酶見圖14。生長48小時后，在培養(yǎng)基中首次測定α-淀粉酶活性。在3天和4天后發(fā)現(xiàn)酶活性峰。葡聚糖酶信號序列和異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)在這些研究中使用表達載體pGPGssArnyHyg。載體pGPGssAmyHyg在圖15中給出。該載體包括與葡聚糖酶信號肽(標記為ss)翻譯融合的成熟α-淀粉酶基因。另外，該載體包含本發(fā)明啟動子(標記為EGl.A)和木聚糖酶A終止子。因此自該載體的轉(zhuǎn)錄是在葡聚糖酶啟動子的控制下，并由木聚糖酶A終止子終止。該構建物特別用來試驗異源蛋白分泌中信號肽的效能。圖16顯示出當在甜菜肉質(zhì)部分/小麥糠中生長時通過利用菌株6M179中的構建誘導α-淀粉酶的結果。這些結果表明該酶活性定域在培養(yǎng)基中，并在生長48小時后首次測定。在第4天發(fā)現(xiàn)酶活性蓄集。蛋白質(zhì)印跡圖17給出SDS-PAGE分離的并印跡到膜上的三個不同轉(zhuǎn)化物的上清液的蛋白質(zhì)的Western印跡。具有T.Lanuginosusα-淀粉酶15個氨基酸殘基的一種合成肽識別來自轉(zhuǎn)化物培養(yǎng)上清液Western印跡上的一條單一譜帶。產(chǎn)生抗體通過給兔注射純化的酶，并根據(jù)NHarboe和AIngild(“免疫，分離免疫球蛋白，估算抗體滴度”(Immunization，IsolationofImmunoglobulins，EstimationofAntibodyTitre)，《定量免疫電泳，方法和應用手冊》(AManualofQuantitativeImmunoelectrophoresis，MethodsandApplications)NHAxelsen等編著，UniversitetsforlagetOslo，l973)和TGCooper(“生物化學工具”(TheToolsofBiochemistry)，JohnWiley&Sons，NewYork，1977)描述的方法從抗血清中分離免疫球蛋白來產(chǎn)生抗本發(fā)明酶的抗體?？偨Y盡管已知黑色曲霉產(chǎn)生能降解葡聚糖的幾種酶，但本發(fā)明提供了一種新的有創(chuàng)造性的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，以及編碼該酶的序列，其終止序列，其信號序列，和這些序列的啟動子。本發(fā)明一個重要的優(yōu)點在于這種酶能高量生產(chǎn)。另外，本發(fā)明啟動子和調(diào)節(jié)序列(例如信號序列和終止子)可以用來表達或者可以用于生物體中GOI的表達，例如在黑色曲霉中表達。本發(fā)明酶用作飼料添加劑是有益處的。另外由于其具有高纖維轉(zhuǎn)換能力，所以其可用于釀酒業(yè)。此外，當使用這種酶時基本上沒有加工問題，特別是用非淀粉類多糖加工時。另外，這種酶有效降解β-葡聚糖，因此其可以有利地用于釀酒業(yè)以降低粘度并且也改善啤酒的可過濾性。這一點是重要的，因為啤酒中大分子量葡聚糖和類似物引起過濾困難，而且給出殘渣，凝膠和混濁。本發(fā)明信號序列對于POI，例如一種異源POI是有用的，從而改善POI的質(zhì)和量。本發(fā)明的其它變化在本發(fā)明范圍內(nèi)對于本發(fā)領域技術人員來說是顯而易見的。序列信息酶序列SEQIDNO1GlnThrMetCysSerGlnTyrAspSerAlaSerSerProProTyrSer151015ValAsnGlnAsnLeuTrpGlyGluTyrGlnGlyThrGlySerGlnCys202530ValTyrValAspLysLeuSerSerSerGlyAlaSerTrpHisThrLys354045TrpThrTrpSerGlyGlyGluGlyThrValLysSerTyrSerAsnSer505560GlyLeuThrPheAspLysLysLeuValSerAspValSerSerIlePro65707580ThrSerValThrTrpSerGlnAspAspThrAsnValGlnAlaAspVal859095SerTyrAspLeuPheThrAlaAlaAsnAlaAspHisAlaThrSerSer100105110GlyAspTyrGluLeuMetIleTrpLeuAlaArgTyrGlySerValGln115120125ProIleGlyLysGlnIleAlaThrAlaThrValGlyGlyLysSerTrp130135140GluValTrpTyrGlyThrSerThrGlnAlaGlyAlaGluGlnLysThr145150155160TyrSerPheValAlaGlySerProIleAsnSerTrpSerGlyAspIle165170175LysAspPhePheAsnTyrLeuThrGlnAsnGlnGlyPheProAlaSer180185190SerGlnHisLeuIleThrLeuGlnPheGlyThrGluProPheThrGly195200205GlyProAlaThrPheThrValAspAsnTrpThrAlaSerValAsn*210215229酶編碼序列SEQIDNO2CAGACGATGTGCTCTCAGTATGACAGTGCCTCGAGCCCCCCATACTCGGTGAACCAGAACCTCTGGGGCGAATACCAGGGCACTGGCAGCCAGTGTGTCTACGTCGACAAGCTTAGCAGCAGTGGTGCCTCATGGCATACCAAATGGACCTGGAGTGGTGGCGAGGGAACAGTGAAAAGCTACTCTAACTCCGGCCTTACGTTTGACAAGAAGCTAGTCAGCGATGTGTCAAGCATTCCCACCTCGGTGACATGGAGCCAGGACGACACCAATGTCCAAGCCGATGTCTCATATGATCTGTTCACCGCGGCGAATGCGGATCATGCCACTTCCAGCGGTGACTATGAGCTTATGATTTGGCTTGCCCGCTACGGCTCAGTCCAGCCTATTGGCAAGCAGATTGCCACGGCCACTGTGGGAGGCAAGTCCTGGGAGGTGTGGTATGGTACCAGCACCCAGGCCGGTGCGGAGCAAAAGACATATAGCTTCGTGGCAGGATCTCCTATCAACTCGTGGAGTGGGGACATTAAGGACTTCTTCAACTATCTCACCCAGAACCAAGGCTTCCCGGCTAGCTCTCAGCATTTGATCACTCTGCAATTTGGAACTGAGCCGTTCACCGGTGGCCCGGCAACCTTCACGGTTGACAACTGGACCGCTAGTGTCAAC啟動子序列SEQIDNO3AATTGAAGCATTTTGATAGGTTTAAGCCTAATCAGGATATTGGATGAGTCGAGTTGCAGA60AGTTGAGGACGGTGGGTGAAATCGGGGGTTTGATAGGTAGGCAATGCAGGGCGGAACGGG120AAGGGTCTAGACAATTTCTTTCTTTTGGACAGCTGGTGCGTTTCACTGAGATTAATAGTA180AGCAAACTACTCGCTCGAAGTCGTAGATGTGCATAATGGATAACTACAGCCAACCGAAAT240CTCCGGGCAGAAGGCCTGGAGGCAGGAGGAAACGTGGATAAGAGAGTAATGTTTGAGTAT300AGATATGTAGGCAAGAAAGGACTGGGAGGAAGGAAGTATCGCAAACAAGACAAGTCACTG360AATAGGAAAGAATGGGGCCATCAGAGAAATGAATCTAAACGGTAACTGCAGATATTACAT420GGAAGAAAATACTATGATCCCTAATTGATATGGTTCCATGGCCCCTGGAGACTTAAACCT480CGTGGTATGATAAACATATGAGTTACATTCTCGGTAAATCCAACATTACTCCCAAGCTCT540GTTGATATTCTCCGATAATTCACCGATAACCAACCAACCTACTCCCGTCTAGATCCAATT600GGTCTATATGCATAATGGATATCGTCAGCACAGGCAGAACCCTTTAATTTATTTCTGGAG660ATCCCGTTCTCCACAATGCTTGGTTGCCGACTGCCACAGACCATCGCTAACTTGAAGCGG720AAAGTGCTCCGATGAAGGGTCTCATTTTGAAACGGAGGATTTACATGTCAATGTTGCAGG780CTGGCGTTGATGATGGCGCAACCTGCTATAGCTAGTTGGCTTACTTCGTCCTGGCTGCCG840TATTGGACACGGAAAGTCGGACAATAATAGTGTTAACAGTAAGCGCCATTGATCAGAGTT900GATGTATTTAAAGCTGCGTCGTCTGCTGCCCCCTCCGTGTTCGTGTCTTATTCCAAACAT960TCAACCTCTATTCCTTTCGAAGTCCTTTAGATCTGCCGTTCCTCTGCTTTATTGCCCAAC1020SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(vi)來源序列(A)生物體黑色曲霉(xi)序列描述SEQIDNO4SerTrpGluValTrpTyrGlyThrSerThrGlnAlaGlyAlaGluGlnLys151015SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQIDNO5ThrTyrSerPheValAlaGlVSerProIle1510SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長度35個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQIDNO6LysLeuValSerAspValSerSerIleProThrSerValThrXaaSer151015GlnAspAsPThrAsnXaaXaaAlaAlaValSerTyrXaaLeuPheThr202530AlaAlaAsn35SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQIDNO7TrpThrTrpSerGlyGlyGluGlyThrValLys1510SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部(xi)序列描述SEQIDNO8LeuSerSerSerGlyAlaSerTrpHisThrLys1510SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQIDNO9GTNCCRTACCANACYTCCCA17SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQIDNO10TGGACNTGGWSNGGNGG17SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長度345堿基對(B)類型核酸(C)鏈股雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“PCR片段”(xi)序列描述SEQIDNO11GTGGAGTGGTGGCGAGGGAACAGTGAAAAGCTACTCTAACTCGGSCCTTACGTTTGACAA60GAAGCTAGTCAGCGATGTGTCAAGCATTCCCACCTCGGTGACATGGAGCCAGGACGACAC120CAATGTCCAAGCCGATGTCTCATATGATCTGTTCACCGCGGCGAATGCGGATCATGCCAC180TTCCAGCGGTGACTATGAGCTTATGATTTGGTATGTGACGTCGTGAACAAGATAGATGGA240GGAGGCTAACGTAACCAGGCTTGCCCGCTACGGCTCAGTCCAGCCTATTGGCAAGCAGAT300TGCCACGGCCACTGTGGGAGGCAAGTCCTGGGAGGTCTGGTACGG.345SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長度2360個堿基對(B)類型核酸(C)鏈股單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體黑色曲霉(B)菌株3M43(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置join(1021..1427，1476..1708，1778..1857)(D)其它信息/product＝“內(nèi)切葡聚糖酶”/gene＝“eglA”(ix)特征(A)名稱/關鍵詞exon(B)位置1021..1427(ix)特征(A)名稱/關鍵詞intron(B)位置1428..1475(ix)特征(A)名稱/關鍵詞exon(B)位置1476..1708(ix)特征(A)名稱/關鍵詞intron(B)位置1709..1777(ix)特征(A)名稱/關鍵詞exon(B)位置1778