專利名稱：米曲霉hg76及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及米曲霉，具體涉及米曲霉(Aspergillus oryZae)HG76及其在生產釀造 醬油中的應用。
背景技術：
醬油屬于傳統發(fā)酵調味食品，菌種是發(fā)酵的基礎，其性能對醬油產量和質量影響 甚大。目前，我國醬油釀造企業(yè)90%以上使用的是米曲霉(Aspergillus oryzae)滬釀 3. 042，該菌種具有生長快、產孢子多、酶系豐富、中性蛋白酶活性高等優(yōu)點，是醬油釀造的 主要菌種。然而，在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的PH值隨著醬油發(fā)酵時間的延長逐 漸降低，中性和堿性蛋白酶活力迅速下降，而酸性蛋白酶在米曲霉整個酶系中的表達量相 對偏低。這一現象導致醬油的原料蛋白利用率和氨基酸轉化率偏低，產品風味較弱。因此， 米曲霉酸性蛋白酶活力偏低是提高我國高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油行業(yè)原料利用率和產品質量的 關鍵因素。由于傳統的誘變育種的飽和效應和基因工程篩選標記在食品安全方面的擔憂，米 曲霉菌種改良必須考慮采用其他途徑。在細胞雜交基礎上發(fā)展起來的原生質體融合技術具 有簡便、高效和安全的特點，通過多輪重組可將親本的優(yōu)良性狀進行組合，輔助合理的篩選 程序，可快速獲得目標菌株。針對米曲霉酸性蛋白酶活力偏低的缺陷，將黑曲霉的酸性蛋白 酶基因通過基因組重組的途徑轉移至米曲霉基因組，并高效表達，可獲得了高活力酸性蛋 白酶曲霉融合子菌株。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有技術存在的上述缺陷，提供米曲霉HG76及其應用。本發(fā)明所提供的米曲霉菌菌株是(Aspergillus oryzae)HG76，該菌株已于2010 年06月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號為CGMCC No.3916。米曲霉(Aspergillus oryzae)HG76 CGMCC No. 3916的菌落呈圓形，菌落形態(tài)和顏 色偏似A. oryzae HN3042,呈圓形，質地疏松，初期菌落中間白色，四周邊緣呈透明射線狀。 菌落剛形成時，僅中間一點呈白色，以后隨菌落長大，白色范圍也逐漸擴大。隨菌落長大， 菌落的中心點先呈黃綠色，然后黃綠色向四周擴展。成熟菌落為黃綠色，有時為淡黃綠色， HG76菌絲分枝較粗，分枝較少，孢子囊松散。該菌株具有較高水平的蛋白酶活力，特別是酸 性蛋白酶活力，為1605u/g (相比于出發(fā)菌A. oryzae HN3042提高了 85. 12%),且其中性蛋 白酶活仍有3303u/g(相比于出發(fā)菌A. oryzae HN3042降低了 0. 09% )。本發(fā)明將米曲霉和黑曲霉進行原生質體融合獲得的優(yōu)質米曲霉菌。與現有技術 相比具有如下優(yōu)點和效果本發(fā)明提供了一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)HG76CGMCC No. 3916。試產實驗結果證明該菌株遺傳穩(wěn)定性好，所制備的成曲酸性蛋白酶和中性蛋白酶 活力高，發(fā)酵制備醬油產量高、能耗低。本發(fā)明的菌株將在釀造醬油生產中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。蛋白酶酶活的測定蛋白酶活力測定按Folin-酚法，具體操作為(1)標準曲線的制作稱取適量L-酪氨酸，105°C烘干至恒重，溶于0. lmol/L NaCl 水溶液，配成lmg/mL的標準酪氨酸母液。制備系列稀釋液，其濃度分別為20 μ g/mL、40 μ g/ mL、60 μ g/mL、80 μ g/mL和100 μ g/mL。將表中所加溶液量同時縮小10倍，按標準程序進行操作。(2)樣品的酶活測定取種曲適當稀釋后的酶液100yL，40°C水浴中預熱2min，再 加入同樣預熱的酪蛋白溶液100 μ L，精確保溫lOmin，然后立即加入200 μ L 0. 4mol/L三氯 乙酸終止反應，繼續(xù)置于水浴中保溫20min，殘余蛋白質12000rpm離心lOmin，取100 μ L上 清按標曲操作程序，測定其中酪氨酸含量，以40°C下每分鐘水解酪蛋白產生1 μ g酪氨酸定 義為1個蛋白酶活力單位。酸性蛋白酶的測定為PH 3. 6的醋酸-醋酸鈉緩沖液，中性蛋白 酶的測定為PH 7. O的磷酸緩沖液。酶活計算公式為
TT AxA^NU =---(1)
IOxGx(I-W)式中，A為由樣品測得OD值，查標準曲線得相當的酪氨酸微克數；4為400 μ L反應 液取出100 μ L測定(S卩4倍)；N為酶液稀釋的倍數；10為反應時間IOmin ；G為樣品重量 (g) ；W為樣品水分百分含量。


圖1為米曲霉HG76和米曲霉3042對醬油發(fā)酵液中總氮的影響2為米曲霉HG76和米曲霉3042對醬油發(fā)酵液中氨態(tài)氮的影響圖。
具體實施例方式以下結合附圖對本發(fā)明的具體實施作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不 限于此。融合株HG76 CGMCC No. 3916 的制備可用米曲霉菌培養(yǎng)基及如下培養(yǎng)方法對本發(fā)明的米曲霉菌(Aspergi 1 lusoryzae) HG76C GMCC No. 3916 進行培養(yǎng)。以無菌操作將500 μ L濃度為IO7個/mL的曲霉(米曲霉3042和黑曲霉CICC2377) 孢子懸浮液接種于50mL MPY液體培養(yǎng)基中，30 V /IOOrpm振蕩培養(yǎng)12_24h，得菌絲 球。將菌絲球經四層無菌擦鏡紙抽濾，無菌水漂洗兩次，再用IOmL高滲緩沖液離心洗滌 兩次(5000rpmX5min)，IOmL高滲液懸浮后加入IOOyL β -巰基乙醇，混合均勻后于 300C /IOOrpm條件下溫育30min，得處理后米曲霉3042菌絲體和黑曲霉CICC2377菌絲體。取處理后的菌絲體按1.5g/10mL的量加入溶壁酶和蝸牛酶的復合酶液中，于 300C /80rpm條件下進行酶解3h。將酶解液通過兩層300目尼龍網過濾，濾液于2000rpm離 心lOmin，高滲液緩沖液離心洗滌兩次，得米曲霉3042原生質體懸浮液和黑曲霉CICC2377 原生質體懸浮液。取A. oryzae HN3042原生質體懸浮液(5. OX IO6個/mL)4mL移入直徑5. Ocm的培養(yǎng)皿中。液面距紫光燈垂直距離13cm，紫光燈功率15W，打開紫光燈。15min后取100 μ L照 射后的原生質體懸液于900 μ L高滲液中，混勻后分別取100 μ L于5mL高滲和普通軟瓊脂 (0.5%,45°C)中，手掌拍擊使之混勻后倒高滲和普通再生平板。30°C靜置培養(yǎng)48h。取A.niger CICC2377原生質體懸浮液(3. OX IO6個/mL) 1. OmL于2mLEP管中，65°C 恒溫水浴，保溫15min后立即放入冰上冷卻。取100 μ L熱處理后的原生質體懸液于900 μ L 高滲液中，混勻后分別取100 μ L于5mL高滲和普通軟瓊脂培養(yǎng)基中(0. 5%瓊脂，45°C )，手 掌拍擊使之混勻后倒高滲和普通再生平板。30°C靜置培養(yǎng)48h。將非對稱滅活后的等量雙親原生質體混合，用電擊液調整至IO6個/mL的濃度，然 后以微量移液器吸取500 μ L原生質體懸浮液置于電融合儀槽中(3mm間距)，將融合槽放置 于冰上，于倒置顯微鏡下調整預融合電場強度和時間至原生質體項鏈狀排列。然后設置不 同的融合參數進行電融合，吸取100 μ L融合液于5mL冷卻至45°C的軟瓊脂中，手掌拍擊使 之混合均勻后涂于高滲MPY固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)至菌落出現。