..1854(ix)特征(A)名稱/關鍵詞sig_peptide(B)位置1021..1068(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat_peptide(B)位置join(1069..1427，1476..1708，1777..1854)(xi)序列描述SEQIDNO12AATTGAAGCATTTTGATAGGTTTAAGCCTAATCAGGATATTGGATGAGTCGAGTTGCAGA60AGTTGAGGACGGTGGGTGAAATCGGGGGTTTGATAGGTAGGCAATGCAGGGCGGAACGGG120AAGGGTCTAGACAATTTCTTTCTTTTGGACAGCTGGTGCGTTTCACTGAGATTAATAGTA180AGCAAACTACTCGCTCGAAGTCGTAGATGTGCATAATGGATAACTACAGCCAACCGAAAT240CTCCGGGCAGAAGGCCTGGAGGCAGGAGGAAACGTGGATAAGAGAGTAATGTTTGAGTAT300AGATATGTAGGCAAGAAAGGACTGGGAGGAAGGAAGTATCGCAAACAAGACAAGTCACTG360AATAGGAAAGAATGGGGCCATCAGAGAAATGAATCTAAACGGTAACTGCAGATATTACAT420GGAAGAAAATACTATGATCCCTAATTGATATGGTTCCATGGCCCCTGGAGACTTAAACCT480CGTGGTATGATAAACATATGAGTTACATTCTCGGTAAATCCAACATTACTCCCAAGCTCT540GTTGATATTCTCCGATAATTCACCGATAACCAACCAACCTACTCCCGTCTAGATCCAATT600GGTCTATATGCATAATGGATATCGTCAGCACAGGCAGAACCCTTTAATTTATTTCTGGAG660ATCCCGTTCTCCACAATGCTTGGTTGCCGACTGCCACAGACCATCGCTAACTTGAAGCGG720AAAGTGCTCCGATGAAGGGTCTCATTTTGAAACGGAGGATTTACATGTCAATGTTGCAGG780CTGGCGTTGATGATGGCGCAACCTGCTATAGCTAGTTGGCTTACTTCGTCCTGGCTGCCG840TATTGGACACGGAAAGTCGGACAATAATAGTGTTAACAGTAAGCGCCATTGATCAGAGTT900GATGTATTTAAAGCTGCGTCGTCTGCTGCCCCCTCCGTGTTCGTGTCTTATTCCAAACAT960TCAACCTCTATTCCTTTCGAAGTCCTTTAGATCTGCCGTTCCTCTGCTTTATTGCCCAAC1020ATGAAGCTCTCCATGACACTTTCCCTGTTTGCGGCCACTGCCATGGGC1068MetLysLeuSerMetThrLeuSerLeuPheAlaAlaThrAlaMetGly-16-15-10-5CAGACGATGTGCTCTCAGTATGACAGTGCCTCGAGCCCCCCATACTCG1116GlnThrMetCysSerGlnTyrAspSerAlaSerSerProProTyrSer151015GTGAACCAGAACCTCTGGGGCGAATACCAGGGCACTGGCAGCCAGTGT1164ValAsnGlnAsnLeuTrpGlyGluTyrGlnGlyThrGlySerGlnCys202530GTCTACGTCGACAAGCTTAGCAGCAGTGGTGCCTCATGGCATACCAAA1212ValTyrValAspLysLeuSerSerSerGlyAlaSerTrpHisThrLys354045TGGACCTGGAGTGGTGGCGAGGGAACAGTGAAAAGCTACTCTAACTCC1260TrpThrTrpSerGlyGlyGluGlyThrValLysSerTyrSerAsnSer505560GGCCTTACGTTTGACAAGAAGCTAGTCAGCGATGTGTCAAGCATTCCC1308GlyLeuThrPheAspLysLysLeuValSerAspValSerSerIlePro65707580ACCTCGGTGACATGGAGCCAGGACGACACCAATGTCCAAGCCGATGTC1356ThrSerValThrTrpSerGlnAspAspThrAsnValGlnAlaAspVal859095TCATATGATCTGTTCACCGCGGCGAATGCGGATCATGCCACTTCCAGC1404SerTyrAspLeuPheThrAlaAlaAsnAlaAspHisAlaThrSerSer100105110GGTGACTATGAGCTTATGATTTGGTATGTGACGTCGTGAACAA1447GlyAspTyrGluLeuMetIleTrp115120GATAGATGGAGGAGGCTAACGTAACCAGGCTTGCCCGCTACGGCTCAGTCCAG1500LeuAlaArgTyrGlySerValGln125CCTATTGGCAAGCAGATTGCCACGGCCACTGTGGGAGGCAAGTCCTGG1548ProIleGlyLysGlnIleAlaThrAlaThrValGlyGlyLysSerTrp130135140GAGGTGTGGTATGGTACCAGCACCCAGGCCGGTGCGGAGCAAAAGACA1596GluValTrpTyrGlyThrSerThrGlnAlaGlyAlaGluGlnLysThr145150155160TATAGCTTCGTGGCAGGATCTCCTATCAACTCGTGGAGTGGGGACATT1644TyrSerPheValAlaGlySerProIleAsnSerTrpSerGlyAspIle165170175AAGGACTTCTTCAACTATCTCACCCAGAACCAAGGCTTCCCGGCTAGC1692LysAspPhePheAsnTyrLeuThrGlnAsnGlnGlyPheProAlaSer180185190TCTCAGCATTTGATCAGTGAGTTTTCCTAATTCTACTAGCGAGCGC1738SerGlnHisLeuIle195CGGCAGTTGAAATTGGTCACTAACAGAAGTGATGATTAGCTCTGCAATTTGGA1791ThrLeuGlnPheGly200ACTGAGCCGTTCACCGGTGGCCCGGCAACCTTCACGGTTGACAACTGG1839ThrGluProPheThrGlyGlyProAlaThrPheThrValAspAsnTrp205210215ACCGCTAGTGTCAACTAAAAGGCTTTAGGCGCGGCTGGGGTAAATAAC1887ThrAlaSerValAsn*220AGCTTGTTTCTTCGTTCTAGAACGTCGGGCGTGTAAGAGCTAGAAATCCACCCACTCTGA1947TTGGAAACACTCATTCAAGATCGGTACTCCTCTTCAGCCGAGAAAGGCACAGATAGTGTA2007TCGAATCCAATCAAATCTATTTGGTGTTGCTTAAATTCCGAGCCAGTCCTTTCCTTGAAA2067GGTAATCCACCCGTAGCGATTGATCATTAACAGATCCGAGTGGTGCTAGGTTAAATTGCT2127AACCCGATCCCGCTCCAATTAGCTAGCGCATCCGGCAGATTCAAACTTGACAGTGGGCCG2187GGCATTACCTGAACCTGTAGAAGGAACAGACCCTTGTCTAGAAATCTCTAAATAGTATAA2247GCCGAAACTTGCCCCGGACGTACCCTAAGCTAAGATTGCTCTTCGCATTCCCAGGGGGGT2307GAACTCTCTAAAGAGGGAGCATCGCTTGCCGATGTCTGGTTCGGGGATCATGA2360(2)SEQIDNO13的信息終止子序列AAGGCTTTAGGCGCGGCTGGGGTAAATAACAGCTTGTTTCTTCGTTCTAG50AACGTCGGGCGTGTAAGAGCTAGAAATCCACCCACTCTGATTGGAAACAC100TCATTCAAGATCGGTACTCCTCTTCAGCCGAGAAAGGCACAGATAGTGTA150TCGAATCCAATCAAATCTATTTGGTGTTGCTTAAATTCCGAGCCAGTCCT200TTCCTTGAAAGGTAATCCACCCGTAGCGATTGATCATTAACAGATCCGAG250TGGTGCTAGGTTAAATTGCTAACCCGATCCCGCTCCAATTAGCTAGCGCA300TCCGGCAGATTCAAACTTGACAGTGGGCCGGGCATTACCTGAACCTGTAG350AAGGAACAGACCCTTGTCTAGAAATCTCTAAATAGTATAAGCCGAAACTT400GCCCCGGACGTACCCTAAGCTAAGATTGCTCTTCGCATTCCCAGGGGGGT450GAACTCTCTAAAGAGGGAGCATCGCTTGCCGATGTCTGGTTCGGGGATCA500TGA5037(2)SEQIDNO14的信息信號序列ATGAAGCTCTCCATGACACTTTCCCTGTTTGCGGCCACTGCCATGGGC48(2)SEQIDNO15的信息信號序列MetLysLeuSerMetThrLeuSerLeuPheAlaAlaThrAlaMetGly1權利要求1.一種從曲霉屬獲得的酶，其中該酶具有下面的特征a.MW是24235D±50Db.pI大約是4c.葡聚糖酶活性其中所述葡聚糖酶活性是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶活性。2.一種具有SEQ.I.D.No.1所示序列，其變體，同系物或片段的酶。3.一種由SEQ.I.D.No.2所示核苷酸序列或其變體，同系物或片段，或者與其互補的序列編碼的酶。4.編碼權利要求1的酶的核苷酸序列。5.編碼權利要求2的酶的核苷酸序列。6.具有SEQ.I.D.No.2所示序列，其變體，同系物或片段，或者其互補序列的核苷酸序列。7.與一啟動子操作連接的任一權利要求4至6的核苷酸序列。8.權利要求7的核苷酸序列，其中啟動子是具有如SEQ.ID.No.3所示序列或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的啟動子。9.具有SEQ.I.D.No.3所示序列或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的啟動子。10.與GOI操作連接的權利要求9的啟動子。11.權利要求10的啟動子，其中啟動子GOI操作連接，其中GOI包含任一項權利要求4-6的核苷酸序列。12.具有SEQ.I.D.No.13所示核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的終止子。13.具有SEQ.ID.No.14所示核苷酸序列，或其變體，同系物或片段，或者其互補序列的信號序列。14.包含或表達權利要求1至13之任一的本發(fā)明的構建物。15.包含或表達權利要求1至14之任一的本發(fā)明的載體。16.包含或表達權利要求1至15之任一的本發(fā)明的質(zhì)粒。17.包含或表達權利要求1至16之任一的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體。18.權利要求17的轉(zhuǎn)基因生物體，其中生物體是一種真菌。19.權利要求17的轉(zhuǎn)基因生物體，其中生物體是一種絲狀真菌，優(yōu)選曲霉屬。20.權利要求17的轉(zhuǎn)基因生物體，其中生物體是一種植物。21.權利要求17的轉(zhuǎn)基因生物體，其中所述生物體是一種酵母。22.制備權利要求1至3之任一的酶的方法，包括表達權利要求4至8之任一的核苷酸序列。23.權利要求22的方法，其中所述酶具有SEQ.I.D.No.1所示序列，或者是其變體，同系物或片段，所述核苷酸片段具有SEQI.D.No2所示序列，或者是其變體，同系物或片段或者是其互補序列。24.權利要求22或23的方法，其中通過用權利要求9的啟動子控制(部分或全部)表達。25.一種通過使用一啟動子表達GOI的方法，其中啟動子是權利要求9的啟動子。26.權利要求1至3之任一的酶或通過權利要求22至25之任一的方法制備的酶降解葡聚糖的用途。27.質(zhì)粒NCIMB40704，或從中獲得的核苷酸序列，其用來表達葡聚糖酶，或控制其表達，或控制另一GOI的表達。28.一種具有降解β-1，4-葡糖苷鍵能力的葡聚糖酶，其與抗純化的具有SEQ.I.D.No.1所示序列的葡聚糖酶抗體起免疫反應。29.具有SEQ.I.D.No.15所示序列或其變體，同系物或其片段的信號序列。全文摘要本發(fā)明公開了一種葡聚糖酶。另外公開了編碼這種酶的核苷酸序列和控制這種酶表達的啟動子。文檔編號A01H5/00GK1184507SQ96193960公開日1998年6月10日申請日期1996年3月11日優(yōu)先權日1995年3月17日發(fā)明者S·M·馬德里,P·拉斯慕森,A·巴魯赫申請人:丹尼斯科有限公司