以酸性蛋白酶活力和中 信蛋白酶活力為指標，對所得菌落進行篩選，得融合株HG76 CGMCC No. 3916。融合株HG76 CGMCC No. 3916與親本在菌落和菌絲形態(tài)差異性融合株HG76與親本米曲霉3042在菌絲粗細、分枝度、光滑性，以及孢子囊形態(tài)方 面都存在著較大的差異。親本米曲霉3042菌絲分枝細而密，孢子囊松散；黑曲霉菌絲粗而 光滑，分枝少，孢子囊光滑緊湊；而融合株HG76在菌絲分枝度上有的傾向于米曲霉，但分枝 較米曲霉粗些，孢子囊形態(tài)均傾向于米曲霉。融合株HG76 CGMCC No. 3916與親本在酸性和中性蛋白酶活力上的差異性分別將融合株HG76 CGMCC No. 3916與親本米曲霉3042按IO5個孢子/g種曲的 濃度分別接種于滅菌好的種曲培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)72h，每隔12 13h搖瓶一次。培養(yǎng)完畢 后將種曲壓碎，以0. 2mol/L NaCl的磷酸緩沖溶液按1 5的料液比，于40°C水浴下IOOrpm 提取lh，測定酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力，結果見表1 (米曲霉HG76的酸性蛋白酶的遺傳 穩(wěn)定性)和表2 (米曲霉HG76的中性蛋白酶的遺傳穩(wěn)定性)。HG76 CGMCC No. 3916對醬油發(fā)酵體系總氮和氨基氮的影響將浸泡好的大豆放入高壓滅菌鍋中進行蒸煮，排氣3min，待溫度上升到120°C時 開始計時，蒸煮20min后立刻放蒸汽降壓，取出大豆。大豆降溫至50°C左右時與面粉進行混 合，分別接種HG76和米曲霉。大曲培養(yǎng)條件如下濕度95%，出曲前4h降濕度到70% ；溫度28°C ；培養(yǎng)時間 為44h;曲料培養(yǎng)至16h和24h時翻曲，得大曲。將大曲與18%的鹽水以1 2. 2混合后， 發(fā)酵60天。由圖1可見，整個發(fā)酵過程中HG76發(fā)酵液的總氮要大于米曲霉3042，在發(fā)酵 至30天時，HG76發(fā)酵液中總氮含量可達1. 07g/100mL,比米曲霉3042的0. 99g/100mL高出 約8. 1 %。由圖2可見，整個發(fā)酵過程中HG76發(fā)酵液的氨態(tài)氮要大于米曲霉3042，在發(fā)酵 至30天時，HG76發(fā)酵液中總氮含量可達0. 62g/100mL,比A. oryzae HN3042的0. 58g/100mL 高出6. 9%。表 權利要求
米曲霉HG76，該米曲霉(Aspergillus oryzae)于2010年06月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3916。
2.權利要求1所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)HG76 CGMCC No. 3916在生產釀造 醬油中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了米曲霉HG76及其應用，米曲霉HG76于2010年06月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3916試產實驗結果證明該菌株生長快，遺傳穩(wěn)定性好，所制備的成曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力高，發(fā)酵制備醬油產量高。本發(fā)明的菌株將在釀造醬油生產中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N1/14GK101942396SQ201010276159
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月6日 優(yōu)先權日2010年9月6日
發(fā)明者崔春, 徐德峰, 趙海鋒, 趙謀明 申請人:華南理工大學